이 작품의 목적은 다양 한 지방 백분율 및 볼륨 유령 생산 하는 사용자 지정할 수 있는 실용적인 지방 물 팬텀을 만들기 위한 프로토콜을 설명 하기 위해.
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이 논문에서
요약
초록
이미지 adipose 조직에 새로운 기술 개발로 이러한 프로토콜의 유효성을 검사 하는 방법을 점점 더 중요 한 되 고 있다. 유령, 조직 또는 장기의, 실험적인 복제 저렴 한 비용, 유연한 솔루션을 제공 합니다. 그러나, 비싸고 특수 장비에 대 한 액세스를 하지 않고 높은 지방 분수와 안정적인 환영 건설 (예., > 갈색 지방 조직에서 본 등 50% 지방 분수 레벨) 지질 소수 성 특성으로 인해 어려울 수 있습니다. 이 작품의 0%, 25%, 50%, 75% 및 100% 기본 랩 공급 (열판, 비 커, 등)를 사용 하 여 쉽게 액세스할 수 있는 구성 요소 (증류수, 한 천, 수용 성 지방 분수와 5 x 100 mL 유령 개체를 만들기 위한 자세한, 저렴 한 비용 프로토콜 제공 계면 활성 제 나트륨 benzoate, 가돌리늄-diethylenetriaminepentacetate (DTPA) 대비 에이전트, 땅콩 기름을 오일 수용 성 계면 활성 제). 프로토콜; 유연 하 게 설계 되었다 그것은 다른 지방 분수와 다양 한 볼륨 유령 개체를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여 만든 유령 지방 분수 값 지방 물 자기 공명 영상에서 생성 된 환영에 대상 값을 비교 하는 타당성 연구에 평가 했다. 이 연구 나왔고 0.998의 색인 상관 계수 (95% 신뢰 구간: 0.972 1.00). 요약 하자면, 이러한 연구 임상 관련 조직 및 장기의 범위에 걸쳐 기법을 이미징 하는 지방 조직 유효성 검사에 대 한 지방 환영의 유틸리티를 보여 줍니다.
서론
지방 조직 및 자기 공명 영상 (MRI) 등 영상 modalities를 사용 하 여 트리 글리세라이드 콘텐츠 측정에 관심 많은 분야에 걸쳐 확장 됩니다. 연구 분야 장기 및 조직 간1, 췌 장2, 골격 근육3등 백색과 갈색 지방 조직 창 고의 조사와 지질의 소성 스토리지를 포함합니다. 지방 정량화에 대 한 이러한 새로운 기술을 개발 되, 메서드는 이미징 매개 변수는 연구와 임상 응용 프로그램에 대 한 확인 필요 합니다.
유령, 조직 또는 기관, 실험 복제본 하 개발 하 고 검증 이미징 기법4낮은-비용, 유연 하며 제어 도구를 제공 합니다. 특히, 유령 지방 구성 하 고 볼륨 비율 또는 지방 분수 (FF) 임상 관심의 조직의 비교에서 물 생성할 수 있습니다. 임상, 조직 및 장기에 FF 값 넓게 변화할 수 있다: 갈색 지방 조직에서 FF 29.7%, 93.95; 사이 폭포 평균 간 steatosis 환자에서 FF는 18.1 ± 9.06; 1.6%와 22.27; 사이 2 형 당뇨병 범위에 대 한 위험이 성인에서 췌 장 FF 그리고 경우에 따라 사전 질병의 듀 켄 씨 근이 영양 증 환자 일부 근육8에 거의 90%의 FF 값 가질 수 있습니다.
지질과 같은 비 극 지 분자 물과 같은 극 지 분자의 구성 하는 솔루션에서 잘 분해 되지 않습니다, 때문에 높은 대상 FF와 안정적인 환영을 만드는 도전 남아 있습니다. 최대 FF에 대 한 50%, 많은 기존 방법은 사용할 수 있습니다 지방 물 환영9,10,,1112를 만들려고. 일반적으로 더 높은 FFs를 달성 하는 다른 메서드는 균질 화기 또는 초음파 셀 방해13,14등 고가의 장비를 필요 합니다. 이러한 기술은 높은 FF 유령에 대 한 로드맵을 제공, 장비 제약 조건 및 다양 한 양의 실험 내용 재현 하 고 강력한 지방 물 환영을 창조 하는 노력을 제한 합니다.
이러한 이전 기술을 따라 건물, 우리 FF 사용자 정의 범위 값 비용 효율적이 고 안정적인 지방 물 환영을 생성 하는 방법을 개발 했다. 이 프로토콜 세부 FF 값이 0%, 25%, 50%, 75% 및 100% 사용 하 여 단일 열판의 지방 환영의 5 x 100 mL를 만드는 데 필요한 단계. 그것은 쉽게 만들고 다양 한 볼륨 (10 ~ 200 mL) 지방 백분율 (0 ~ 100%)를 조정할 수 있습니다. 팬텀 기술의 효능 타당성 연구 비교 지방 물 MRI FF 값을 대상 FF 값에서 생성 된 환영에 평가 했다.
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프로토콜
1. 워크스테이션 및 자료 준비
- 모든 실험실 안전 규칙을 준수 합니다. 눈 보호와 장갑을 착용 하십시오. 시 약의 각각에 대 한 물질 안전 데이터 시트 읽기 사용 하 고 적절 한 예방 조치를 취해야. 재료 및 장비 목록, 화학 처리 절차와 유리 주의 검토 합니다.
주의:이 프로토콜에는 높은 온도에서 열판의 사용을 해야합니다. 주의 사용 하 고 상호 작용 컨테이너 덥고는 열판의 표면을 만지지 마십시오 내 열 장갑 착용. - 작업을 취소 하 고 살 균 제와 표면 청소. 손 씻고 하 고 장갑 넣어.
- 모든 악기와 오염의 잠재적 위험을 줄이기 위해 하는 팬텀의 장 수를 증가 모든 유리 항아리의 내부를 소독.
참고: 팬텀 며칠 이상 사용 될 경우 정기적으로 세균성 성장을 방지 하기 위해 에탄올과 완성 된 팬텀의 표면 청소.
2. 준비 물 솔루션
- 물 솔루션에 대 한 작업 영역을 준비 합니다. 벤치에는 다음과 같은 재료와 장비를 위치: 실린더, 400ml 비 커, 볶음 바, 규모, 2 x 무게 보트, 주걱, 바늘, 증류수, 가돌리늄-diethylenetriaminepentacetate (DTPA) 대비 에이전트, 2 x 1.0 mL 주사기를 졸업 수용 성 계면 활성 제, 한 천, 그리고 나트륨 benzoate입니다.
참고: 함께 또는 바늘 없는 주사기를 사용할 수 있습니다. 그러나, 바늘을 사용 하 여 측정의 정확성을 향상 되며 내용을 물 또는 오일 솔루션에 추가 되는 때 튄 방지. - 장소 400ml 비 커에 저 어 바. 100 또는 200 mL 졸업 실린더를 사용 하 여 증류수의 300 mL를 측정 하는 비 커에 물을 부 어. 열판에 비 커를 놓고 100 rpm의 저 율으로 90 ° C로 설정 합니다.
참고: 높은 온도 빠른 결과 달성 하기 위해이 프로토콜에 사용 됩니다. 솔루션은 오랜 기간에 대 한는 열판에 남아 있지, 때문에 세트 포인트 온도 열판에 대 한 솔루션의 온도 반영 하지 않습니다. - 보정된 규모를 사용 하 여 무게 보트로 나트륨 benzoate의 0.30 g을 측정. 나트륨 benzoate 물 솔루션에 추가 합니다.
- 주사기를 사용 하 여 수용 성 계면의 0.6 mL를 측정. 없음 기포는 다는 것을 확인 하십시오. 솔루션의 중심에 바늘 몇 밀리미터를 누른 천천히 비 커의 벽에 튄 피하기 위해 수용 성 계면 활성 제를 출시 합니다.
- 깨끗 한 주사기를 사용 하 여, 가돌리늄-DTPA 대조 대리인의 0.24 mL 측정 합니다. 2.4 단계에서 같은 기술을 사용 하 여 비 커에 추가.
참고: 가돌리늄-DTPA는 팬텀의 MRI 휴식 속성 그 관심의 조직에 맞게 조정 하는 데 사용 됩니다. 독자는 더 관심의 조직의 이완 속성에 맞게 추가 가돌리늄-DTPA의 볼륨을 조정할 수 있습니다. - 무게 보트로 한 천의 9.0 g을 측정 합니다. 물을 비 커에는 agar 주걱으로 천천히 숟가락.
- 일단 모든 물 솔루션에 추가 된, 열판 온도 350 ° C를 증가 하 고 5-10 분은 한 천 녹 1100 rpm 속도 바 저 어.
- 한 천 녹 인 경우를 확인 하려면 짧게는 열판에서 물 솔루션을 제거, 중지 교 반, 하 고 솔루션의 색상을 확인 하십시오. 클리어 (깃발 또는 덩어리)와 황색 또는 호박색 색깔에 녹은 한 천 이어야 한다.
- 천이 완전히 녹 인 후 주사기를 사용 하 여 또는 물 해결책의 약 3.5 mL 작은 유리병에 부 어. 테스트 솔루션 설정 하지 않습니다 또는 5-10 분 후 분리, 하는 경우는 agar 하지 녹아 있다. 열판 온도 350 ° C를 다시 증가 하 고 솔루션에 난방 계속.
- 제대로 테스트 유리병 세트에 물 솔루션까지 단계 2.8 반복 합니다.
- 50 ° C와 100 rpm에서 열판에 물 솔루션을 둡니다. 작업 공간을 청소 하 고 기름 솔루션에 대 한 준비.
- 벤치에서 다음과 같은 자료를 제거: 규모, 체중 보트, 주걱, 바늘 (사용) 2 x 1.0 mL 주사기, 증류수, 가돌리늄-DTPA 대비 에이전트, 수용 성 계면 활성 제, 한 천, 및 나트륨 benzoate x 2.
- 벤치에는 다음과 같은 재료와 장비를 위치: 400 mL 비 커 (깨끗 한), 바 (깨끗 한) 저 어, 2.0 mL 주사기 바늘, 땅콩 기름, 그리고 오일 수용 성 계면 활성 제와 함께.
3. 오일 솔루션
- 장소 깨끗 한 400ml 비 커에 새로운 저 어 바. 졸업된 실린더를 사용 하 여 땅콩 기름의 300 mL를 측정 하는 비이 커에 부 어. 물 솔루션을 포함 하는 비 커를 제거 하 고 오일 솔루션 비 커는 열판에 놓습니다. 1 분 동안 100 rpm의 저 어 속도 90 ° C로 설정 합니다.
참고: 땅콩 기름15인간 지방 조직 중성 지방에 비해 비슷한 핵 자기 공명 스펙트럼을가지고 있기 때문에 사용 됩니다.- 두지 마십시오 석유는 열판에 무인. 기름 너무 뜨겁게 연기를 시작 하는 경우는 열판에서 그것을 제거 하 고는 열판에 석유를 반환 하기 전에 온도 감소 시키십시오.
- 깨끗 한 주사기 오일 수용 성 계면 활성 제의 3.0 mL를 측정 합니다. 2.4 단계에서 설명한 동일한 기법을 사용 하 여, 비 커에 오일 수용 성 계면 활성 제를 추가 합니다. 150 ° C와 완전히 혼합 오일 솔루션을 5 분 동안 1100 rpm는 열판을 설정 합니다.
- 열판에서 오일 솔루션 고 팬텀을 만들기 위한 준비 작업을 청소.
- 벤치에서 다음과 같은 자료를 제거: 2.0 mL 주사기 바늘 (사용), 땅콩 기름, 그리고 오일 수용 성 계면 활성 제와 함께.
- 벤치에는 다음과 같은 재료와 장비를 위치: 250 mL 삼각 플라스 크, 저 체적 펫, 부피 피펫으로 홀더, 및 5 x 120 mL 유리 항아리 (깨끗 한), 바.
4. 팬텀 유제 만들기
- 물과 오일 솔루션에 대 한 체적 펫을 준비 합니다. 펫에 교차 오염을 방지 하기 위해 그들의 각각 솔루션 사용 될 해야 합니다.
- 프로토콜에 사용 되는 볼륨에 피 펫의 크기와 일치. 예를 들어, 2 x 50 mL 체적 펫 (50 mL 물 솔루션 + 50 mL 오일 솔루션) 100 mL 팬텀 만들 대상 50% 지방의 FF 사용 합니다.
- 열판에 물 솔루션을 놓고는 열판 300 ° C와 1100 rpm으로 설정 합니다. 4-5 분 후 해제는 활동가.
- 부피 피 펫을 사용 하 여, 부분적으로 솔루션의 소량 (5-10 mL)으로 피펫으로 작성 하 고 다시 비 커로 발표 하 여 물 솔루션 추출을 위한 준비 인지 확인 합니다. 경우 물 솔루션을 쉽게 제거 하 고 피펫으로 과도 한 나머지 없이 출시 될 수, 그렇지 않으면 다음 단계로 이동는 열판에 두고 고 다시 2-3 분에 합니다.
참고: 교 반 및/또는 가능한 한 자주 따뜻한 물 솔루션을 유지 하는 것이 좋습니다 그래서 물 솔루션의 구성 요소를 설정 하 고, 더 따르게 됩니다. 물 솔루션은 되지 예 열을 전송 하기 전에 자극 때문에 냉각 하는 때 응결 한 경향이 정확한 볼륨 측정 하이 매우 어려울 것 이다. - 신중 하 게 250 mL 삼각 플라스 크를 깨끗 한 볶음 바 추가. 열판에서 물 솔루션을가지고, 적절 한 볼륨 (표 2)를 측정 하 고 삼각 플라스 크에 그것을 전송.
- 열판에 오일 솔루션을 놓고 90 ° C에서 및 1100 rpm 솔루션은 균질 되도록 설정 합니다. 1-2 분 후에 열판에서 오일 솔루션을 제거 하 고 삼각 플라스 크와 함께 그것을 대체 합니다.
- 오일 솔루션 (표 2)의 적절 한 양을 측정 하 고 천천히 삼각 플라스 크에 물 솔루션에 추가 합니다.
- 모든 오일 솔루션을 추가 300 ° C에 온도 증가 하 고 1100 rpm에서 감동 유지. 4-5 분 (저 어 바에서 소용돌이 있어야 함)에 대 한 결합 된 솔루션을 저 어. 유제는 백색, 크림 텍스처와 함께 해야 합니다.
- 마그네틱 볶음 바 검색기를 사용 하 여 저 어 바 제거 하.
참고: 저 어 바 리트리버 모든 미래의 유화 액에서 저 어 막대를 제거를 사용 해야 합니다. 각각의 사용 사이 그것을 철저 하 게 청소. - 내 열 장갑을 사용 하 여 신중 하 게 깨끗 한 120 mL 유리 항아리에 삼각 플라스 크에 혼합물을 부 어. 천천히 냉각으로 혼합물에 거품을 방지 하기 위해 유리 항아리의 측면에 혼합물을 부 어.
- 삼각 플라스 크와 저 어 바, 청소 하십시오 다음 반복 단계 4.2-4.8, 모든 유령 만들어집니다 때까지 물과 오일 솔루션의 금액을 조정.
참고: 유리를 청소 하기 전에 멋지다 다는 것을 확인 하십시오.
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결과
물 솔루션 제대로 준비 된 경우 솔루션의 소량 테스트 유리병 (그림 1, 왼쪽된)에서 신속 하 게 응결 한다. 솔루션 분리 (그림 1, 오른쪽), 솔루션 (3.8 프로토콜의 단계에서 설명) 하는 대로 다시 준비 한다. 유제 ( 그림 2, 왼쪽 및 오른쪽의 예제) 분리, 팬텀은 가능한 하 고 폐기 한다. 이 경우, 그것은 일반적으로 유제가 충분히 높은 온도 도달 하지 않았다 때문 에입니다.
성공적인 유령 군데 MRI를 통해 측정 될 수 있는 동질적인 혼합물을 형성 하기 위하여 응결 됩니다. (
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토론
우리 지방 물 환영을 지방 조직 및 트리 글리세라이드 콘텐츠 비보를 계량 하는 데 사용 하는 의료 이미징 기술을 유효성 검사를 위해 적당 한 만드는 강력한 방법을 설명 합니다. 두 개의 저수지 (오일 솔루션)과 한 물 솔루션을 만들어 안정적인 유령 FF 값-50%를 초과 하는 값을 포함 하 여-다양 한 고가의 장비에 대 한 필요 없이 건설 되었다. 높은 FF 유령 (> 50%) 지방 정량화에 대 한 이미징 기술을 조직 또는 갈색 지방이 많은 직물5등 높은 FF 값 장기 올바른지 확인 하기 위해 유틸리티를 제공. FSF의 MRI 견적 잘 알려진된 FF 값와 상관 했다.
단일 열판 (이 프로토콜에서 설명)로 사용할 수 있는 경우에, 각 솔루션에서 열 유지의 물류 기본 관심사입니다. 가 열, 교 반 없이 물 솔루션 쿨 하 고 응결 하기 시작할 수 있습니다. 이 방지 하려면는 열판에 물 솔루션을 배치 (< 100 ° C ~ 10...
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공개 사항
저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.
감사의 글
이 연구는 국립 보건원 (NIH)과 국립 연구소의 당뇨병과 소화와 신장 질병 (NIDDK) 제공 했다에 대 한 지원 자금 / NIH R01-DK-105371. 우리 지방 물 가상 창조에 박사 Houchun (해리) Hu를 조언과 제안을 위한 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 증류수 | 아마존 | B000P9BY38 | 수용액 기반 |
| Agar | Sigma Aldrich Incorporated | A1296-100G | 겔화제 |
| 계면활성제 | Sigma Aldrich Incorporated | P1379-500ML | 계면활성제/유화제 |
| 가돌리늄-DTPA 조영제 | Bayer Healthcare | 50419-0188-01 | 자기 공명 영상 조영제. |
| 벤조산나트륨 | Sigma Aldrich Incorporated | 71300-250G | 방부제 |
| 땅콩 기름 | Amazon | 54782-LOU | 오일 용액 기본 |
| 수용성 계면활성제 | Sigma Aldrich Incorporated | S6760-250ML | 계면활성제/유화제 |
| 핫플레이트(교반기 포함 | Fisher Scientific | 07-770-152 | |
| 교반 막대(달걀 모양) | Sigma Aldrich Incorporated | Z127116-1EA | |
| 400 mL 비커 | Sigma Aldrich Incorporated | CLS1003400-48EA | |
| 250 mL Erlenmeyer 플라스크 | Sigma Aldrich Incorporated | CLS4450250-6EA | |
| 25 mL 유리 부피 측정 피펫 | Fisher Scientific | 13-650-2P | 수량 = 2 |
| 50 mL 유리 용량 피펫 | Fisher Scientific | 13-650-2S | 수량 = 2 |
| 75mL 유리 부피 측정 피펫 | Fisher Scientific | 13-650-2T | 수량 = 2 |
| 3.0mL 주사기 | Sigma Aldrich Incorporated | Z248002-1PAK | |
| 1.0mL 주사기 | Sigma Aldrich Incorporated | Z230723-1PAK | |
| 주걱 | Sigma Aldrich Incorporated | S3897-1EA | |
| 스케일(100g x 0.01g 해상도) | 아마존 | AWS-100-BLK | |
| 무게 보트 | Sigma Aldrich Incorporated | Z740499-500EA | |
| 120 mL 유리 항아리 | McMaster Carr Supply Co | 3801T73 | |
| 내열 장갑 (쌍) | Amazon | B075GX43MN | |
| 주사기 바늘 | Sigma Aldrich Incorporated | Z192341-100EA | |
| 18" 스티어 바 retriver | Fisher Scientific | 14-513-70 | |
| 1 드램 투명 유리 바이알 | Fisher Scientific | 03-339-25B |
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재인쇄 및 허가
