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방법 논문

주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석

5.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57716

⸱

2018년 6월 13일

 , 
1Department of Biology, Duke University

이 논문에서

요약

여기, 우리는 무대와 초파리 종에서 후 각 조직 개발 해 부 프로토콜을 제시. 있으 나 해 부 조직 immunohistochemistry 또는 제자리에서 같은 비보에 분석 뿐만 아니라 양적 RT-PCR (반전 전사-연쇄 반응) 또는 시퀀싱 (RNAseq), RNA와 같은 분자 분석에 대 한 나중에 사용할 수 있습니다. 교 잡입니다.

초록

초파리 의 후 각 시스템 발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동과 행동 진화에 널리 사용 되는 시스템이입니다. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경 이외에 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 프로토콜에서 우리는 성인 초파리 종의 주변 후 각 조직 개발의 해 부를 설명 합니다. 우리는 처음 무대 초파리 애벌레, 중순에 번데기 단계와 성인에서 안테나의 해 부에 의해 따라 초기 번데기 단계에서 더듬이 디스크의 해 부를 이어서 나이 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 어디 준비 qRT-PCR, RNAseq, 또는 immunohistochemistry RNA 추출 등 분자 기법에 활용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 적용할 수 있습니다 또한 다른 초파리 종 종의 번데기 개발 시간, 결정 하 고 각 단계는 적절 한 노화에 대 한 계산 됩니다.

서론

발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동 연구, 그리고 행동 진화1,2,3, 초파리 의 후 각 시스템은 널리 사용 되는 시스템 4. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경1,,56외 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 원고의 전반적인 목표는 무대 초파리 종의 번데기 및 성인 후 각 조직 개발 해 부 하는 방법을 보여 줍니다. 이 기술에 대 한 근거 또한 vivo에서 조직 기술 라벨 샘플 RNAseq 등 정량적 RT-PCR, 주변 후 각 시스템의 분자 및 발달 분석에 대 한 다른 번데기 단계에서 생성 하는 . 이 기술은 특정 세포 유형에 대 한 모든 유전자 변형 시 약 하지 않은 비-초파리 melanogaster 종 개발 성인 후 각 시스템에 transcriptional 프로필의 역학을 식별 하기 위해 특히 유용할 수 있습니다. 표시 하 고 분석입니다. 이 원고, 더듬이 디스크와 번데기 및 성인 초파리 종에서 안테나를 해 부하는 방법을 보여 줍니다. 첫째, 우리 개발 준비 및 종의 노화에 대 한 puparium 형성 (APF, 흰색 pupae 또는 prepupae)의 0 h 초파리 를 식별 하는 방법을 보여 줍니다. 다음, 우리에 게 보여 더듬이 디스크와 제 3 더듬이 세그먼트; 해 부 특히, 눈 디스크 및 RNAseq 또는 RT PCRs에 필요한 조직 순도 대 한 두 번째 더듬이 세그먼트에서 그들을 분리 하는 방법. 미리 무늬 더듬이 디스크 (prepupae)에 해당 하는 단계 D. melanogaster 약이 프로토콜에서 설명에서 일어나는 더듬이에서 선택 디스크 (8 h APF), ORNs (40 h APF)에 대 한 터미널 차별화의 시작 하 고 성인 안테나입니다. 마지막으로, 우리 성인 안테나 메서드를 사용 하 여 고립에서 그리고 vivo에서 immunohistochemistry 양적 RT-PCR에 대 한 예제는 줄. 이 메서드는 RNA/DNA 분석 및 immunohistochemistry 초파리 종에서 주변 후 각 조직 개발에 대 한 샘플을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

다음 프로토콜은 듀크 대학 연구 윤리 위원회에 의해 설립 된 윤리 지침과 일치.

1. 조직 준비와 초파리 melanogaster 번데기의 개발 준비

  1. 첫째, 얼마나 많은 파리 해 부 할 것입니다 확인 합니다. RT-PCR 및 RNAseq, prepupal, 8 h APF, 40 h APF, 및 성인 단계에서 필요한는 개인에서 100-200 더듬이 디스크와 안테나를 수집 합니다. Immunohistochemistry, 10-20 개인을 해 부.
  2. 해 부 패드와 집게, 물티슈를 사용 하 여 70%를 포함 하 여 모든 물자를 청소 EtOH. 해 부 물자는 RNA 추출에 사용할 수, RNase neutralizers와 모든 것을 깨끗이 nuclease 무료 사용 하는 모든 솔루션을 경우 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 물 처리.
    참고:이 프로토콜은 해에 대 한 유리 대신 실리콘 해 부 패드 사용합니다. 실리콘 패드 초 미세 집게를 친절 하 고 신속 하 고 높은 품질의 해를 홍보.
  3. 0 h APF/prepupal 단계에서 번데기를 수집 합니다.
    1. 가장 정확한 준비 되도록 30 분 1 시간 간격에서 애벌레를 모니터링 합니다.
      참고: 적당히 붐비는 병에서 방황 하 고 세 번째 탈피 애벌레 몇 시간 pupate 가능성이 것입니다.
    2. 일단 애벌레 움직이지 되 고 매우 가벼운 (거의 흰색) 색된 번데기 케이스에 의해 포위 된다는 작은 2-페 트리 접시에 촉촉한 필터 종이 그들을 전송.
    3. 1-2 h, 때때로 모니터링, 확인, 및 prepupae 전송에 대 한 계속.
      참고: 또는 모든 pupae의 병을 취소 하 고 2 시간에 대 한 개발에 애벌레를 허용. 모든 pupae 수집 후 2 h 0-2 h APF 범위 안에 있을 것입니다.
  4. 즉시 prepupal 더듬이 디스크 0 h APF 무대에 대 한 해 부 3.1 단계로 이동 합니다. prepupa 세 수 하는 경우, 접시에 그들을 수집, 접시 커버와 건조, 억제 하기 위해 가장자리 주위 파라핀 영화 놓고 25 ° c.에 페 트리 접시를 놓고
    참고: 번데기 이제 일수로 하 세 수 있습니다.
  5. 2 h 범위에서 수집 하는 번데기에 대 한 번데기 하지 할 수 있도록 원하는 나이 보다는 더 적은 2 시간에 대 한 prepupae을 나이 없 더군요.
  6. 아주 작고 연약한 조직으로 초 미세 집게 (Dumont 55)를 사용 합니다.

2. 조직 준비 및 다른 초파리 종에서 번데기의 개발 준비

  1. 다른 초파리 종의 번데기 개발의 길이 확인 하려면 샘플 최적의 온도에서 prepupae은 관찰 날짜를 기록, 신선한 유리병으로 그들을 정렬 놓고 성인 기에 prepupa에서 일 수를 기록 합니다.
  2. 시간 번데기 개발에 대 한 비-melanogaster 종 melanogaster의 비율을 기록 합니다. Melanogaster 준비에 대 한 비-melanogaster 종 나이에 시간 수를 사용 하는 시간의 수에 의해 개발 시간의 비율을 곱하면 됩니다.

3. D. melanogaster 번데기 더듬이 디스크의 해 부

참고: 모든 노화 시간 및 해 부 프로토콜 설명에 대 한 초파리 melanogaster. 위에서 설명한 대로 다른 모든 종족에 대 한 종의 발달 시간 포인트에 따라 노화 프로토콜의 필요 있을 것입니다.

  1. 번데기 더듬이 디스크 해에 대 한 50-100 0-2 h 또는 주걱을 사용 하 여 6-8 h 오래 된 번데기를 수집 하 고 해 부 패드에 그들을 배치.
  2. 무료 1.5 mL microfuge 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 튜브와 튜브를 얼음 위에 RNase에 RNA 격리 솔루션의 150 µ L 플라스틱.
  3. 1 x PBS (인산 염 버퍼 식 염 수, nuclease 무료)의 150-200 µ L에 번데기를 해 부. 해 부 패드에 PBS (방울 당 150-200 µ L)의 여러 방울을 배치 합니다.
  4. 해 부 패드에서 PBS 방울 x 1 중에서 해 부 수를 0-2 h 또는 세 6-8 h 번데기 (한 번데기 드롭 당)을 놓습니다. 한 손에 집게를 사용 하 여 신체를 안정.
  5. 0-2 h pupae를 사용 하 여 다른 손에 잡고 집게에는 prepupa의 가장 앞쪽 부분 (입 고리)를 세 고 두뇌와 앞쪽 번데기 케이스에 부착 된 imaginal 디스크를 밖으로 당겨.
  6. 8 h APF pupae에 대 한 먼저 부드럽게 껍질 번데기, 시체를 둘러싸는 막 자루 내 머리를 노출의 가장 앞쪽 분기에서 번데기 케이스에서.
    참고: 몸,이 단계에서 처럼 보인다 악화 애벌레.
  7. 목 관절에서 머리를 제거 합니다.
    참고: 이렇게 하면 더듬이 디스크 손실 되지 것입니다이 단계에는 주로 뇌의 시 돌출부에 연결 되어.
  8. 두뇌와 imaginal 디스크 조직을 다른 1x PBS 방울 집게 또는 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 전송.
  9. 광 엽에서 뇌에 연결 된 눈 더듬이 디스크를 식별 합니다. 집게를 사용 하 여, 두뇌와 번데기 케이스에서 눈 더듬이 디스크를 분리 합니다. PBS 방울 집게 또는 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 x 새 1에 그것을 전송.
    참고: prepupal 눈 더듬이 디스크는 평평한 조직 이다. 그러나, 8 h pupae로 눈 디스크는 회전 컵 더듬이 디스크는 중앙 뇌 앞쪽에 앉아.
  10. 집게를 사용 하 여 눈과 더듬이 디스크 사이의 연결의 사이트에서 조직을 잘라. 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 RNA 격리 솔루션 시 약으로 해 부 조직을 전송. 가능한 금액 pipetting으로 전송 하는 액체의 양을 최소화 합니다.
  11. 모든 pupae 해 부 될 때까지 반복 합니다.

4. D. melanogaster 중반-번데기 및 성인 안테나의 해 부

참고: 40 h APF, 대부분의 변 태 완료 되 면, 그리고 성인 구조, 명백한 되고있다 하지만 여전히 흰색 하 고 표현할 수 있다. 이 개발 시간이 시점에서 성인 안테나는 그것의 마지막 모양 아직 여전히 투명은 고 몇을 제외한 후 각 수용 체의 대부분 식 시작 하지 않았습니다.

  1. 번데기 더듬이 해에 대 한 1 단계에서 설명한 대로 50-100 prepupae를 수집 하 고 40 h 25 ° c.에 대 한 그들을 나이
  2. 피펫으로 150 µ L RNase 무료 1.5 mL microcentrifuge에 RNA 격리 솔루션의 200 µ L 피펫으로 사용 하 여 튜브와 튜브를 얼음 위에.
  3. 해 부 패드에서 PBS 방울 x 1의 하나로 해 부에 번데기를 놓습니다. 한 손에 집게를 사용 하 여 신체를 안정. 번데기는 시체를 둘러싸는 막 자루 내 머리를 노출의 가장 앞쪽 분기에서 번데기 케이스 벗기다 집게를 사용 하 여 다른 손에서 부드럽게.
  4. 집게를 사용 하 여, 조심 스럽게 잘라 번데기 시체의 나머지 부분에서 머리 집게의 1 세트를 가진 시체를 벗는 머리 목에 집게의 또 다른 세트와 함께 공동 하 여. 부드럽게 PBS 방울 집게를 사용 하 여 다른 1x로 머리를 전송 합니다. 머리 (뇌, 등)를 분명 막 개발 초파리 머리를 포위 하는 데 사용의 내용을 밖으로 청소를 위아래로 플라스틱.
    참고: 40-50 h APF, 안테나 막의 앞쪽 대부분 섹션에 연결 됩니다. 그들은 머리의 내용을 pipetting으로 지워집니다 때 해 부에 대 한 명백한 될 것입니다.
  5. 집게를 사용 하 여 막에서 번데기 안테나를 분리 합니다. 3에서 안테나의 2nd 세그먼트를 분리rd 3rd 세그먼트만 후 각 수용 체 신경 세포를 들어설 예정으로 단편 관절에서 슬라이스를 집게를 사용 하 여.
  6. 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 RNA 격리 솔루션 시 약으로 해 부 조직을 전송. 가능한 금액 pipetting으로 전송 하는 액체의 양을 최소화 합니다. 모든 pupae 해 부 될 때까지 반복 합니다.
  7. 성인 더듬이 해 약 50 성인 수집 및 주 후 일수로 대 한 그들을 나이.
    참고: 후 각 수용 체 유전자의 표현과 다른 유전자 일수로 후 주 피크. 어른은 생물학으로 관련 유전자 검출 임계값 이상 상승 낮은 풍부 증명서를 위해 1 주일에 대 한 세.
  8. RNA 추출에 대 한 그들은 CO2 패드에 아직도 살아 있는 동안 파리의 해 부. RNase 억제제와 CO2 패드를 취급 합니다. Confocal 영상에 대 한 해 부 해 부 패드 PBS 또는 PBS + 0.2% x 1에서에 파리 트리톤.
  9. 첫째, 성인 절 개 범위에서 CO2 역 패드에 잘 넣어. 신체를 안정 시키기 위해 한 손에 집게를 사용 하 여 CO2 역 패드, 다른 한편에서 포 셉을 사용 하 여 두 번째에서 세 번째 더듬이 세그먼트 밖으로 부드럽게 당겨/핀치에.
  10. 집게를 사용 하 여 액체에 직접 안테나를 배치 하는 RNA 격리 솔루션에 안테나를 전송 합니다. 모든 성인 해 부 될 때까지 반복 합니다.
    주: 안테나 RNA 격리 솔루션에 잠긴 것을 확인 하십시오. 안테나는 튜브의 측면에 갇혀 될 수 있습니다. 이 RNA 품질 및 수량 감소는 RNA의 증가 저하가 될 수 있습니다.
  11. 직접 RNA 추출을 진행 하거나 장기 저장을 위한-80 ° C에서 튜브를 놓습니다.

5. RNA 격리 해 부 조직에서

  1. -80 ° C 저장소에서 모든 샘플을 제거 하 고 얼음에 녹여.
  2. 짧게 스핀 (5-6 s, ~ 6000 x g) 튜브의 하단에 있는 자료를 수집 하는 각 샘플.
  3. 10는 압력가 플라스틱 유 봉과 전기 모터를 사용 하 여 각 샘플을 갈아 얼음에 s.
  4. 5.2와 5.3 4 단계를 반복 합니다.
  5. RNA 추출 상용 키트를 사용 하 고 최적의 생산량에 대 한 제조 업체의 프로토콜을 다음을 수행 합니다.
  6. QRT-PCR 상용 시 약 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 관심의 유전자에 대 한 특정 뇌관을 사용 하 여 수행 합니다.
    1. 다음과 같은 조건을 사용 하 여 모든 PCR 반응을 수행: 10 분 동안 95 ° C 변성 뒤 15 95 ° C의 40 주기 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 그리고 60 ° C 30에 대 한 s.
      참고: 딥 및 dpr 유전자를 위해 뇌관 쌍 표 1에 나열 된 및 Hueston CE 외 에 후 각 수용 체 유전자를 위한 뇌관 나열 8.

6. 번데기 더듬이 디스크와 Immunohistochemistry에 대 한 안테나의 고정

참고: 시간이 같은 금액에 대 한 조직 고정 되도록 10-20 개인 배치 조직 수정 했다. 샘플 조직의 무결성을 최대화 하기 위해 정착 액에 그들을 전송 하기 전에 PBT (세제 PBS)에 체류 하는 시간을 최소화 합니다.

  1. 수집 해 부 더듬이 디스크 또는 0.2%의 200 µ L을 포함 하는 200 µ L PCR 튜브에 번데기 안테나 조직의 무결성을 유지 하 고 200 µ L PCR의 벽에 튀어나와에서 샘플을 피하기 위해 얼음에 PBT 튜브는 불완전 한 고정으로 이어질 것입니다 합니다.
    참고: 번데기 안테나 및 더듬이 디스크 어려울 수 있습니다 그들은 꽤 반투명으로 보고입니다. 그것은 조직의 모든 손실을 방지 하기 위해 모든 세척 단계에 대 한 절 개 범위를 사용 하는 것이 좋습니다. 또는, 96-잘 Terasaki 플레이트 고정에 대 한 사용 하 고 최고의 조직을 추적 얼룩 있을 수 있습니다.
  2. 4%의 약 200 µ L에 번데기에서 수정 해 부 더듬이 디스크와 더듬이 샘플 PFA (Paraformaldehyde) 실 온에서 30 분. 이 고 후속 단계를 제대로 믹스 솔루션에서 샘플을 nutator에 샘플 튜브를 유지. 6.7 단계로 진행입니다.
  3. 성인 안테나에 대 한 전체 머리를 처음 해 부하 고 4%의 약 200 µ L에서 수정 PFA (paraformaldehyde) 실 온에서 1 h.
  4. 씻어 0.2%의 200 µ L 3 x PBT 10 분. 인큐베이션 기간 동안에 nutator 샘플을 유지.
  5. 고정 헤드에서 두 번째 더듬이 세그먼트의 미세한 절 개에 대 한 해 부 현미경을 다시 이동 합니다. 집게를 사용 하 여 머리를 안정, 두 번째에서 세 번째 더듬이 세그먼트 밖으로 부드럽게 당겨/핀치.
  6. 4%의 약 200 µ L로 해 부 제 3 더듬이 세그먼트를 전송 PFA (paraformaldehyde) 실 온에서 30 분 동안 그들을 수정 하 고.
  7. 씻어 0.2%의 200 µ L 3 x PBT 10 분. 인큐베이션 기간 동안에 nutator 샘플을 유지.
  8. 4 ° C에서 샘플을 저장 하거나 전체 마운트 immunohistochemistry 직접 계속.
    참고: 얼룩의 효율성 항 체 사용 되 고 변경할 수 있습니다. 이 메서드는 풍부한 단백질 태그 덜 적합 또는 약한 항 체 이어야 한다. 그러나, 때때로, 그것은 프로토콜 (정체성 또는 정착 액의 금액 또는 고정 시간)의 최적화가 필요할 수 있습니다.

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결과

해 부 개발 후 각 조직의 RNA 추출 뒤에 RT-PCR 유전자 발현을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또는 immunohistochemistry 프로토콜을 통해 식이 패턴, 그리고 하위 세포질 유전자의 지역화를 확인 하기 위해 취할 수 있습니다. 관심입니다. 이 섹션에서 우리는 어느 프로토콜에서 대표적인 결과 제시. 그림 1 은 대표적인 양적 RT-PCR 야생-타입 성인 안테나에 세포 표면 수용 체와 후 각 수용 체 유전자의 전사를 보여주는. 그림 2 는 6-8 h 고 Rn EGFP 유전자 변형에 12 h APF 더듬이 디스크 stainings를 사용 하 여 안티-GFP (1:1000)와 안티 lamin 항 체 (1: 100) (그림 2A 와 2B

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토론

이 프로토콜은 실험실 초파리 에 걸쳐이 프로그램의 비교 분석으로 초파리 의 후 각 조직 개발에서 유전과 transcriptional 프로그램을 식별 하는 데 관심이 대 한 유용한 리소스 종입니다. 다른 발달 단계에서 시스템 수준 transcriptional 프로필 미래 연구를 위한 뇌관으로 필요한 경우 특히 유용 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 단계 및 개발에 사용 될 터미널 차별화를 모방 하는 사전에서 후 각 시스템 개발의 4 가지 핵심 단계에서 샘플을 얻기 위해 초파리 에서 후 각 조직 분리 하는 방법을 보여 줍니다. 분자 및 면역 조직학 연구입니다. 초파리 해 부 더듬이 디스크와 다른 번데기 단계에서 안테나 양적 RT-PCR에 의해 RNA-seq 하 여 시스템 수준에서 또는 개별 유전자의 수준에 후 각 시스템 개발 중 유전자 식 프로필을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 샘플 조직-특정 유전자 발현의 vivo에서 패턴을 식별 하 immun...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 즐겼다 C. 볼 칸 (뎁-1457690)에 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10X 인산염 완충 식염수Gibco70011-044RNase free water
CO2 tankAir GasCD R200
Two sharp tysections (Dumont #55)Fine Science Tools11255-20
TrizolInvitrogen15596-026RNA 분리 솔루션
해부 현미경
이 들어 있는 작은 양동
1X PBS
55mm 여과지Whatman1001-055물에 적셔 번데기를 촉촉하게 유지하기 위해 페트리 접시에 넣
25 C 인큐베이터
탈이온화 H2O뉴클레아제를 구입하거나 DEPC
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트Dow CorningTerizaki 플레이트 커버에서 해부 패드를 만드는 데 사용됩니다.
뚜껑이 있는 MicroWell Mini Tray Nunc438733Lids는 실리콘 해부 패드를 만드는 데 사용할 수 있습니다.
Rabbit anti-GFP 항체MBL international corporPM005primary antibody
Mouse anti RAT CD2AbD seroTecMCA154RHDLprimary antibody
ADL195 (anti lamin, mouse)Dev studies hydoma banADL195-sprimary antibody
알렉사 플루오® 488 염소 항토끼 IgG (H+L)invitrogenA110082차 항체
Cy3 염소 항마우스 IgGJackson ImmunoResearch115-166-0032차 항체
Triton X-100, 단백질 등급 세제, 10% 용액, 멸균 여과CALBIOCHEM648463세제
Lab RotatorThermo scientificRotator
Nuclease Free WaterGrowcells.comNUPW-0125워터
라이트-듀티 티슈 와이퍼VWR82003-822청소용 해부 용품
Superscript IIinvitrogen18064014Reverse Transcriptase 
QIAshredder (50)RNA 추출QIAGEN79654
Oligo(dT)12-18 PrimerRTlife technologies
18418012 RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)RNA 추출QIAGEN74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)qPCRRoche04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER qPCRRoche06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96qPCRRoche
04729692001 NEBNext 고충실도 2X PCR 마스터 믹스qPCRNEBM0541S
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참고문헌

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  12. Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
  13. Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).

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