녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

Summary

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

Abstract

박테리아, 다양 한 식물 질병의 원인이 되는 가장 중요 한 에이전트 중 하나는 호스트 식물 세포 식물 면역 체계를 파괴에 effector 단백질의 집합을 분 비. 감염 시 세포질 이펙터 유형 III 분 비 시스템 (T3SS)를 통해 호스트 cytosol에 전달 됩니다. 식물 세포에 배달, 후에 effector(s) 생존 및 병원 체의 복제에 대 한 호스트 세포 프로세스를 변조 하는 것 특정 compartment(s) 대상. 비록 pathogenicity에 형광 단백질을 사용 하 여 그들의 기능을 이해 하는 호스트 셀에 effector 단백질의 subcellular 지역화의 박테리아에서 직접 주입 하는 이펙터의 역학 조사에서 일부 연구 하고있다 T3SS와 형광 단백질 간의 비 호환성으로 인해 도전 하고있다.

여기, 우리가 호스트 셀에서 세균 T3SS 통해 전달 하는 이펙터의 지역화를 시각화 하기 위해 최적화 된 분할 superfolder 녹색 형광 단백질 시스템 (sfGFP^OPT)의 최근 우리의 방법을 설명 합니다. sfGFP11 (11^번째 β 물가의 sfGFP)-태그 이펙터는 T3SS을 통해 분 비 사이트에서 형광 방출에 표적으로 하는 특정 세포 기관이 sfGFP1-10^선택 (1-10^번째 β 물가의 sfGFP) 행간 조립 될 수 있다. 이 프로토콜 애기 Nicotiana benthamiana 식물에 특정 세포 기관이에 슈 도모 나 스 syringae 에서 effector 단백질으로 재구성된 sfGFP 형광 신호를 시각화 하는 절차를 제공 합니다.

Introduction

식물은 수많은 침입 병원 체 포함 박테리아, 곰 팡이, 바이러스, 곤충 및 nematodes 그들의 수명 주기 동안 발생 하는 착 유기 체. Phytopathogens, 중 녹 종 등 Ralstonia 종, 그램 음성 세균성 병원 체 상처 또는 stomata 및 hydathode 같은 자연 구멍을 통해 입력 하 여 그들의 호스트 식물을 감염¹. 성공적으로 호스트 식물 식민지로 세균성 병원 균 독성 요인²의 다양 한 개발을 진화 했다. 박테리아는 기 주 식물을 침공, 그들은 일련의 독성 단백질 주사-이펙터로 알려진-그들의 pathogenicity 홍보를 식물 세포에 직접. 이 이펙터 억제 또는 공장 타고 난 면역을 조절 하 고 세균 생존³결과 호스트 세포 프로세스를 조작.

병원 성 박테리아는 주로 호스트 셀⁴에 직접 효과 기 단백질을 제공 하는 T3SS를 사용 합니다. T3SS는 호스트 셀⁵의 사출 사이트 내부와 외부 세균 막 비 계 단백질 구조에서 연결 바늘 같은 채널 분자 주사기를 유사 합니다. 이 이펙터 T3SS 중재 (T3E) 분 비 메커니즘은 인간 뿐만 아니라 식물의 다양 한 그램 음성 세균성 병원 체에 잘 보존. 대표적인 식물 병원 체, P. syringae pv 중 하나입니다. 토마토 DC3000 hrcC 돌연변이 일반적으로 결함이 있는 T3SS 완전히 억제 식물 면역 (effector 단백질을 주입)에 의해⁶에이 돌연변이의 무 능력으로 인해 식물에 성장을 제한 했다. 호스트 세포로 전, 시 이펙터 대상 다양 한 호스트 단백질 등 식물 방위 응답, 유전자 전사, 세포 죽음, 프로테아좀, 소포 매매, 호르몬 경로⁷ 호스트 셀 시스템에 대 한 중요 한 ^{, 8 , 9 , 10}. 따라서, 추적 호스트 셀에 effector 단백질의 세포질 지 방화의 식물 면역의 변조에 관하여 그들의 기능을 이해 하는 매력적인 대상 이다.

T3Es의 지역화 연구의 대부분 Agrobacterium-중재 overexpression 호스트 식물⁹큰 형광 단백질으로 고용 했다. 그러나, 다른 종에 도입 된 유전자의 분리 식 방법 잘못 지역화 된 또는 때때로 작동 하지^11,,1213되도록 표시 되었습니다. 또한, 여러 연구 결과 세균성 이펙터는 호스트 셀^14,15,,1617에서 적절 한 대상에 대 한 수정 받을 밝혔다. 따라서, 세포 기능 또는 양적 이펙터 병원 체 감염¹⁸시 T3SS에 의해 전달 되는 동일 하지 않을 수 있습니다 식물의 cytosol에서 이펙터 뚜렷이 표현. 또한, 대형 형광 태그 effector 단백질의 융합 적절 한 이펙터 배달 및 시각화^18,19중단 될 수 있습니다. 따라서, T3E 함수 분석에이 접근 T3SS 분 비 이펙터의 네이티브 지역화를 완벽 하 게 반영 되지 않을 수 있습니다.

녹색 형광 단백질 (GFP)²⁰발 색 단 포함 하는 중앙 물가 포함 하는 11-배가 좌초 하는 β-배럴의 구성 됩니다. Waldo 외. 작은 부품으로 구성 된 새로운 분할-GFP 시스템을 보고 (GFP β 물가 11; GFP11)와 대형 보완 조각 (GFP β 물가 1-10; GFP1-10)²¹. 조각을 스스로 형광 하지 않습니다 하지만 두 조각을 서로 가까운 근접에 있을 때 그들의 자기 협회에 형광. 단백질 접히는 효율성의 최적화에 대 한 강력한 접는 변종 GFP, 즉, sfGFP 및 sfGFP^선택, 이후에 분할 GFP 시스템^20,,2122개발 되었다. 최근, 단일 아미노산 돌연변이 sfGFP1-10^선택-sfYFP1-10^선택 및 sfCFP1-10^선택-을 각각 sfGFP11 조각와 쇼 노란색과 청록색 형광 reconstitute 수, 생성 된^{23의 변형} . 또한, sfCherry, mCherry의 파생 분열 될 수 있다 sfGFP²³와 같은 방식으로 sfCherry11와 sfCherry1-10 조각으로.

이 시스템은 고 살 모 넬 라²⁴. 에서 이펙터를 사용 하 여 감염 동안 추적 하는 HeLa 세포에서 T3SS 이펙터에 맞게 되었습니다. 그러나, 그것은 이전 하지 최적화 호스트 식물 세균성 병원 체 시스템에 대 한. 최근에, 우리는 식물 세포²⁵에 P. syringae 에서 전달 하는 T3Es의 subcellular 지 방화를 모니터링 하는 데 향상 된 sfGFP1-10^선택 에 따라 분할 GFP 시스템 최적화. 식물 세포, 유전자 변형 애기 thaliana 집합에에서 다른 subcellular 구획을 T3Es의 지역화 연구를 촉진 하기 위하여 식물 다양 한 subcellular 구획 ^{에서에서 sfGFP1-10OPT 를 표현 하기 위해 생성 된 25}. 또한, 다양 한을 운반 하는 플라스 미드 세포 기관이 대상 sfGFP1-10^선택 Agrobacterium에 대 한-중재 과도 overexpression 이펙터 T3SS 기반 배달에 대 한 sfGFP11 태그 벡터 또한 생성 했다. 다양 한 유전자 변형 애기 라인과 관심의 T3Es을 표현 하는 플라스 미드의 씨앗 테이블의 자료^26,27에서 언급 한 소스에서 얻을 수 있습니다.

다음 프로토콜에서 우리는 분할 sfGFP 시스템을 사용 하 여 호스트 세포에 박테리아에 의해 전달 하는 이펙터의 역학을 모니터링 하는 최적화 된 시스템을 설명 합니다. SfGFP1-10^선택 유전자 변형 녹 sfGFP11 재조합 플라스 미드를 들고와 표현 하는 식물의 감염 호스트 셀으로 모나 스 에서 sfGFP11 태그 이펙터의 전달 결과. 따라서, 이러한 단백질 재구성 되 고 특정 이펙터 대상 compartment(s)에 이동. 슈 도모 나 스 syringae pv입니다. 토마토 18 이펙터 삭제 됩니다, CUCPB5500 스트레인이이 스트레인 A. thaliana 및 북 아 일 benthamianas²⁸에 낮은 또는 없음 세포 죽음을 보여주 때문에 사용 되었다. 그러나, 모든 자료와 여기에 설명 된 단계 교체 수 있습니다 또는 다른 생물학 질문 또는 지정 된 실험실 조건에서 최적화의 조사를 위해 분할 sfGFP 시스템에 맞게 수정.

Protocol

참고: 모든 단계는 수행 실 온에서 달리 명시 하지 않는 한.

1. 식물 재료 (4 주)의 준비

1. 명. benthamiana 식물에 대 한 준비
   1. 명. benthamiana 의 각 냄비의 토양 표면에 2 씨앗을 뿌리 다, 플라스틱 돔 트레이 커버 및 25 ° C, 16/8-h 명암 photoperiod 사이클 60% 습도 성장 챔버에에서 발 아를 씨를 허용.
   2. 2 주 후, 선택 하 고 각 냄비에 작은 경종을 폐기 단계 1.1.1에서에서 발 아에 대 한 적용 동일한 성장 조건 하에서 식물 성장을 계속. 매 2 일 트레이 당 물 1 리터를 추가 합니다.
      참고: 식물의 성장 조건 실험실에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 건강 한 상태에 있는 식물을 성장 하는 일반 급수 프로토콜을 따릅니다.
   3. 일주일에 새로운 용지함에 식물을 전송 하 고 추가 성장 위한 충분 한 공간이 그들을 주선. 계속 그들은 나이의 4 주에 침투 될 준비가 될 때까지 단계 1.1.1에서에서 설명한 조건 하에서 식물 성장.
      참고: 식물 성장 연구소에서 성장 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로, 우리는 그 4 주 된 찾을 명. benthamiana 식물 약 6 잎 곰.
2. A. thaliana 유전자 변형 식물에 대 한 준비
   1. 테이블의 자료 를 참조 하 고 유전자 변형 애기 씨앗 주문.
   2. 1 mL의 증류수에 50-100 유전자 변형 애기 씨를 담근 다 고 발 아의 발병을 동기화를 어둠 속에서 3 일 동안 4 ° C에서 그들을 저장 합니다.
   3. 플라스틱 돔 트레이 커버와 플러그 공장 트레이의 토양 표면에 2 ~ 3 씨를 뿌리 다. 23 ° C, 10/14-h 명암 photoperiod 사이클 60% 습도에서 발 아 씨앗을 허용 합니다.
      참고: 씨앗 homozygotes 이어야 한다입니다. 그러나, 일괄 처리에 있는 transgene의 존재를 재확인 하는 것이 좋습니다. 이 경우에, 2 분, 표 백제 50% 70% 에탄올으로 세척 하 여 씨앗을 소독 (약 2% 차 아 염소 산) 5-6 시간 살 균 두 배 증류수 (ddH₂O)로 세척 하 여 5 분에 대 한 triton X-100 따라 0.05%를 포함 하. 살 균 후 4 ° C에서 3 일 동안 충 하 고 유전자 변형 식물 선택 hygromycin B의 25 µ g/L를 포함 하는 식물 발 아 미디어에 접시.
   4. 주 후에, 플러그 당 하나의 공장 두고 단계 1.2.3 사용 동일한 성장 조건 하에서 식물 성장을 계속.
      참고: 4 주 오래 된 식물 P. syringae 감염을 위해 사용 되었다. 물 식물 매일 식물의 건강을 유지.

2. 모나 스 문화 (~ 1 주)의 준비

1. 모나 스 변환에 대 한 플라스 미드의 건설
   1. 테이블의 자료 를 참조 하 고 이펙터 T3SS 기반 배달 시스템 벡터²⁵의 원하는 vector(s)를 주문.
   2. 사이트별 재결합²⁵복제를 사용 하 여 이펙터 배달 벡터에 관심의 이펙터 유전자를 삽입 합니다.
      참고: 전체 길이 effector 단백질의 subcellular 지 방화, 모니터링 넣어에 전장 유전자 pBK-GW-1-2 또는 pBG-GW-1-2. 그것은 또한 pBK-GW-1-4를 선택할 수 또는 pBG-GW-1-4 포함 된 2에 대 한 x sfGFP11 증가 형광 신호. 신호 펩 티 드 부족 부분 이펙터, 경우 pBK-GW-2-2 또는 pBK-GW-2-4를 사용 합니다. 공원 외. 이펙터 배달 벡터²⁵에 대 한 자세한 내용은 참조 하십시오.
2. P. syringae pv sfGFP11 태그를 융합 하는 이펙터를 들고 플라스 미드를 변환. 토마토 (태평양 표준시) CUCPB5500 표준 electroporation²⁹를 사용 하 여.
   참고: 필요한 경우 다른 녹 종자를 사용할 수 있습니다. SfGFP11 태그 시스템은 벡터³⁰ 의 광범위 한 범위에 대 한 구성 하 고 있는 이펙터의 유전자 발현 비교와 함께, 예를 들어, 슈 도모 나 스 fluorescens (이 단)³¹AvrRpm1 발기인에 의해 규제 됩니다.
3. 임금의 B 한 천 배지 100 µ g/mL 리 팜 피신과 25 µ g/mL 대 또는 25 µ g/mL gentamycin 포함의 표면 변형 된 세균성 세포를 부드럽게 확산. 2 일 동안에 28 ° C를 품 어.
4. 킹의 B 액체 미디어 사용, 벡터에 대 한 적절 한 항생제로 한 식민지를 접종 하 고 200 rpm에서 떨고와 28 ° C에서 하룻밤 세포 성장.
5. 글리세롤 재고를 확인 합니다. 50%-80 ° c.에 게의 최종 농도에 압력가 글리세롤을 추가

3. 과도 식 세포 기관이 대상 sfGFP1-10^선택 북 아 일 benthamiana (4 일)에서

1. Agrobacterium 문화의 준비
   1. 주문 sfGFP1-10^선택 plasmid(s) 세포 기관이 대상의 원하는 vector(s) ( 테이블의 자료를 참조).
   2. plasmid(s) Agrobacterium tumefaciens 스트레인 GV3101 셀³²변환. 2 일 동안 50 µ g/mL 대와 28 ° C에서 50 µ g/mL 리 팜 피신 보충 Luria Bertani (파운드) 한 천 매체에 세포 성장.
   3. 파운드 한 천 매체에 단 하나 식민지에서 50 µ g/mL 대와 50 µ g/mL 리 팜 피신 보충 액체 LB 미디어의 5 mL로 세포를 접종. 200 rpm에서 떨고와 28 ° C에서 하룻밤 세포 성장.
   4. 10 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리 하 여 세포 표면에 뜨는 미디어에서 부와 갓의 1 mL에 펠 릿을 resuspend 수확이 했다 침투 버퍼를.
   5. 600의 흡 광도에서 광학 밀도 (OD) 값을 얻어서 Agrobacterium 의 수량을 측정 nm (Abs 600 nm). 0.5 침투 버퍼와 함께 박테리아의 세₆₀₀ 조정 합니다.
      참고: 서 스 펜 션의 1 mL 두 개의 관광 명소에 침투 하기 충분 하다.
   6. 실 온에서 문화를 침투 하기 전에 1-5 h에 대 한 부드러운 로커에 둡니다.
   7. 10 µ L 팁으로 침투 하는 나뭇잎의 중심에 구멍을 찌른. 1 mL needleless 주사기를 사용 하 여 침투 Agrobacterium 정지. 신중 하 고 천천히 주사 약 500 µ L 주사기를 통해 잎 adaxial 측면에 3.1.5 단계에서 준비 하는 정지의. 실험적인 복제에 대 한 적어도 3 개의 다른 식물에 침투를 반복 합니다.
      참고: 건강과 안전 이유를 위해 눈 보호 침투 동안 착용 되어야 한다.
   8. 잎에 남아 있는 세균 현 탁 액 떨어져 닦 고 침투 지역의 경계를 표시.
   9. 2 일 동안 단계 1.1.1 사용 동일한 성장 조건 하에서 침투 식물 유지.

4. 접종의 모나 스 (4 일)

1. 2 일 동안 28 ° C에 적절 한 항생제와 킹의 B 천 미디어에 2.5 단계에서 글리세롤 재고에서 행진 변형된 녹 스트레인.
   참고: 녹 의 건강이 매우 중요 합니다. 식민지를 잘 형성 하지 않는다, 세포를 다시 행진 또는 진행 하기 전에 임금의 액체 매체에 있는 셀을 전파.
2. 마 니 톨 조미료 (MG) 액체 미디어 28 ° C에서 하룻밤을 위해 200 rpm에서 떨고 있는 녹 셀의 loopful 접종
3. 수확 10 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리에 의해 셀 부 표면에 뜨는 미디어 어 펠 릿 10 mm MgCl₂, resuspend 고 명 benthamiana 잎 및 0.002 (1 x 10⁶ 세₆₀₀ 0.02 (1 x 10⁷ cfu/mL)을 조정 cfu/mL) 애기 단풍. 에 대 한
4. 명. benthamiana에 대 한 녹 서 스 펜 션 sfGFP1-10^선택 구문을 들고 Agrobacterium 이전 (3.1.7 단계)에서 2 일을 침투 했다 잎의 영역으로 침투. sfGFP1-10^선택 유전자 변형 애기, 대 두 4 주 오래 된 짧은 하루 성장 잎으로 녹 서 스 펜 션에 침투.
   참고: 적어도 3 개의 식물 실험 복제 필요 합니다.

5. sfGFP 신호 Confocal 현미경 검사 법 (1 일)을 통해 관찰

1. 녹에서 잎 디스크 잘라-잎을 주사. 모나 스의 침투 후 특정 시간 점에, 40 X confocal 시스템 스캐닝 레이저를 사용 하 여 단일 공장에서 두 개의 2 cm² 잎 디스크 이미지 / 1.2 나 C-Apochromat 물 침수 목표 또는 63 / 0.8 X 나 C-Apochromat 기름 침수 목적입니다. 부상에 의해 살해 하는 죽은 세포를 방지 하려면 침투 구멍에서 세포를 관찰 합니다.
2. 488 nm 아르곤 레이저의 저전력 설정에서 관측을 시작 합니다. 레이저 파워 sfGFP 탐지를 증가.
   참고: 우리가 일반적으로 형광 신호를 찾으려면를 레이저 강도의 2-15%를 사용 합니다. 그러나, 레이저 파워와 검색 설정을 조정 해야 사용자의 현미경 시스템에 따라. 여기, 방출 필터 520-550 nm로 설정 했다. 죽은 세포는 종종 488 nm 레이저 여기 아래 자동-형광 방출. 따라서, 부정적인 컨트롤 sfGFP11 태그를 하지 않고 같은 이펙터 침투 하 고 동일한 관측 조건 하에서 관찰 될 해야 합니다. 또한, 높은 레이저 여기 엽록소 autofluorescence를 유도할 수 있다. 따라서 엽록소 autofluorescence 유도를 하지 않도록 제어 식물 세포를 사용 하 여 레이저 강도 조정 합니다.
   1. 세포 벽의 counterstaining에 대 한 리프 디스크 관찰 전에 5-10 분에 20 m m propidium 요오드 화물 (PI)을 침투.
   2. 얼룩이 핵에 대 일 분 뒤에 물으로 세척 하 여 0.1 %paraformaldehyde 리프 디스크 잠수함. 그런 다음, 10mm, PI 리프 디스크 현미경 관찰 하기 전에 5-10 분에 침투. 실험 3 번 이상 반복 합니다.
      참고:이 단계는 아닙니다 중요 하지만 원형질 막 또는 핵에 이펙터 지역화를 정의 하는 데 도움이. 관심의 이펙터에 특정 세포 기관이 그들의 지역화 면, 주어진된 세포 기관이 대 한 마커를 사용 하 여는 이펙터의 지역화를 확인.

Results

GFP의 β 배럴 구조 11 β 물가의 구성 이며, 두 조각, 1-10^번째 가닥 (GFP1-10^선택)와 11^일 (GFP11) 가닥으로 나눌 수 있습니다. 비록 둘 다 2 개의 파편 스스로 형광의 자기 조립된 sfGFP 근접 (그림 1A)에 존재 하는 2 개의 파편 때 형광을 내보낼 수 있습니다. 이 시스템에서는, sfGFP1-10^선택-식물 녹 sfGFP11 태그 이펙터를 들고와 주사는 애기 명. benthamiana 를 표현. 호스트 셀의 cytosol로 모나 스 에 의해 전달 sfGFP11 태그 이펙터는 cytosol에서 표현 sfGFP1 10^OPT 를 재구성 하 고 대상 구획 (그림 1B)에 함께 이동...

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜 모니터링 호스트 식물 세포 감염 시 세균 T3SS에 의해 주입 하는 effector 단백질의 정확한 지역화에 사용 됩니다. 이전, 분할 GFP 시스템 포유류 단백질^23,36의 subcellular 지 방화, 살 모 넬 라 T3E 지역화, Agrobacterium VirE2 납품에 T4SS 통해 공부 하는 도구로 사용 되었다는 식물 세포³⁷. 식물 세포에서이 시스템을 적용, 이전 연구 유전자 변형 옥수수 식물을 constitutively 세포질 GFP1-10과 유전자 변형 균, 표현 Ustilago maydis, GFP11 태그 effector 단백질을 표현 하는 사용. 그러나, 옥수수-미국 maydis 시스템 되지 않았습니다 성공적인 translocated effector 단백질 식 수준의 약한...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidopsis 형질전환 계통			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 효과기의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
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Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 효과기의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene	97387
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sfGFP11 태그가 지정된 T3SS 기반 이펙터 전달 시스템용 Gateway 호환 벡터	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 효과기의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; 카나마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1 : GW : HA-2xsfGFP11 : AvrRpm1t; Kanamycin (25 ug/ml)에 저항하는
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pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1 : AvrRPM1sp : GW : HA-sfGFP11 : AvrRpm1t; 겐타마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1 : AvrRPM1sp : GW : HA-2xsfGFP11 : AvrRpm1t; Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz 및 Jeff Schell에 대한 내성, TL-DNA gene 5의 promoter는 새로운 유형의 Agrobacterium binary vector에 의해 운반되는 chimaeric 유전자의 조직 특이적 발현을 제어합니다. 몰 젠 유전자. 204,383-396 (1986); 겐타마이신(50 ug/ml) 및 리팜피신(50 ug/ml)에 대한 내성
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Pseudomonas syringae pv. 토마토 DC3000 유형 III 분비 효과기 유전자의 레퍼토리에서 결실은 효과기 간의 기능적 중복을 나타냅니다. PLoS 병원. 5 (4) (2009).; 리팜피신에 대한 내성 (100 ug / ml)
< 강> 매체 구성 요소 < / 강력 >
< > 식물 발아 배지 < / 강력 >			2.165g / L Murashige & 추가 Skoog 분말, 물에 10 g/L 자당. pH 5.8로 조정하고 2.2g/L 피타젤을 추가합니다. 자동 가속.
무라시게 & 비타민을 포함한 Skoog 배지	Duchefa Biochemie	M0222	4 >C에 보관하십시오.
설탕	Duchefa Biochemie	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
LB media			10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물, 10 g/L NaCl을 물에 첨가합니다. 고체 매체의 경우 15g/L 마이크로 한천을 추가합니다. 오토클레이브.  용액을 55°C로 식히십시오. C를 선택하고 필요한 경우 항생제를 추가합니다.
트립톤	BD Bioscience	211705
효모 추출물	BD Bioscience	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
Micro 한천	Duchefa Biochemie	M1002
King's B media			10 g/L 프로테아제 펩톤 #2, 1.5 g/L 무수 K2HPO4, 15 g/L의 한천을 물에 넣습니다. 오토 클레이 브. 55도로 식히십시오. C를 선택하고 멸균 15ml/L 글리세롤, 5ml/L MgSO4를 배지에 첨가합니다. 필요한 경우 항생제를 추가하십시오.
프로테오스 펩톤	BD Bioscience	212120
무수 K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glycerol	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Bioscience	214010
<강>만니톨-글루타메이트(MG) 액체 배지			니톨 10g/L, L-글루탐산 2g/L, KH2PO4 0.2g/L, NaCl 0.2g/L<><>를 물에 첨가합니다. pH 7
Mannitol	Duchefa Biochemie	M0803
L-글루탐산	Duchefa Biochemie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
침투 완충액			10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µ M 아세토시링곤. 산도 5.6; 사용하기 전에 새 버퍼를 준비하십시오.
MES	Duchefa Biochemie	M1503	물에 100mM(pH 5.6) 스톡을 준비합니다. 필터는 살균합니다.
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	물에 100mM 스톡을 준비합니다. 오토 클레이 브.
아세토시링곤	시그마-알드리치(Acetosyringone Sigma-Aldrich	) D134406	DMSO에서 150mM 스톡을 준비합니다.
컨포칼 현미경 장비/재료
710 레이저 스캐닝 컨포칼 시스템	Carl Zeiss
Axio observer Z1 도립 현미경	Carl Zeiss
Propidium iodide	ThermoFisher	P1304MP