주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석

Summary

여기, 우리는 무대와 초파리 종에서 후 각 조직 개발 해 부 프로토콜을 제시. 있으 나 해 부 조직 immunohistochemistry 또는 제자리에서 같은 비보에 분석 뿐만 아니라 양적 RT-PCR (반전 전사-연쇄 반응) 또는 시퀀싱 (RNAseq), RNA와 같은 분자 분석에 대 한 나중에 사용할 수 있습니다. 교 잡입니다.

Abstract

초파리 의 후 각 시스템 발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동과 행동 진화에 널리 사용 되는 시스템이입니다. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경 이외에 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 프로토콜에서 우리는 성인 초파리 종의 주변 후 각 조직 개발의 해 부를 설명 합니다. 우리는 처음 무대 초파리 애벌레, 중순에 번데기 단계와 성인에서 안테나의 해 부에 의해 따라 초기 번데기 단계에서 더듬이 디스크의 해 부를 이어서 나이 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 어디 준비 qRT-PCR, RNAseq, 또는 immunohistochemistry RNA 추출 등 분자 기법에 활용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 적용할 수 있습니다 또한 다른 초파리 종 종의 번데기 개발 시간, 결정 하 고 각 단계는 적절 한 노화에 대 한 계산 됩니다.

Introduction

발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동 연구, 그리고 행동 진화^{1,2,3, 초파리 의 후 각 시스템은 널리 사용 되는 시스템 4}. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경^1,,56외 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 원고의 전반적인 목표는 무대 초파리 종의 번데기 및 성인 후 각 조직 개발 해 부 하는 방법을 보여 줍니다. 이 기술에 대 한 근거 또한 vivo에서 조직 기술 라벨 샘플 RNAseq 등 정량적 RT-PCR, 주변 후 각 시스템의 분자 및 발달 분석에 대 한 다른 번데기 단계에서 생성 하는 . 이 기술은 특정 세포 유형에 대 한 모든 유전자 변형 시 약 하지 않은 비-초파리 melanogaster 종 개발 성인 후 각 시스템에 transcr....

Protocol

다음 프로토콜은 듀크 대학 연구 윤리 위원회에 의해 설립 된 윤리 지침과 일치.

1. 조직 준비와 초파리 melanogaster 번데기의 개발 준비

1. 첫째, 얼마나 많은 파리 해 부 할 것입니다 확인 합니다. RT-PCR 및 RNAseq, prepupal, 8 h APF, 40 h APF, 및 성인 단계에서 필요한는 개인에서 100-200 더듬이 디스크와 안테나를 수집 합니다. Immunohistochemistry, 10-20 개인을 해 부.
2. 해 부 패드와 집게, 물티슈를 사용 하 여 70%를 포함 하 여 모든 물자를 청소 EtOH. 해 부 물자는 RNA 추출에 사용할 수, RNase neutralizers와 모든 것을 깨끗이 nuclease 무료 사용 하는 모든 솔루션을 경우 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 물 처리.
   참고:이 프로토콜은 해에 대 한 유리 대신 실리콘 해 부 패드 사용합니다. 실리콘 패드 초 미세 집게를 친절 하 고 신속 하 고 높은 품질의 해를 홍보.
3. 0 h APF/prepupal 단계에서 번데기를 수집 합니다.
   1. 가장 정확한 준비 되도록 30 분 1 시간 간격에서 애벌레를 모니터링 합니다.
      참고: 적당히 붐비는 ....

Results

해 부 개발 후 각 조직의 RNA 추출 뒤에 RT-PCR 유전자 발현을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또는 immunohistochemistry 프로토콜을 통해 식이 패턴, 그리고 하위 세포질 유전자의 지역화를 확인 하기 위해 취할 수 있습니다. 관심입니다. 이 섹션에서 우리는 어느 프로토콜에서 대표적인 결과 제시. 그림 1 은 대표적인 양적 RT-PCR 야생-타입 성인 안테나에 세포 표면 수용 체와 후 각 수용 체 유전자의 전사를 보여주는. 그림 2 는 6-8 h 고 Rn EGFP 유전자 변형에 12 h APF 더듬이 디스크 stainings를 사용 하 여 안티-GFP (1:1000)와 안티 lamin 항 체 (1: 100) (그림 2A 와 2B

Discussion

이 프로토콜은 실험실 초파리 에 걸쳐이 프로그램의 비교 분석으로 초파리 의 후 각 조직 개발에서 유전과 transcriptional 프로그램을 식별 하는 데 관심이 대 한 유용한 리소스 종입니다. 다른 발달 단계에서 시스템 수준 transcriptional 프로필 미래 연구를 위한 뇌관으로 필요한 경우 특히 유용 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 단계 및 개발에 사용 될 터미널 차별화를 모방 하는 사전에서 후 각 시스템 개발의 4 가지 핵심 단계에서 샘플을 얻기 위해 초파리 에서 후 각 조직 분리 하는 방법을 보여 줍니다. 분자 및 면역 조직학 연구입니다. 초파리 해 부 더듬이 디스크와 다른 번데기 단계에서 안테나 양적 RT-PCR에 의해 RNA-seq 하 여 시스템 수준에서 또는 개별 유전자의 수준에 후 각 시스템 개발 중 유전자 식 프로필을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 샘플 조직-특정 유전자 발현의 vivo에서 패턴을 식별 하 immun.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X 인산염 완충 식염수	Gibco	70011-044	RNase free water
CO2 tank	Air Gas	CD R200
Two sharp tysections (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA 분리 솔루션
해부 현미경
이 들어 있는 작은 양동
			1X PBS
55mm 여과지	Whatman	1001-055	물에 적셔 번데기를 촉촉하게 유지하기 위해 페트리 접시에 넣
25 C 인큐베이터
탈이온화 H2O			뉴클레아제를 구입하거나 DEPC
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Dow Corning		Terizaki 플레이트 커버에서 해부 패드를 만드는 데 사용됩니다.
뚜껑이 있는 MicroWell Mini Tray Nunc		438733	Lids는 실리콘 해부 패드를 만드는 데 사용할 수 있습니다.
Rabbit anti-GFP 항체	MBL international corpor	PM005	primary antibody
Mouse anti RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	primary antibody
ADL195 (anti lamin, mouse)	Dev studies hydoma ban	ADL195-s	primary antibody
알렉사 플루오® 488 염소 항토끼 IgG (H+L)	invitrogen	A11008	2차 항체
Cy3 염소 항마우스 IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	2차 항체
Triton X-100, 단백질 등급 세제, 10% 용액, 멸균 여과	CALBIOCHEM	648463	세제
Lab Rotator	Thermo scientific		Rotator
Nuclease Free Water	Growcells.com	NUPW-0125	워터
라이트-듀티 티슈 와이퍼	VWR	82003-822	청소용 해부 용품
Superscript II	invitrogen	18064014	Reverse Transcriptase
QIAshredder (50)	RNA 추출	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies
18418012 RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)	RNA 추출	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96	qPCR	Roche
04729692001 NEBNext 고충실도 2X PCR 마스터 믹스	qPCR	NEB	M0541S