이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

요약

새로운 두뇌 지구에서 젊은 신경 도전 어떻게 환경 sculpts 신경 운명과 성숙에 중요 한 통찰력을 밝힐 수 있다. 이 프로토콜 interneuron 선구자 특정 두뇌 지역에서 수확 하 고 그들에 게 어느 homotopically를 이식 하는 절차에 설명 합니다 또는 출생 후 새끼의 뇌에 heterotopically.

초록

신경 운명 결정과 성숙 유전 프로그램 및 환경 신호 사이 복잡 한 상호 작용을 요구 한다. 그러나,이 분화 과정을 조절 하는 외부 메커니즘 대 내장의 역할 disentangling 모든 발달 neurobiologists에 대 한 수수께끼 이다. 이 문제는 GABAergic 수, 과도 미 발달 구조에서 태어나 고는 telencephalon 걸쳐 분산 수와 철새 단계를 받아야 하는 매우 다른 유형의 세포 인구에 대 한 확대 됩니다. 어떻게 다른 두뇌 환경 영향 interneuron 운명과 성숙 탐험, 우리 붙일 레이블된 미숙한 interneuron 선구자 신생아 쥐 (P0-P2)에 있는 특정 한 두뇌 지역에서 수확에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 이 나이에, interneuron 마이그레이션이 거의 완료 되 고이 세포는 상대적으로 작은 시 냅 스 통합 된 그들의 마지막 휴식 환경에 거주 하는. Cytometry 통해 단일 셀 솔루션의 컬렉션, 다음 이러한 interneuron 선구자 P0-P2 wildtype 출생 후 새끼로 이식 됩니다. 두 homotopic 수행 하 여 (예를 들어, 피 질-피 질) 또는 heterotopic (예, 피 질-해 마) 이식, 수 평가 새 뇌 환경에 미 숙 수 도전 미치는 그들의 운명, 성숙, 그리고 회로 통합. 두뇌는 성인 쥐에 수확 될 수 있으며 immunohistochemical를 포함 하 여 이식할된 셀에 posthoc 분석의 광범위 한 분석 electrophysiological 및 transcriptional 프로 파일링. 이 일반적인 접근 방식을 제공 합니다 어떻게 가지 두뇌 환경 분석 결과를 전략 수 있습니다 신경 개발의 많은 측면에 영향을 미칠 수 사와 특정 신경 특성은 주로 내장 돼 유전자 프로그램에 의해 구동 확인 또는 환경 단서입니다.

서론

적절 한 대뇌 피 질의 기능 필요 흥분 성의 프로젝션 뉴런을 억제 GABAergic 수, 명료한 형태학, electrophysiological 속성, 연결 된 매우 이질적인 인구 사이 균형 및 neurochemical 마커입니다. 비정상적인 개발 및 기능 수 (및 특정 interneuron 하위 그룹)의 정신 분열 증, 자폐증, 간 질^1,2,3등 정신 장애의 pathobiology에 연결 되었습니다. 또한, 이러한 뇌 장애에 연루 된 많은 유전자는 젊은 수⁴농축 강력 하 게. 따라서, interneuron 운명 결정 및 성숙 조절 메커니즘의 이해는 정상적인 개발 및 수많은 뇌 질환의 잠재적인 etiologies 이해 필요 합니다.

개 수는 주로 두 가지 과도 배아 구조, 중간 그리고 꼬리 절 정령에서 태어난 (MGE 및 CGE, 각각). 이러한 postmitotic 세포 (interneuron 선구자)는 telencephalon 걸쳐 분산 그들은 다양 한 회로 통합할 수와 접선 마이그레이션 단계를 받 다. MGE 파생 수 세 크게 겹치....

프로토콜

모든 실험 절차 국립 보건원의 지침에 따라 실시 했다 고 NICHD 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC)에 의해 승인 했다. 아래에 설명 된 프로토콜 활용 Nkx2.1-Cre^{C / +}; Ai9⁺ MGE 파생 interneuron 선구자, 수확 새끼 하지만 어떤 원하는 형광 기자 마우스 라인에서 수행할 수 있습니다. 둘 다 남성과 여성 이른 출생 후 마우스 (P0-P2)는 기증자와 호스트 조직에 대 한 무차별 사용 되었다.

1. 솔루션 준비

1. 자당 인공 뇌 척수 (sACSF) 다음 제조 법 (mm에서 단위)에 따라 준비: 87 NaCl, 26 NaHCO₃, 2.5 KCl, 1.25 NaH₂포₄, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl₂, 10 포도 당, 75 자당 95 %O _{포화 2}, 5% CO₂ pH 7.4 =.
2. 350 mL 순수 ddH₂O 비 커 최종 원하는 볼륨에 따라 채우기 (sACSF의 500 mL에 1-2 담가 충분 해야 한다), 자석 볶음 바 추가 하 고 저 어 접시에 비 커를 놓습니다.

결과

이 프로토콜 이른 출생 후 뇌 (그림 1-2)에서 특정 뇌 영역을 수확, interneuron 선구자의 단일 셀 dissociations 수집 순진한 WT에 다양 한 뇌 영역으로이 세포를 이식 하는 방법을 보여 줍니다. 산 후 새끼 들 (그림 3) Posthoc 분석, interneuron 전조 이식 받은 두뇌 세포 형태학, neurochemical 마커 및 electrophysiological 속성 특성 P30-35 사이 수확 했다. 분석 실험의이 유형은 종종 P21-P30 정상적인 쥐에 사이 수행 됩니다 하지만 이식된 세포의 성숙 해 부/분리 절차 때문에 약간 지연 될 수 있습니다, 추가 5-10 일을 기다리는 것이 좋습니다 이것에 대 한 보상 지연된 성숙입니다. 수행 하는 분석의 유형 두뇌를 수확 하기 위해 적절 한 전략을 쓰게 .......

토론

이 프로토콜의 하나의 중요 한 측면은 세포의 생존을 극대화 이다. 조직과 세포는 항상 얼음 감기 carboxygenated sACSF에서 보장 하는 것은 세포 생존을 촉진 하는 데 필요한입니다. 이 효율적인 해 부와 셀 다양 한 솔루션 및 두뇌 환경 외부 지출 시간의 길이 최소화 하기 위해 분리 전략을 필요 합니다. 뇌 영역 해 부 되 고 이식의 수에 따라 실험의 길이 감소 해 부 또는 이식 단계에서 원조 하는 파트너에 유리할 수 있다. 건강 하 고 강아지의 생존을 보장 하기 위해, 그것은 또한 얼음 마 취 시간 (< 4 분)을 최소화 하 고 이식 절차 동안 빛으로가 열 하는 강아지를 유지 하는 중요 한.

이식된 두뇌에 중요 한 변화 수, 다른 두뇌 수천을 포함 하는 동안 일부 이식할된 셀을 포함할 수 없습니다. 해 부에 대 한 여러 P0-P2 새끼를 결합 하거나 이식 세포 밀도 증가 및 둘 다의 가능성을 향상 시킬 것입니다 이식할된 새끼의 수를 증가 한 수 있는 접목, 수확 하.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화나트륨	시그마	S7653
중탄산나트륨	시그마	S6297
염화칼	시그마	P9541
인산나트륨 일염기	성 시그마	S0751
염화칼슘	시그마	C5080
염화마그네슘	시그마	M2670
포도당	시그마	G7528
설탕	시그마	S7903
뇌 매트릭스	Roboz	SA-2165	선조체 수확 시에만 필요
파인 포인트 Dumont 집게	Roboz	RS-4978
미세 해부 가위	Roboz	RS-5940
면도날	ThermoFisher	12-640
파스퇴르 피펫	ThermoFisher	1367820C
Nanoject III	Drummond	3-000-207
수동 조작기 w/ 스탠드	World Precision Instruments	M3301R/M10
5ml 둥근 바닥 플라스틱 튜브	ThermoFisher	149591A
60mm 페트리 접시	ThermoFisher	12556001
100mm 페트리 접시	ThermoFisher	12565100
Pronase	Sigma	10165921001
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16140063
DNase I	Sigma	4716728001
Celltrics 50um 필터	Sysmex	04-0042327
Trypan blue	ThermoFisher	15-250-061
혈구계	ThermoFisher	02-671-6

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