꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

요약

우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.

초록

꼬마 선 충 (C. 선 충) 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 및 염색체 역학을 포함 하 여 몇몇 생물학으로 중요 한 과정을 공부 하는 데 사용 됩니다. 동안에 생식은 우수한 모델, 분석은 종종 2 시간 및 3 차원 분석에 필요한 노동 차원. 이러한 연구에 주요 정보는 핵 및 단백질 분포는 생식 내 번호/위치. 여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 전산 접근을 사용 하 여 수는 생식의 각 지역에서 핵의 위치를 결정 하는 생식의 자동화 된 분석을 수행 하는 방법을 제시. 우리의 방법은 또한 다른 유전 배경의 단백질 식의 3 차원 검사를 가능 하 게 생식 단백질 분포를 분석 합니다. 또한, 우리의 연구는 특정 공간 발달 요구를 수용할 수 있는 생식의 고유 영역에서 cytoskeletal 건축에 변화를 보여줍니다. 마지막으로, 우리의 메서드는 각 생식의 spermatheca에 정자의 자동화 된 계산 수 있습니다. 함께 찍은, 우리의 메서드는 C. 선 충 생식의 신속 하 고 재현성 phenotypic 분석을 수 있습니다.

서론

포유류와 경로 신호의 보존은 C. 선 충 여러 생물 학적 과정^1,2를 공부 하는 우수한 모델. 우리의 실험실 사용 하 여 선 충 C. 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 유전자 발현 연구. 생식은 3 차원 구조, 많은 학문은 2 차원 3 차원 분석의 시간과 노동 집약적인 특성상. 2 차원 분석 vivo에서 이벤트는 생식에 허위로 수 있습니다 매우 높습니다. C. 선 충 성인 남녀 추 니 두 생식 팔, 각각의 집 체세포 원심 끝 셀 (DTC)는 미 분화 상태^3,4원심 세균 세포를 유지 하는. 이 세균 세포 차별화 영향력, 탈출 DTC에서 이동 하는 시작 되 고 해지고 oocytes 정자로는 생식의 근 위 끝에 도달. 이 과정 동안, 생식 세포 핵 유사 분열, 감수 분열^5,6에 전환 하기 전에 받아야. 정자 생산 후 oocytes는 성인 기 동안 생산 개발의 애벌레 단계 4 (L4)에 의해 완료 된다. 정자는 어디 그들은 비 옥 하 게 배아를 생성 하기 위해 oocytes spermatheca에 저장 됩니다.

핵의 수, apoptotic 이벤트, 염색체 역학, 고 단백질 식 및 지역화^{7 수에 변화 결과로 C. 선 충 에서 생식 개발에 영향을 미칠 수 있는 여러 유전과 환경 요인이 있다 ,,89,,1011}. 이러한 이벤트의 분석 핵 형태와 분포에 따라 차별화의 각 단계의 식별을 해야 합니다. 큰 샘플 크기와 수동으로 이러한 매개 변수를 정확 하 게 분석 이며 노동 집약적인 시간이 걸리는. 이러한 단점을 우회 하 고 분석의 일관성 있도록, 우리 세 핵, 핵 배포, 단백질 표정, 선 충 C. 생식의 3 차원 검사를 위한 자동화 된 방법을 개발 및 cytoskeletal 구조입니다. 3 차원 렌더링 confocal 현미경 검사 법을 결합 하 여 세균 세포 분화의 단계 각의 식별에 대 한 크기와 모양 매개 변수를 생성 했습니다. 또한,이 메서드는 생식 세포 핵과 정자의 세 플러스 각 oocyte에서 염색체 수의 득점 수 있습니다.

1 개의 중요 한 구조는 생식 생식 구획, 에이즈 세포질 스트리밍 및 생식 핵¹²보호 안정성을 제공 하는 골격 이다. 전산 렌더링을 사용 하 여, 우리는 생식 세포 골격의 3 차원 재구성을 수행 하 고 뚜렷한 cytoskeletal는 생식 기능을 식별. 여기, 우리가 어떻게 계산 분석 confocal 이미징 수 있도록 포괄적인 분석 C. 선 충 생식의 결합을 설명 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

C. 선 충 의 생식 (그림 1)의 3 차원 분석을 위한 빠른 방법을 제안 한다. 3 차원 분석을 사용 하 여, 그것은 셀 (그림 2), 생식 세포 골격 ( 의 개조의 자동화 (그림 2 및 그림 3), 생식 핵의 3 차원 분포 계산 공부 가능 그림 3), 단백질 (그림 4), 그리고 점수는 spermatheca에 정자와 oocytes (그림 5)에서 염색체의 수의. 메서드는 생식의 쉽고 정확한 정량화를 가능 하 게 뿐만 아니라 생리 적으로 관련 된 고기를 식별.

프로토콜

1. 준비 및 웜 농업

참고: 모든 제품 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

1. OP50 대장균 문화: Lysogeny 국물 (파운드) (1% tryptone 0.5% 효 모, 0.5 %NaCl, pH 7.0) 항생제 없이 37 ° C에서 하룻밤에 OP50 박테리아 문화.
2. 선 충 류 성장 미디어 (NGM) 판 (1.5 g의 NaCl, 한 천, 펩, 1 M CaCl₂, 에탄올, 1 M MgSO₄ 의 1 mL에에서 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL의 1 mL의 1.25 g의 8.5 g OP50 박테리아의 400 µ L 씨 고 1 M KPO₄ 버퍼의 25 mL)와 공기 건조 48 h에 대 한 박테리아.
3. 시드 NGM 접시에 벌레를 선택 하 고 15 ° C 또는 20 ° C에서 품 어
   1. 성인 자웅 동체 생식의 분석을 위해 잘 먹이 L4 벌레 세균 잔디를 선택 하 고 20 ° c.에서 밤새 품 어
   2. 광고에 나온 것에 정자 수를 점수, 12 h 20 ° C에서 L4 벌레 벌레 L4/성인 탈피에 도달할 때까지 품 어. 동기화 하려면 L4 단계에 벌레, 표 백제 솔루션 (1 M NaOH와 1:1 비율에서 표 백제) 계란의 많은 성인 벌레를 수확 하 여 계란을 준비 합니다. 계란 해치 고 L4 동물 실험에 대 한 선택 수 있습니다.
4. 슬라이드에서 폴 리-L-리 신 솔루션의 25 µ L를 놓고 피 펫 팁을 사용 하 여 솔루션 잘, 확산 테 플 론 현미경 슬라이드를 준비 합니다. 초과 폴 리-L-리 신 종이 타월로 제거 후 건조 한 공기를 품 어 15-20 분 동안 65 ° C에서 슬라이드 슬라이드 수 있습니다.

2. 생식 해 부와 얼룩^6,13

1. 10 µ L 22 × 22mm coverslip에 0.01 %tetramisole (마 취)의 자리 고 그것으로 한-하루 오래 된 성인 벌레를 선택 합니다.
2. (5 mL) 주사기 및 바늘 (24 "x 1")를 사용 하 여 진정 된다 그것으로 꼬리에 벌레를 해 부하 고는 생식 손상 되지 않은 확인 합니다.
   주: 해 부 웜은 웜 및 웜 움직임에 부정적인 압력은 생식의 방출 원조를 마비 완전히 된다 전에 밖으로 실행 되어야 한다. 정자, 득점을 위한 해야 합니다 주의 spermatheca 손상 않기로 바늘에 의해 해 부 동안. spermatheca 후 절 개 포인트를 제외 하 고 바늘으로는 생식을 만지지 마십시오. 생식 구획에 휴식 또는 어떤 방전은 생식에서 관찰, 경우는 생식 분석을 위해 사용할 수 없습니다 한다.
3. 폴 리-L-리 신 코팅된 슬라이드, 슬라이드에 해 부 생식 유지에 거꾸로 coverslip를 놓습니다.
4. 1 분 빠르게 바늘을 사용 하 여 슬라이드에 germlines와 함께 하는 coverslip 제거 위해 액체 질소에 coverslip, 다음 장소 슬라이드의 모서리에 종이 타워를 배치 하 여는 coverslip에서 과잉 액체를 제거 합니다.
5. 슬라이드는 챔버에 30-60 s-20 ° C 메탄올으로 전송 다음 갓된 고정 솔루션 (버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 포함 0.08 M HEPES pH 6.9, 1.6 m m MgSO₄, 0.8 m m 에틸렌 글리콜-bis(beta-aminoethyl x 1에서에서 30 분 동안 품 어 에테르)-N, N, N', N'-tetraacetic (EGTA), 산과 3.7 %paraformaldehyde) 실내 온도에.
6. 1 x PBS, pH 7.4 포함 된 챔버에 배치 하 여 슬라이드를 씻어 0.1 %10 분에 대 한 트윈-20이 단계를 반복이 한 번.
7. 차단 솔루션 차단 30 µ L로 germlines (염소 혈 청의 1700 µ L에서 염소 혈 청의 900 µ L을 추가 하 여 준비의 30 %h 조₂O를 증 류와 10 x PBS의 300 µ L) 30 분 동안 실내 온도에 플라스틱 상자에 젖은 종이 수건을 배치 하 여 준비 하는 습 한 실에.
8. REC-8 항 체 솔루션 각 샘플 비율 1:300에 30% 염소 혈 청에서 준비의 50 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에서 밤새 품 어
9. 슬라이드를 씻어 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 단계를 한 번 반복 하 고 슬라이드의 모서리에 종이 타월을 배치 하 여 과잉 액체를 제거.
10. 30% 정상 염소 혈 청에서 녹색 fluorophore (488 nm 방출 파장) 활용된 2 차 항 체 (1:1000), phalloidin (말라 얼룩, 1:4000), 및 (DNA 얼룩, 1:4000) DAPI를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다.
11. 슬라이드에 이차 항 체 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.
12. 실 온에서 1 h에 품 어.
13. 슬라이드를 씻어 두 번 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 초과 액체 닦아.
14. 고정 슬라이드에 시 약 30 µ L을 추가 하 고 1.5 µ m coverslip x 12 m m² 위에 놓고 하룻밤 4 ° C에서 슬라이드를 건조.

3. confocal 현미경 검사 법

1. Confocal 현미경, 레이저, 공명 스캐너 및 confocal 현미경 소프트웨어 설정. 63 X 목표 위에 슬라이드 홀더에 얼룩진된 germlines와 슬라이드를 놓습니다.
2. 생식, 포커스는 생식 상단 찾아서 confocal 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 표시 합니다. 비슷하게는 생식의 하단에 집중 하 고 총 생식 두께 설정 표시.
3. 0.5 µ m. 마크 완전 한 생식 그리고 시작 인수까지 각 슬라이스의 두께 정의 하 여 전체 생식 이미지. 각 슬라이스 8 번 스캔 하 고 이미지 품질을 개선 하기 위해 값을 평균. 공명 스캐너 이미징 동안 표백 방지 하려면 빠른 검색 허용 됩니다. 만약 현미경 공명 스캐너, 표백을 피하기 위해 4 검사의 수를 줄일 수는 없습니다.

4. 게시물 이미징 분석 핵의 수와 분포

참고: 소프트웨어 도구와 사용 하는 버튼의 스크린샷을 위한 보충 그림 1 을 참조 하십시오.

1. 8.4.1 Imaris 또는 소프트웨어의 이미지를 가져옵니다.
2. 각 지역에서 핵 형태를 식별 하 여 mitotic 지역, 전이 영역, meiotic 지역, oocyte 지역, 그리고 spermatheca는 생식의 정의.
3. 소프트웨어의 표면 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 관심 영역을 선택 합니다.
4. 자동 표면 생성 마법사를 취소 하 고 수동으로 3 차원 스택에서 이미지의 첫 번째 및 마지막 조각에서 관심 영역을 그립니다.
5. 만들기 화면을 클릭 합니다.
   참고: 소프트웨어를 자동으로 첫 번째 및 마지막 스택 간의 스택을 개발할 것입니다.
6. DAPI 제외 하 고 모든 채널 마스크 채널 버튼 (보충 그림 1B-C)를 클릭 하 여 마스크.
7. 자리 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 핵 크기 매개 변수를 정의 합니다. Mitotic 지역에 대 한 Z 직경 정의 하면서 2 µ m의 XY 직경을 정의 합니다. 전환 영역에 대 한로 1.5 µ m. (보충 그림 1D) 2 µ m의 XY 직경 및 Z 직경을 정의 합니다.
   참고: 확대 및 현미경의 사양에 따라 직경을 해결 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 사용 하는 목적은 63 X 되었고 추가 이미징 동안 1.70 배 확대를 제공. 목표 변경, 예를 들어 40 X, 직경 적절 하 게 변경 한다. 올바른 매개 변수를 설정 하려면 wildtype germlines와 문제 해결을 수행 합니다. 야생 유형 생식 팔의 mitotic 지역은 약 250 핵 있다. 지름이이 값을 달성 하도록 수정 한다. 적어도 15 germlines를 사용 하 여 직경에 대 한 최적의 값을 확인 하. 이와 비슷한 방식은 전환 영역 (150-170 핵)와 meiotic 지역 (600-700 핵) 보정을 위해 사용 되어야 한다.
8. 최소 임계값 (보충 그림 1E)를 정의 하 여 관광 명소의 검색을 제한 합니다. DAPI를 사용 하 여 첫 번째 자리는 생식 외부 표시 될 때까지 최소 3 차원 렌더링 임계값을 늘려 최소 임계값을 설정 하는 야생 타입 germlines 스테인드.
9. 이미지를 저장 하 고 소프트웨어에 의해 자동으로 생성 하는 테이블에서 핵의 수를 얻을. TIF 파일로 이미지를 내보냅니다.

5. 게시물 점수 정자 염색체 수에 대 한 분석 영상

1. 관심 영역으로는 spermatheca를 선택 하 여 3 차원 렌더링을 수행 합니다. 각 정자를 감지, 0.75-사이 반점 직경 정의 1.0 µ m x 및 Y 축, Z 지름은 정의 되지 않은 유지 하는 동안. 관광 명소 기능 버튼을 사용 하 여 보충 그림 1에서 보듯이.
2. 백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여.
   참고: Imaris 소프트웨어 추천 강도 높은 포인트 먼저, 따라서 배경 효과 최소한의 상당한 차이가 관심 영역 및 배경으로. 두 번째 방법은 이다 배경에 대 한 배경 보정을 수동으로 정의 적절 한 값을 지정할 수 있습니다. 수동 배경 교정 독립적인 샘플의 강도 비교를 요구 하는 경우 적절 한 될 것입니다.
3. Spermatheca (보충 그림 1E)에서 모든 DAPI 스테인드 정자를 검출 하기 위하여 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.
4. 염색체, 계산에 대 한 정의 자리 직경 < x 0.75 µ m 및 Y-축 3 차원 모델을 개발 하기 전에.
5. 이미지를 저장 하 고 TIF 파일로 내보내기.

6. 포스트는 생식의 Cytoskeletal 재건에 대 한 분석 영상

1. 생식에 관심 영역을 식별 하 고 phalloidin 제외 하 고 모든 채널을 채널 마스크 버튼을 클릭 하 여 마스크.
2. 표면 기능 버튼 (보충 그림 1)를 사용 하 여 0.25 µ m의 표면 세부 정보를 정의 합니다.
   참고:이 모든 0.25 µ m으로 3 차원 모델 렌더링 됩니다 의미 합니다. 표면 디테일 3 차원 표면 모델 마다 0.25 µ m에 대 한 생성 하는 것입니다 어디는 생식의 모든 지역에 대 한 일정 수 있습니다. 그러나, oocyte 지역에 대 한 표면 세부 수 수 증가 0.35-0.5 µ m이이 지역에서 잘 정의 된 걸 섬유의 존재 때문.
3. 백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여.
4. 분석 (보충 그림 1E)을 필요로 하는 구조에 따라 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.
5. 개발 된 3 차원 이미지를 저장 하 고는 TIF 파일로 내보내기.

결과

그림 1 3 차원 생식 분석에 필요한 시간을 나타냅니다. 20 ° C에서 incubated L4 광고에 나온 것 germlines를 분리 해 부 되었고 DAPI, phalloidin, 및 생식 단백질에 대 한 항 체와 스테인드. Germlines는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 얼룩 그리고 confocal 현미경 검사 법 완전 한 생식 필요 수 핵의 위치를 계산, 단백질 분포를 식별, 분석 cytoskeletal 구조와 점수를 10-15 분 약 24 h. 전산 분석 필요는 정자의 수입니다. 완전 한 수동 분석 생식 당 2 시간 이상 필요 연산자 영향에 따라, 따라서, 자동화 된 우리의 높은 처리량 방법 분석 시간 단축 및 재현성을 향상 시킵니다.

자동 핵 생식 팔 집 약 1000-12...

토론

이 프로토콜의 목표는 정확도 개선 하 고 생식 분석에 필요한 시간을 줄일 것입니다. 준비 후에 표준 해 부 germlines의, 생식 핵의 3 차원 모델 렌더링 계산에 의해 준비 된다. 공간에 생식 핵 분포의 관찰 하면서 3 차원 렌더링은 생식의 특정 지역에서 핵의 수를 계산 합니다. 우리의 방법의 중요 한 측면 핵의 크기와 모양 매개 변수의 정확한 정의 이다. 이 얼룩이 지 고 사용 확대의 선명도에 따라 이미지를. 우리는 게시 된 데이터를 수동으로 분석¹에 비교 하 여 방법의 정확성을 확인 했다. 더욱 우리의 방법의 정확도 확인, 우리 다른 조건 하에서 여러 돌연변이 사용 하 고 게시 된 문학으로 결과 확인. 그것은 또한 미묘 하 고 강한 고기-감지 하는 방법의 능력을 확인 cpb-3 및 glp-1 돌연변이, 각각. 또한,이 방법은 핵 크기와 형태는 생식 또는 심지어 긴장 사이 변화에 적응력을 보여줍니다. 이 속성은 또한 id 및 염색체와 정자 등 생식...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C. elegans 균주: 야생형 (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli 박테리아	수제
선충 성장 매체 (NGM) 플레이트	수제
다클론 토끼 anti-REC-8	SDIX	29470002
Alexa 488 염소에서 생성된 복합 항체	Thermofisher Scientific	A-21236
염료 팔로이딘;	써모피셔 사이언티픽	A-12380
DAPI	써모피셔 사이언티픽	62248
폴리-L-라이신	시그마 알드리치	P5899
테트라미솔	Sigma Aldrich	P5899
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
1M HEPES 버퍼, pH 7.4	시그마 알드리치	G0887
10X PBS pH 7.4	써모피셔 사이언티픽	AM9625
트윈-20	Sigma Aldrich	P1389
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
37% 파라포름알데히드 용액	Merck Millipore	1040031000
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Fluoroshield 고정 시약	시그마 알드리치	F6182
에탄올	밀리포어
메탄올	시그마 Aldrich	34860
20° C & 25도; C인큐베이터	모든 브랜드
광학 현미경	모든 브랜드
컨포칼 현미경	모든 브랜드(Leica, Zeiss)
Imaris 슈트 8.4.1 이상 버전이 장착된 컴퓨터, 소프트웨어 및 Matlab 소프트웨어를 사용할 수 있는 정식 라이선스.	Bitplane
Phospho 버퍼링 식염수, pH 7.4	집에서 만든
테플론 현미경 슬라이드	텍돈	941-322-8288