독 독 소 암살자 버그와 다른 Heteropteran 곤충에서 수확

Heteropteran venoms potently 생리 활성 물질¹있습니다. 예를 들어 키스 버그 (Triatominae) 등 침대 버그 (Cimicidae) Heteroptera 혈액 공급의 독/타 액 분 비 hemostasis²를 방해 하 여 수 유를 촉진 한다. 이러한 venoms 독 소는 응고, 혈소판 vasoconstriction, 뿐만 아니라 통증을 포함 하 여 여러 개의 경로 대상 하 고 경로가 렵 게. 대부분 다른 heteropteran 종에서 venoms는 혈액을 먹이 것 보다는 포식을 용이 하 게 적응. 그들의 venoms 마비, 죽음 및 조직 액 무척 추 동물^3,4에 주입 하는 경우 발생할. 척추 동물에 주입 했을 때 그들의 독 또한 과감 한 효과 있을 수 있습니다. 예를 들어 척추로 암살자 버그 Holotrichius innesi 에서 독의 주입 하면 근육 마비 통증과 출혈; 이 버그에 의해 쥐 envenomated 호흡 마비⁵인해 신속 하 게 죽어.

Transcriptomic 및 proteomic 연구 일부 heteropteran venoms의 단백질 구성을 밝혀 있다. Predaceous 종 venoms는 프로 테아 제, 다른 효소, 펩 티 드 및 알 수 없는 구조와 기능^6,,78의 단백질 풍부 합니다. 키스 버그 독 회원 뿌리깊은 영향을 응고, 혈소판, vasoconstriction^2,9triabin 단백질 가족에 풍부 하다. 그러나, 그것은 어떤 독 소 기초 독의 대부분 bioactivities 알 수 없습니다. 예를 들어 키스 버그 Triatoma infestans 의 독은 진통 및 나트륨 채널¹⁰, 억제 알려졌다 하지만 책임 구성 요소 해명 될 남아 있다. 마찬가지로, 그것은 암살자 버그 독의 어떤 컴포넌트 마비 또는 통증 원인이 알려져 있지 않다. 특정 독 bioactivities과 특성화 구조와 기능, 소설 독 독 소의 독 소를 식별 하는 데 필수 독을 얻는 이다.

독을 통해^{5,6,7,8,11,,1213}, 방어의 도발에 의해 heteropterans에서 얻은 되었습니다. 응답^4,8, 기계적으로 흉부^12,,1415,16, 독 샘^{8,17 개 해 부를 당기고 ,18,19,20,,2122}및²³muscarinic 아 세 틸 콜린 수용 체 촉진제의 응용 프로그램. 두 개의 별도 루멘, 앞쪽 주요 동맥 (AMG) 및 후부 주요 동맥 (PMG), 주요 동맥을 이루어져 있는 heteropteran 독 샘의 형태에 의해 복잡 잠재적인 장단점 어떤 방법의 판단으로 부속 선 (AG) 관련. 이러한 다른 선 구획 생산 다른 단백질 분 비 물, 먹이 캡처, 여분 구두 소화^8,17, 국방 등 다양 한 생물 학적 기능에 대 한 전문화 될 수 있습니다. Peiratine 및 ectrichodiine 자 객 버그는 AMG 먹이 캡처 및 여분 구두 소화¹⁷PMG와 연결 되었습니다. 그러나,는 harpactorine에서 버그 Pristhesancus plagipennis 는 PMG는 전문 먹이 캡처 및 소화는 AMG 방어 독⁸분 비 가설 하는 반면. AG은 암살자 버그⁸ 에서 약간 분 비 기능을가지고 또는 거 대 한 물 버그²³protease 스토리지의 주요 사이트 설명 하고있다. 명확 하 게, 추가 작업은 다양 한 heteropteran 하위 그룹 중 각 선 구획의 기능을 명확히 하 고 대부분 독이 독 소의 기능을 결정 하는 데 필요한. 이 보고서에서 우리는 독 독이이 목표를 향해 heteropterans에서 수확에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

이 프로토콜와 책임 관리 하 고 교육 및 연구에 있는 동물의 사용 (PPL 4.20.11)으로 국민 건강 및 의료 연구 위원회의 치료에 대 한 호주 코드 및의 사용에서 밖으로 설정 하는 퀸즐랜드 대학 정책 준수 과학적 목적을 위해 동물 (8^일 에디션 2013).

주의: 하지 되도록 envenomated 암살자 버그를 처리할 때 처리. 방어 독 침 종 처리 때 눈을 보호 하는 것을 주의. 통해 처리 실험 동물을 다치게 하 하지. 고무 밴드 같은 지지대에 압력의 모니터링 및 코 깨진 하지 않음을 보장 포함 됩니다.

참고: 필요에 따라 0.5-2 CO₂ 에 노출에 의해 동물을 anaesthetize 분 또는 독에 수확 전에 4-10 ° C에 냉각 안전 전송 및 구속 1-3를 목표로. Anaesthetization는 엄격 하 게 필요 하지 않습니다 하지만 민첩 한 또는 강한 표본의 안전 규제를 촉진 수 있습니다. 그러나, 동물 독 수확 수 있도록 깨어 있어야 합니다. 프로 테아 제 억제제를 추가 여부를 결정할 때 다운스트림 응용 프로그램 하십시오.

1. 독 독 소 통해에 의해 수확

1. 독 소를 수확 하는 라이브 표본의 얻을.
2. 긍정적이 고 부정적인 전극으로 사용 하 여 미리 준비 된 플라스틱 핀셋 어느 팁에 장착. 전기 족집게는 electrostimulator 또는 전압의 조정을 허용 하는 일정 한 전압 소스를 연결 합니다.
   1. 작은 (~ 10 m m)와 큰 (25 mm) 암살자 버그, 15, 25 V의 피크 전압을 각각 사용 합니다.
   2. 거 대 한 물 버그 등 더 큰 heteropterans에 대 한 최대 40 V를 사용 합니다.
3. 흉부에 고무 밴드를 사용 하 여 플랫폼에 달아서 여 라이브 버그를 제 지.
4. 적합 한 수집 팁에는 코의 끝을 놓습니다. 암살자 버그, P200 피 펫 팁을 사용 합니다. 거 대 한 물 버그에 대 한 조리개의 크기를 늘리기 위해 P200 끝에서 끝을 잘라.
   1. 부드럽게 깨끗 한 핀셋의 닫힌 쌍 코를 리프트와 코의 끝 컬렉션 팁의 개방 조리개를 밀어.
   2. 원하는 경우, 수집에 코를 배치 하기 전에 이해 ~ 5 µ L 초순 팁. 비록 수확된 독이 희석 될 것입니다 팁, 안에 남아 있는 독의 손실이 줄어듭니다.
5. 통해 적용 됩니다. 2.5 M NaCl/50% 글리세롤 등 전도성 젤에 자극 전극을 담근 다. 가슴에 전극을 적용 됩니다. Belostomatids, 2 개의 전극은 머리의 등 쪽 후부 표면에 적용 됩니다.
6. Autodegradation를 방지 하기 위해 독을 저장 합니다. 독 압출 후-20 ° C 또는-60 ° C, 튜브 또는 튜브 프로 테아 제 억제 물 칵테일 포함 된 전송 신속 하 게.
7. 때까지 충분 한 독 인수 또는 아무 더 독은 1.5-1.6 단계를 반복 합니다.

2. 성희롱으로 독 독 소의 수확

1. 독이 수확에 대 한 동물을 준비 하 고 1.1 및 1.3-1.4 하위 섹션에 설명 된 대로 컬렉션 현관에는 코 끝을 배치.
2. 독이 저절로 돌출 되 면 2.3 단계로 이동 합니다. 그렇지 않은 경우에 만져 부드럽게 그것은 다리, 복 부 및 안테나에 핀셋으로 독이 생성 될 때까지 동물을 괴 롭 히.
3. 신속 하 게 원하는 경우 독-20 ° C 또는-60 ° C, 또는 튜브 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일, 튜브에 전송.

3. 독 독 독 "침" 종에서에서 괴롭힘에 의해의 수확

1. Anaesthetize, 또는 부분적으로 anaesthetize, 어떤 조 수 비 침 방지 하기 위해 그것의 케이스에서 그것을 제거 하기 전에 곤충.
2. 독 침을 뱉는 행동을 자극 합니다. 포함 하 고 표준 90 x 16 mm 페 트리 접시의 깊은 뚜껑을 사용 하 여 곤충을 재배치. 잡고 약간 후부 뚜껑과 곤충 비행을 방지 하기 위해 위의 1-4 cm. 대부분의 곤충은 뱉 어 여러 번 자주 빠른 승계에서. 모든 독은 접시의 아래쪽에서 수집 된 확인 하십시오.
3. 초순의 10 µ L로 헹 궈 서 페 트리 접시의 아래쪽에서 독을 수집 합니다. 신속 하 게 전송 그것은-20 ° C 또는-60 ° C, 튜브 또는 튜브를 포함 하는 프로 테아 제 억제 물 칵테일.

4. 수확 동맥 해 부에 의해 독 독

1. 동물을 희생. 무 겁 게 anaesthetize 또는 사용 하 여 동물을 죽 일 > 5 분 노출 CO₂. 동물의 주택 첨부물의 공기 구멍에 직접 순수 CO₂ 를 파이프 합니다.
2. 해 부 트레이 핀 곤충. 암살자 버그에 대 한 복 부 표면 (4.3)을 통해 해 부. 거 대 한 물 버그, 등 쪽 표면 (4.4)을 통해 해 부.
3. 복 부 절 개
   1. 독 샘을 puncturing 없이 벌레를 후부 복 부에 3 개의 핀을 삽입 합니다.
   2. 미니어처 메스를 사용 하 여 복 부의 복 부 표면에는 짧은 중간 절 개를 잘라. 미니어처가 위를 사용 하 여 확장 외 골격만을 잘라내어 내부 구조를 손상 하지 돌 머리에 anteriorly 중간 절 개.
   3. 내부 구조를 노출 하려면 여러 측면 컷 곤충의 측에 중간 절 개에서 확장을 확인 합니다. 그런 다음, 다시 내부 구조를 나타내기 위해 복 부 외 골격의 각 플랩 핀.
   4. 큰 암살자 버그에 대 한 중간 복 부, 이전 복 부, 첫 번째와 두 번째 다리 사이 첫 번째 다리 앞에 4 개의 옆 절 개를 확인 합니다.
4. 지 해 부
   1. 기지 근처에 날개를 제거 합니다. 독 샘을 puncturing 없이 벌레를 후부 복 부에 3 개의 핀을 삽입 합니다.
   2. 미니어처가 위 및 외 골격만을 잘라내어 내부 구조를 손상 하지 돌보는 메스를 사용 하 여 복 부에 머리에서 중간 절 개를 잘라.
   3. 힘 떨어져는 곤충의 두 반쪽. 여러 핀 노출 내부 구멍을 떠나 벌레의 길이 따라 옆으로 놓습니다.
   4. 핀셋을 사용 하 여 비행 근육을 제거 합니다.
5. 해 부 트레이 홍수. 더 쉽게 시각 버그 내부 구조를 플 로트 및 수 있도록 빠져들 때까지 PBS를 추가 합니다.
6. 핀셋과 마이크로-가 위를 사용 하면, 신중 하 게 결합 하 고 신경 조직 및 기관 제거할. 독 샘 길쭉한, 반투명 구조 영양 운하의 각 면을 따라 확장으로 나타납니다.
   1. 앞쪽 및 후부 엽와 2 개의 덕트는 hilus에서 특성의 외관에 의해 주요 동맥을 식별 합니다.
   2. 원하는 경우는 hilus에서 덕트를 추적 하 여 부속 동맥을 식별 합니다. 주요 동맥은 hilus에서 나오는 2 개의 덕트를 절단 하 여 무료.
7. 원하는 선 루멘을 수확. 전송 선 얼음 PBS 또는 PBS의 30 µ L을 포함 하는 microcentrifuge 프로 테아 제 억제 물 칵테일 플러스. 깨끗 한 날카로운 핀 선 창
   1. 10 s 및 원심 분리기 (1 분, 5000 × g, 4 ° C) 동맥 루멘을 소용돌이. 선의 조직 핀셋을 사용 하 여 제거 합니다.
8. 독 소 추출 명확히. 원심 분리기 (5 분, 17000 × g, 4 ° C) 유지 하는 상쾌한 펠 릿 삭제 모든 고체 입자를 제거 하 -20 ° C 또는 autoproteolytic 저하를 방지 하기 위해-60 ° C에 저장 합니다.

Harpactorine P. plagipennis , Platymeris rhadamanthus, reduviine 등 일부 heteropteran 종 안정적으로 독을 통해 (표 1)에 대 한 응답의 대량 (5-20 µ L) 얻을 수 있습니다. 일반적으로, 대부분 peiratine, reduviine, 및 harpactorine 버그 독이이 방법에 대 한 응답에서을 얻을. Stenopodaine 버그 통해 sp. Oncocephalus 하지 Thodelmus sp에서 독을 elicited. 샘플 holoptiline 및 emesine 버그 상당한 독 (예: 충분히 질량 분석에 의해 분석을 위해) 통해에 대 한 응답에서을 생성 하지 않았다. 통해 수확 belostomatid 버그와 약탈 stinkbugs에서 독을 사용할 수 있습니다. 그러나, 통해 물 전갈 (Nepidae)의 코에서 독 보다 두 부 샘만의 내용의 출시를 유도 한다. 독을 통해 일부 수 종에 의해 수확 실패 독 샘과 독8의 릴리스를 제어 하는 생리 적 메커니즘의 형태학 복잡성 때문에 가장 높습니다.

자발적으로 통해, P. plagipennis, Havinthus rufovarius,reduviids, P. rhadamanthus 및 belostomatid Lethocerus distinctifemur, 지 독을 발표 이외에 코에서 독 추출 동안에 처리. 이러한 독 방출 방어 디스플레이 자주 동반 됩니다. P. rhadamanthus 도 뱉 어 독 방어4, 뱀이24 거미25 에 우리가 인지 하지 못하는 다른 reduviid 종에서의 발생 하는 동작.

SDS 페이지과 proteomics 실험 통해과 폭력에 의해 수확 venoms 단백질이 풍부한6,7,8는 보여줍니다. 그것은 또한 가능성이 venoms 무기 이온 및 다른 물질 포함 단백질 소재 현재의 큰 비율에 대 한 계정. 일반적으로 폭력을 통해 얻은 암살자 버그 독 1 백 이상의 펩 티 드 및 단백질 (그림 1, 그림 2)에 포함 되어 있습니다. Belostomatid 독 이전 lysophospholipids13부자가 될 보고 되었습니다. Belostomatine 물 버그 Diplonychus eques 에서 독의 적외선 흡 광도 스펙트럼 단백질 및 lysophospholipids의 콘텐츠와 일치 하는. Lethocerine L. distinctifemur에 대 한 증거는 단백질과 하지 lysophospholipids6에 발견 되었다.

거미 venoms26보고, 독 heteropteran 곤충에서 수확 농도 구성, 사용 하는 곤충과는 수확 방법에 따라 다를 것입니다. 희석된 독 샘플의 UV 분광학 50-250 (10mm 경로 길이)의 undiluted 독, ~ 50-250의 높은 단백질 농도 흡 광도 값 (280) 제안 mg/mL7,,1219. 먹이 부족은 독 집중력과 마비 잠재적인3 로 산도27에 연속 감소 연속 증가 일으키는 원인이 되기 위하여 알려졌다. 그러나, 장기간된 기아 상태와 죽음의 손실 될 것입니다. 농도, 뿐만 아니라 heteropterans 독을 수확은 방법 그것의 구성에 영향을 수 있습니다. 암살자 버그 P. plagipennis 에서 독을의 독 소 성분 통해 또는 괴롭힘8에 의해 수확 하는 여부에 따라 현저 하 게 달랐다. P. plagipennis, 경우이 반면 성희롱 나왔고는 AMG의 내용을 통해 양보는 PMG의 내용 때문에 표시 했다. 독이 얻을 통해, 하지만 하지 성희롱 potently 마비 먹이 곤충 (그림 3). 그러나, 그것은 분명 어느 정도이 결과 다른 침노린재과 또는 다른 Heteroptera에 일반화 될 수 있다.

독 샘을 해 부하 여 직접 독을 수확 피할 수 선 직물 (비 독) 단백질 오염 비용에 독 샘의 제어 메커니즘을 수 있습니다. 관계 없이, 해 부 자료에서 얻은 추출 물 bioactivity/독성 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어 PMG AMG, P. plagipennis, 위의 프로토콜을 사용 하 여 준비의 AG의 추출 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석8을 사용 하 여 분석 되었다. 이 프로세스는 총 182, 114, 및 총, 45, 51, 12 상 상속 독 단백질 putative 가사 단백질으로 분류 하는 나머지 단백질 아미노산 시퀀스 특성에 따라 중 분류 됐다 71 단백질의 확인. 곤충으로 PMG, 하지만 하지 AMG 또는 AG의 추출 물의 주입 결과 마비와 죽음8.

Heteropterans에서 독을 수확 하는 데 사용 하는 방법 중의 표 1: Taxon 특이성

그림 1 : 2D SDS 페이지 명소의 LC-MS/MS 분석 및 독의 HPLC 분수에 의해 감지 하는 단백질에서 수집 P. plagipennis에 통해 (프로토콜 1)에 의해, 풍부한 프로 테아 제, 새끼-도메인 단백질 및 heteropteran 독 가족 1 단백질. (A) 2D SDS 페이지 젤 원유의 P. plagipennis 독, 단백질 가족 LC-MS/MS 젤 명소의 식별 표시. (B) HPLC 크로마 P. plagipennis 독, 보여주는 수집된 분수의 LC-MS/MS 분석에 의해 확인 된 단백질 가족의 분류에서. 허가7재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 시퀀스의 독에서 각 주요 단백질 클래스에 속하는 비율 P. plagipennis입니다. 허가7재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : P. plagipennis 통해, 하지만 하지 성희롱, 여 독 마비 곤충. (A) 통해 또는 괴롭힘, 또는 물, 크리켓 탈출에 여 독이 주입의 효력. 각 독 상태에 대 한 동등한 0.17 µ L 독 upturned 샬레 뚜껑을 탈출 하기 위해 시간과 복 부에 주사 (최대 300 s에서 s, 평균 ± SD) 득점 했다. 통해 P. plagipennis 에서 얻은 독에 의해 탈출 성공의 억제에 대 한 (B) 복용량 응답 곡선. 허가8재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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