진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

요약

이 프로토콜 여러 모델 생물에서 녹음의 품질을 모니터링 하는 새로운 도구와 연구를 제공 합니다.

초록

정확한 전사는 유전 정보의 충실 한 식에 대 한 필요 합니다. 놀랍게도 하지만, 약간 녹음의 품질을 제어 하는 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 과학적 지식에이 격차를 채우기 위해 우리는 최근 Saccharomyces cerevisiae, 초파리 melanogaster, 및 꼬마 transcriptome 걸쳐 전사 오류를 감지 하 원-시퀀싱 분석 결과 최적화 선 충. 이 프로토콜은 전사 오류 진 핵 세포에서의 전사의 품질을 제어 하는 메커니즘 전례 없는 자세히 해명 될 수 있도록 지도 하는 강력한 새로운 도구와 연구를 제공할 것입니다.

서론

게놈 생명의 정확한 생물학 청사진을 제공합니다. 이 청사진을 제대로 구현 하기 좋은 정밀도로 변하게 하는 게놈에 대 한 중요 하다. 그러나, 전사 무료 오류일 가능성이 크다. 예를 들어 RNA polymerases 오류가 시험관에^1,2, 하 긴 알려져 있다 그리고 최근에 그들은 오류에서 vivo에서 뿐만 아니라^3,,56, 커밋 보였다 DNA에 직면 하는 경우에 특히^7,8,,910손상. 함께 찍은, 이러한 관측은 필 사 오류가 발생 지속적으로 모든 살아있는 세포에서 그들은 돌연변이 단백질의 강력한 원천이 될 수 있는 제안 나타냅니다.

Transcriptional mutagenesis 되 나,이 과정에서 두 가지 방법으로 고전 mutagenesis 다릅니다. 첫째, 유전자 변이, 달리 전사 오류 영향을 mitotic 그리고 포스트 mitotic 세포로 DNA 복제에 의존 하지 않는. 전사의 품질에 영향을 주는 메커니즘을 공부 mitotic 그리고 포스트 mitotic 세포의 돌연변이 부하에 대 한 값진 통찰력 제공 따라서. 흥미롭게도, 전사 오류 최근 단백질 집계^11,,1213 의 승진에 연루 되어 고 모두 발암¹⁰ 에 기여할 가설과 항생제 저항 박테리아¹⁴의 개발.

둘째, 유전자 변이, 달리 필 사 오류는 자연에 과도. 그들의 임시 존재 하기 때문에 전송 오류 검출 하기 상당히 어려운 특히 도전 이다. 예를 들어 여러 실험실 transcriptional mutagenesis 연구에 대 한 귀중 한 기자가 분석 실험을 고안 했다, 하는 동안 이러한 분석 전사 오류 컨텍스트 및 모델 생물^4,15의 한정된 된 수에서 측정 수만 있습니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 많은 연구 자들은 RNA 시퀀싱 기술 (RNA-seq), 이론적으로 모든 종의 transcriptome 걸쳐 기록 전사 오류를 수 있는 게 아닙니다. 그러나, 이러한 연구는 반전 녹음 방송 오류, PCR 증폭 오류 등 자체 시퀀싱의 오류가 자연 도서관 건축 유물에 의해 쉽게 혼동 된다. 예를 들어 역 transcriptases 커밋 약 한 오류 모든 ~ 20000 기지 동안 RNA polymerases (RNAPs) 하나의 실수 모든 300000 기지^5,6것으로 예상 된다. 반전 녹음 방송 혼자의 오류율 난쟁이 셀 안에 RNA polymerases의 오류율, 때문에 그것은 전통적인 RNA-Seq 데이터 ( 라이브러리 준비로 인 한 유물에서 진정한 전사 오류를 구별 하는 것이 사실상 불가능 그림 1a).

이 문제를 해결 하려면 우리는 최적화 된 버전 원-시퀀싱 (Cirseq, 또는 C-seq 이제)의 분석 결과^5,16을 개발 했다. 이 분석 결과 사용자를 transcriptome⁵전체 RNA에 전사 오류 및 다른 희소 한 이체를 감지 수 있습니다. 원형-시퀀싱 분석 결과이 분석 결과에 중요 한 단계 주위에 회귀 한다 RNA circularization 때문에이 이름을 수행 합니다. 일단 RNA 대상 circularized는, 그들은 역 같은 RNA 서식 파일의 여러 복사본을 포함 하는 선형 cDNA 분자를 생산 하는 롤링 원 패션에 복사할. 이러한 서식 파일 중 하나에 오류가 있었다면,이 오류 cDNA 분자 내에 포함 된 모든 단일 반복에 것도. 대조적으로, 반전 녹음 방송, PCR 확대, 또는 시퀀싱 오류 무작위로 발생 하는 경향이 하 고 따라서 단 하나 또는 두 개의 반복에 있을 것입니다. 따라서, 각 cDNA 분자에 대 한 합의 시퀀스를 생성 하 여 모든 반복에서 발생 하는 오류에서 임의의 오류를 구별 도서관 건축 유물 효과적으로 진정한 전사 오류 (그림 1b)에서 분리 수 있습니다.

C-seq 분석 결과 정확 하 게 어떤 종의 transcriptome 통해 RNA의 기본 대체, 삽입 및 삭제의 속도 감지를 사용할 수 있는 적절 하 게 사용 하는 경우 (예를 들어 트래버스 및 Ochman¹⁷참조). 예, 우리는 C-seq 분석 결과를 사용 단일 기본 해상도^{5 Saccharomyces cerevisiae, 초파리 melanogaster, 그리고 꼬마 선 충 에서 전사의 오류율의 게놈 넓은 측정을 제공} (관찰 되지 않은). 원래 정확 하 게 RNA 바이러스 인구의 시퀀싱 하는 데 사용, C-seq 분석 결과의 최적화 된 버전이 도서관 건축 유물을 라이브러리 준비 하는 동안 가혹한 조건을 최소화 하기 위해 간소화 되었습니다. 또한, 다양 한 상용 키트를 사용 하 여 분석 결과의 처리량은 크게 개선, 자사의 사용자 뿐만 아니라. 적절 하 게 사용 하는 경우이 분석 결과 정확 하 게 수천 복제, 이전 연구⁶에 그로 인하여 크게 개선 전송 오류를 검색할 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 transcriptional mutagenesis 연구 하는 강력한 도구 이며 사용자 생물의 넓은 범위에서 녹음의 품질을 제어 하는 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.

프로토콜

1입니다. 준비

1. RNases는 편 재; 따라서, 철저 하 게 오염 시 약으로 그것을 아래로 분사 하 여 작업 영역을 청소 (예:, RNase 거리)와 70% 에탄올. 어떤 펫, 펜, 또는 튜브 랙 RNase 오염의 가능성이 소스를 제거 하는 스프레이.
2. 더 않도록 RNases 샘플 오염, 실험 중 실험실 코트 또는 긴 소매 t-셔츠를 착용 합니다. 장갑 및 사용 될 상자 또는 가방에서 그들을 검색 하는 경우에 특히 모든 튜브의 내부 사이의 접촉을 피하십시오.
3. 반전 녹음 방송 전에 글러브를 자주 변경 합니다.
   참고: 최적의 결과 대 할 하지 일시 중지 반전 녹음 방송 전에 실험.

2. 셀 및 동물 문화 및 수집

1. Saccharomyces cerevisiae 성장과 컬렉션
   1. C-seq 도서관 효 모에서 원하는 경우 먼저 S. cerevisiae 의 단일 식민지 중간 포함 효 모 추출 물, 아데닌, 펩, 그리고 포도 당 (YAPD)의 3 mL에 접종 하 고 하룻밤 회전 드럼에 30 ° C에서 그것을 품 어.
   2. 아침에, 다시 문화 0.1의 광학 밀도 (OD) YAPD 매체의 50 mL에 접종 하 고 0.5-0.7 (7 ~ 10⁶ 셀/mL)의 OD를 도달할 때까지 세포 성장.
   3. 전체 50 mL 문화 (약 350 x 10⁶ 셀) 50 mL 원뿔 튜브에 수집 하 고 2100 x g에서 3 분 아래로 셀 스핀. 신중 하 게 YAPD 매체를 제거 하 고 한번 1 x PBS 가진 펠 릿을 세척.
   4. 그런 다음, 세포의 용 해 버퍼의 480 µ L, 10 %sds, 48 µ L 및 페 놀: 클로 프롬: Isoamyl 알콜 (25:24:1), pH 6.8의 480 µ L에 펠 릿을 resuspend. 5 s, 및 전송 (키트와 함께 제공 되는) 얼음 처럼 차가운 지 르 코니 아 구슬의 750 µ L 튜브 1.5 mL 나사 뚜껑에 그것에 대 한 최대 속도에서 샘플 소용돌이. 세포 세포의 용 해 및 전체 RNA 추출을 위한이 프로토콜의 3 단계로 진행 합니다.
      참고: 모든 단계 2.1.4에 필요한 시 약의 권장된 효 모 RNA 추출 키트에에서 제공 됩니다. 이 시 약을 똑같이 작동 잘 효 모, 벌레, 고 효 (2.1 단계), 웜 (2.2 단계) 또는 파리 (2.3 단계)의 컬렉션, 후 통합된 접근 C-seq 라이브러리 (3-10 단계)를 생성 하 사용 수 있도록.
2. 꼬마 선 충 문화 그리고 컬렉션
   1. C-seq 도서관 벌레에서 원하는 경우 입금 한 천 OP50 박테리아 발견의 신선한 접시에 30 성인 벌레.
      참고: 5 격판덮개 1 복제에 대 한 충분 한 있습니다.
   2. 4 일 동안 벌레 문화 고 부드럽게 M9 미디어의 5 mL 접시 세척 하 여 벌레를 수집 하 고 단일 50 mL 원뿔 튜브로 웜 풀.
   3. 펠 릿을 만드는 2 분 100 x g 에 아래로 벌레를 스핀. 펠 릿을 방해를 하지 않도록 가능한 최저 속도로 원심 분리기 감속
   4. 부드럽게 1.5 mL 튜브에 벌레를 이동, M9 미디어의 1.5 mL에 두 번 그들을 씻어과 박테리아를 제거 하 고 벌레의 깨끗 한 100 µ L 펠 릿을 생성 하는 1 분에 100 x g 에서 튜브 원심.
   5. 세포의 용 해 버퍼의 480 µ L, 10 %sds, 48 µ L 및 페 놀: 클로 프롬: Isoamyl 알콜의 480 µ L에서 벌레 resuspend 5 s와 전송 그것 1.5 mL 나사 뚜껑에 얼음 처럼 차가운 지 르 코니 아 구슬의 포함 750 µ L 튜브에 대 한 최대 속도에서 샘플 소용돌이. 벌레와 총 RNA 추출의 세포에 대 한이 프로토콜의 3 단계로 진행 합니다.
3. 초파리 melanogaster 문화와 컬렉션
   1. 파리에서 C-seq 라이브러리 바란다면 우선 당 또는 당 밀-기반 미디어를 포함 하는 작은 유리병에서 20-25 파리 문화. Aliquot 파리 3 리 바이 알, 그래서 각 유리병 포함 약 8 파리.
   2. 파리는 진정 될 때까지 파리를 수집 하려면 얼음 양동이에 유리병을 놓습니다. 그런 다음, 1.5 mL 튜브에 브러쉬 들을 수집 합니다. CO₂ 처리에 의해 파리를 수집 하지 않습니다.
   3. 실내 온도 (RT), 따뜻한 파리 하 게 그리고 신속 하 게 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L의 premade 혼합물, 10 %sds, 50 µ L 및 페 놀: 클로 프롬: Isoamyl 알콜의 500 µ L 추가. micropestle를 사용 하 여 약 15 선, 회사는 유 봉 튜브의 맨 아래에 도달할 때 모션 트위스트와 함께 파리를 갈기.
   4. 파리의 혼합물을 부 어와 1.5 mL 스크류 캡으로 세포 미디어 튜브 얼음 처럼 차가운 지 르 코니 아, 구슬과 소용돌이의 포함 750 µ L 3의 단계로이 프로토콜은 세포에 대 한 파리 및 총 RNA 추출의 5 미 진행에 대 한 최대 속도에서 그것.

3. 총 RNA 정화

참고:이 시점에서, 모든 세 가지 프로토콜 수렴, 그리고 C-seq 라이브러리를 생성 하는 단일, 통합 접근을 사용할 수 있습니다.

1. 스크류는 모자에 단단히 고 어댑터 또는 스티커 테이프는 vortexer에 튜브를 연결 합니다. 샘플을 lyse 10 분 최대 속도로 튜브 소용돌이. 그런 다음 수성 단계 로부터 유기 용 매를 분리 하는 5 분에 대 한 16,100 x g 에서 샘플 원심.
2. 신중 하 게 흰색, 흐린 interphase를 방해 하지 않고 수성 단계의 400-500 µ L을 제거 하 고 포함 하는 바인딩 버퍼의 1.9 mL 15 mL 원뿔 튜브에 추가. Vortexing에 의해 그들을 철저 하 게 혼합.
3. 100% 에탄올의 1.25 mL을 추가 하 고 vortexing에 의해 샘플을 혼합. 샘플의 700 µ L 컬렉션 튜브에서 조립 필터 카트리지를 전송 하 고 샘플의 모든 카트리지를 통해 전달 될 때까지 30 s. 반복을 위한 14500 x g 에서 샘플을 회전.
   참고:이 시점에서, 샘플 설정할 수 있습니다 약간 불투명. 너무 많은 셀, 웜, 또는 파리 lysed 했다, 침전 수 표시 하는 필터를 방해할 수 있습니다.
4. 필터 세척 솔루션 2 또는 3의 500 µ L 두 번 세척 솔루션 1, 700 µ L와 한 번 씻는 다. 14500 x g 2 분 어떤 초과 에탄올을 제거에서 샘플을 회전 시켜는 세척을 완료.
5. 1.5 mL 돌고래 튜브를 필터 카트리지를 전송 하 고 prewarmed 차입 솔루션 (65 ° C)의 108 µ L를 추가 합니다.
   하 고 그래서 uracil 탈 이벤트 전송 오류에서 구별 가능 하지 않은 시 토 신을 자극 것입니다 참고: 절대 반전 녹음 방송 전에 65 ° C 보다 높은 온도에 RNA 샘플을 노출 합니다.
6. 격리 된 RNA에서 DNA 오염 저하 (참조 단계 2.1-3.4) x DNase 나 버퍼, RNase 억제제의 2 µ L DNase의 4 µ L 10의 11 µ L을 추가 하 여 나 (8 U), 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 그들을 품 어.
7. 소화 후 DNase 비활성화 시 약의 11 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 혼합물 RT에 5 분 동안 앉아 보자. 그런 다음, 원심 비활성화 시 작은 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한의 110 µ L를 수집을 3 분 동안 15000 x g 에서 샘플. 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송.
   참고: DNase 비활성화 시 매우 어려울 피펫으로을 제대로, 각 pipetting 작업 후 피 펫 팁을 그래서 시각적으로 검사 수 있습니다. 비활성화 시 되 너무 피펫으로에 점성, 추가 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) 나머지 볼륨의 1/5와 동일 합니다.
8. (품질 확인) 분 광 광도 계를 사용 하 여 전체 RNA의 농도 측정 합니다. 그리고 총 RNA의 1 µ L를 마련해 nuclease 무료 (NF) 물에 10 ng / µ L의 농도를 희석 합니다. 되도록 RNA 타락 하지 적어도 8.5 또는 더 높은 (그림 2B)에 린 값 높은 감도 RNA 테이프와 함께 적절 한 염기 분석 악기에 RNA를 실행 합니다.

4. mRNA 풍부

1. MRNA miniprep와 mRNA 농축 수행 키트 ( 재료의 표참조). 250 µ L의 전체 볼륨에 대 한 샘플에 NF 물 140 µ L를 추가 합니다. 그런 다음 바인딩 버퍼 x 2의 250 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 샘플을 철저 하 게 혼합 올리고 (dT) 구슬의 15 µ L을 추가.
2. 위쪽 및 아래쪽 pipetting으로 샘플을 혼합 하 고 2 분 동안 65 ° C에서 품 어. 그런 다음, 10 분에 대 한 실시간 샘플 장소. 마지막으로, 원심에서 16,100 x g 2 분 구슬: mRNA 단지 작은 샘플.
3. 삭제는 상쾌한 고 세척 솔루션의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend. 스핀의 열 솔루션을 전송 하 고 15000 x g에서 1 분 동안 회전. 흐름을 통해 삭제 하 고 세척 솔루션의 추가 500 µ L로 샘플을 씻어. 그런 다음 스핀 스핀 필터에서 어떤 과잉 에탄올을 제거 하려면 15000 x g 2 분에 대 한 샘플.
4. 돌고래 튜브를 회전 필터 전송 및 prewarmed 차입 솔루션 (65 ° C)의 80 µ L 열에 펠 릿을 resuspend. 65 ° C에서 1.5 분 샘플을 품 어 고 15000 x g에서 1 분 동안 회전 하 여 그것을 elute.
5. 분 광 광도 계 또는 RNA 농도 품질의 정량화에 대 한 비슷한 도구를 사용 하 여 순화 된 RNA의 농도 측정 합니다.

5. RNase III 조각화 및 RNA 정리

참고: (중요) 원형 RNA 분자 C-seq 라이브러리를 생성 하기 위한 적절 한 준비 하는 RNA 길이에 대략 60-80 기지를 조각화 해야 합니다. 이전 방법 단편 RNA에 화학 조각화 사용, 하는 동안 중 금속 화학 조각화 손해 최종 분석 하는 동안 녹음 방송 과실으로 잘못 해석 될 수 있다 RNA 샘플을 소개 합니다. 이 문제를 회피, RNase III를 사용 하 여 생성 하는 작은 조각 하는 조각에 대신 의존. 이 효소 방법의 추가적인 이점은 호환 끝 화학 조각화 후 최종 복구에 대 한 필요성을 obviating, 결 찰에 필요한 것입니다.

1. 순화 된 RNA의 1 µ g와 RNA 파편 반응 설정, 반응 버퍼의 10 µ L, RNase iii, 5 µ L 및 충분 한 NF를 100 µ L까지 볼륨을가지고 물 ( 재료의 표참조). 마지막은 효소를 추가 하 고 플라스틱 혼합물을 위아래로 10 배 이상 혼합. 길이 약 60-80 기지의 RNA 파편을 생산 하는 경향이 25 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
2. 25 분 부 화 완료 되 면 정리를 올리고 함께 즉시 반응 정리 및 집중 장치 키트 ( 재료의 표참조) 어떤 더 소화를 방지 하기 위해. 추가 샘플을 올리고 바인딩 버퍼의 200 µ L vortexing에 의해 철저 하 게 혼합 하 고 100% 에탄올의 800 µ L를 추가 합니다. Vortexing에 의해 샘플을 혼합 하 고 제공 된 스핀 열 수집 튜브에 그것을 전송.
3. 10000 x g 30 s 및 세척에 샘플 원심 RNase III를 제거 하는 워시 버퍼의 750 µ L와 함께. 10000 x g 30에 샘플 원심 s, 흐름을 통해 삭제 하 고 위에서 설명한 대로 워시 버퍼의 750 µ L로 한 번 더 샘플을 씻어. 두 번째 후 흐름을 통해가 버렸습니다, 그리고 원심 15000 x g 2 분 어떤 초과 에탄올 제거에 열.
4. 신선한 1.5 mL 튜브에 열을 전송 하 고 1 분 동안 10000 x g 에서 그것을 회전 시켜 NF 물 24 µ L에서 샘플을 elute.
5. 품질 확인: 순화 된 RNA 파편의 2 µ L 고 2-fold 희석 NF 물 2 µ L을 추가 하 여. 조각난된 RNA 길이 (그림 2c) 50-100의 범위에 있는지 확인 하는 화면 테이프에 조각난된 RNA를 실행 합니다.

6. RNA Circularization 및 롤링 원 반전 녹음 방송

1. Circularize RNA 파편, 20 µ L 1 분에 65 ° C에서 샘플의 열 변성 하 고 즉시 2 분 동안 얼음에 그것을 배치. 다음, 4 µ L T4 RNA 리가 버퍼, 10mm ATP, RNase 억제제의 1 µ L, NF 물, 1 µ L의 4 µ L x 10의 그리고 50% 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)의 8 µ L를 추가 합니다.
2. Vortexing에 의해 샘플을 철저 하 게 혼합 하 고 추가 2 µ L T4 RNA 리가 I. 믹스의 10 U / µ L의 샘플 다시 그것 pipetting으로 thermocycler 30 ° c.에 설정 하는 뚜껑의 온도에서 2 h 25 ° C에서 그것을 품 어
3. 2 시간 후 샘플을 NF 물 10 µ L을 추가 하 고 제조업체의 사양에 따라 올리고 정리 및 농도 키트 샘플 정리. NF 물 20 µ L에서 샘플 elute
4. 반대로 원형 RNA 분자를 녹음, 10mm dNTPs의 4 µ L, 50 ng / µ L 임의의 hexamers의 4 µ L 및 NF 물 9 µ L RNA의 9 µ L를 추가. Pipetting으로 모든 것을 철저 하 게 혼합 하 고 1 분에 65 ° C에서 샘플 변성 백업으로 나머지 RNA ice 2 분 저장소에 두십시오.
5. 5 x 1 가닥 합성 버퍼의 8 µ L, 0.1 m m DTT, 2 µ L 및 역전사 200 U / µ L의 4 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 모든 것을 혼합. 42 ° C에서 20 분 부 화 부 화 온도 보다 5 ° C에서 설정 뚜껑 뒤 10 분, 25 ° C에서 샘플을 품 어.
   참고: 스트랜드 변위 기능 역전사 사용 해야이 단계에서 롤링 원 반전 녹음 방송에 대 한 허용.
6. 샘플에 NF 물 10 µ L을 추가 하 고 제조업체의 권장 사항에 따라 올리고 정리 및 농도 키트와 함께 그것을 청소. 차입 솔루션의 42 µ L에서 샘플 elute
7. 품질 확인: NF 물 2 µ L에 단일 가닥 cDNA의 2 µ L를 희석 하 고 높은 감도 RNA 테이프와 뉴클레오티드 분석 악기에이 샘플을 실행 합니다. 반전 녹음 방송 제대로, 라이브러리 cDNA 분자의 경우, 길이, 약 60-1500 기지에서 배열 표시 되어야 합니다. 이상적으로, 대부분 cDNA 500-1000 (그림 2d)의 범위에 있다.

7. 두 번째 가닥 cDNA 합성 및 최종 수리

1. 더블-좌초 된 cDNA 라이브러리를 생성 하는 두 번째 가닥 합성 키트를 사용 합니다. 얼음에 샘플을 놓고 샘플의 38 µ L를 NF 물 30 µ L를 추가 합니다. 다음, 두 번째 가닥 버퍼 x 10의 8 µ L와 두 번째 가닥 효소의 4 µ L을 추가 하 고 부드러운 pipetting 2.5 h 16 ° C에서의 부 화 하기 전에 샘플을 혼합.
2. oligo와 샘플 정리 정리 농도 100 µ L 반응에 대 한 제조업체의 권장 사항을 따르면 키트와 NF 물 38 µ L의 샘플을 elute.
3. 더블-좌초 된 cDNA의 35.5 µ L, 최종 복구 반응 버퍼의 6.5 µ L, 최종 준비 효소 혼합의 3 µ L를 NF 물 20 µ L을 추가 하 여 최종 수리 반응을 설정 합니다. 신중 하 게 흰색 침전 물에 대 한 반응 버퍼를 확인 하 고 있는 경우 손을 온난 하 여 그들을 분해.
4. 최종 수리 반응 pipetting으로 혼합 하 고 두 번째 30 분 부 화 65 ° c.에 의해 다음 30 분 동안 20 ° C에서 그것을 품 어 부 화 온도 보다 5 ° C에서 thermocycler 뚜껑의 온도 설정 합니다.

8. 어댑터 결 찰 및 준비 라이브러리의 크기 선택

1. 마지막 도서관 준비 ( 재료의 표참조)에 대 한 다단계 라이브러리 준비 모듈을 사용 합니다. 먼저, 다음-세대 10 배 시퀀싱에 대 한 어댑터를 희석 1.5 µ M의 최종 농도에 10 mM Tris HCl에에서. 다음, 각 샘플을 희석된 어댑터의 2.5 µ L 및 결 찰 증강의 1 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 그들을 믹스.
2. 블런트/TA 리가 마스터 믹스의 15 µ L 추가, pipetting으로 혼합 하 고 15 분 동안 20 ° C에서 그것을 품 어. 다음, uracil 전용 절단 시 효소의 3 µ L을 추가 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 결 찰 후 100 µ L의 전체 볼륨에 대 한 샘플을 NF 물 13.5 µ L을 추가 하 고 크기 선택 진행.
   참고: 그것은 최고의 길이에 600-800의 범위에 있는 cDNA 분자에 대 한 크기 선택. 조각난된 RNA 분자에 길이 약 60-80 기지 라면 대부분 선택한 분자의 적어도 3 개의 탠덤 반복, 다운스트림 처리에 이상적입니다 포함 보장 합니다 길이에 600-800 기지는 분자에 대 한 선택 하 고 분석입니다.
3. 길이 600-800 bp는 분자를 선택 하려면 resuspended 자석 구슬 ( 재료의 표참조)의 30 µ L 각 샘플 하 pipetting으로 혼합 rt acclimated 추가 합니다. 1.5 mL 튜브에 샘플을 전송 하 고 5 분 동안 그것을 RT에서 품 어.
4. 마그네틱 스탠드는 상쾌한 구슬 구분 5 분에 샘플을 놓습니다. 새로운 1.5 mL 튜브 자석 구슬 (에 바인딩되는 큰 cDNA 분자)의 처분을 상쾌한 (는 원하는 cDNA 분자 포함)을 전송 합니다.
5. 각 샘플에 자석 구슬의 15 µ L의 신선한 약 수를 추가, pipetting, 철저 하 게 혼합 및 자석 선반에 샘플 실시간 장소에 5 분 동안 품 어 및 실시간에 5 분 동안 그들을 품 어 다음, 조심 스럽게 제거 하 고 구슬을 방해 하지 않도록 만드는 supernatants의 처분.
   참고: 이제 원하는 대상 cDNA를 포함 하는 자석 구슬의 폐기 하지 마십시오.
6. 80%의 200 µ L 갓 수송과 자석 구슬 방해 하지 않고 각 샘플의 에탄올을 준비 추가 및 에탄올 30 s. 폐기를 위해 품 어 하 고 80% 에탄올으로 한 번 더 샘플을 세척. 다음, 완전히 샘플에서 에탄올의 흔적을 제거 하 고 구슬 5 분에 대 한 건조 하지만 구슬 지나치게 건조 하지 않도록 주의 하십시오. 구슬 overdried는, 균열은 펠 릿에 표시 됩니다.
7. 구슬에서 샘플을 elute 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거 하 고 추가 10 mm Tris 19 µ L-HCl. 피펫으로 그것 및 아래로 여러 번 resuspended 구슬 하 고 실시간에 5 분에 대 한 샘플을 품 어 경우는 구슬 overdried 했다, 그들을 품 어 > 10 분.
8. 마그네틱 스탠드에 다시 샘플을 놓고는 상쾌한 구슬 구분 5 분 동안 그들을 품 어. 조심 스럽게 튜브에서 순화, 크기 선택 cDNA 라이브러리를 포함 하는 상쾌한의 15 µ L을 제거 하 고 신선한 1.5 mL 튜브에 그것을 전송.

9. PCR 증폭 및 최종 구슬 정화

1. 보편적인 뇌관의 5 µ L 및 고유 인덱스 뇌관의 5 µ L 추가 pipetting으로 그들을 철저 하 게 혼합 및 각 순화 cDNA 라이브러리 (재료의 표 참조). 신중 하 게 결정 및 다른 침전 중 합 효소 마스터 믹스를 확인 하 고는 침전 해산 때까지 손으로 마스터 혼합 따뜻한.
   1. 샘플, 중 합 효소 마스터 믹스의 25 µ L, pipetting으로 그들을 혼합 하 고 PCR 증폭에 대 한 아래 자전거 조건에 따라 추가 합니다. 초기 변성 30 98 ° C에 실행 s, 다음 10에 대 한 denaturating에 의해 이중 단계 PCR 반응 98 ° C에 샘플 수행 s와 75 65 ° C에서 PCR 제품의 어 닐 링/확장 s (12 배), 5 분 동안 65 ° C에서 최종 확장명 및 4 ° c.에 무기한 보류
2. 청소 PCR 반응에 직접 resuspended 자석 구슬의 45 µ L을 추가 하 여 최종 라이브러리를 pipetting, 그들을 섞어 5 분 전송에 대 한 RT에서 1.5 mL 튜브에 샘플을 품 어 그리고 마그네틱 스탠드에 배치. 5 분 동안 품 어, 삭제는 상쾌한 고 30 갓된 80% 에탄올으로 두 번 씻어 s.
3. 두 번째 세척 후 완전히 제거 에탄올 샘플, 그리고 5 분의 비드 펠 렛 건조 하 고 0.1 x TE의 35 µ L에 elute. 그들 pipetting으로 구슬 resuspend 품 어 그들 RT에서 5 분 장소에 대 한 샘플 자기 대에와 5 분 후, 신선한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한의 30 µ L를 전송 합니다. -80 ° c.에 라이브러리를 저장
4. 품질 확인: NF 물 9 µ L에서 최종 라이브러리의 1 µ L를 희석 하 고 높은 감도 칩; 전용된 DNA 분석 장비에서 샘플 실행 cDNA의 대부분 길이 (그림 2e) 600-800 bp의 범위에 있어야 합니다.
5. 차입, 후 250 bp 쌍 간 읽기, 또는 300 bp 일자형 읽기를 사용 하 여 대규모 병렬 시퀀싱 플랫폼에 시퀀싱에 대 한 샘플 보낼.

10. 바이오 informatic 원 데이터를 시퀀싱 분석

참고: 분석 하 고 해석 하는 C-seq 분석 결과에서 원시 데이터 전용된 바이오 informatic 파이프라인을 필요 합니다. 우리의 분석에 사용 된 파이프라인의 회로도 그림 3에서 묘사 된다. Https://github.com/LynchLab/MAPGD에서이 파이프라인을 다운로드 합니다.

1. 첫째, 트림 제거 어댑터 시퀀스와 낮은 품질 cutadapt¹⁸, 20의 품질 평가 점수 임계값을 사용 하 여 기본 호출을 읽습니다.
2. 그런 다음, 어떤 반복 30 뉴클레오티드의 최소 크기를 감지 하는 적절 한 알고리즘을 사용 하 여 concatemerized RNA 분자에 의해 반복을 식별 하 고¹⁸을 반복 하는 사이 2 불일치의 최대. 이러한 반복에서 합의 시퀀스를 파생 하 고 모든 기본 통화 및 각 위치에 관련 된 품질 평가 점수.
   참고: 반전 녹음 방송 circularized RNA 분자에 어떤 위치 든 지에 시작할 수 있습니다, 때문에 반복의 시작 일치 하지 않습니다 반드시 조각난된 RNA 분자 (결 찰 포인트 라 함)의 5 ' 끝에. 따라서 합의 순서 하지 지도 지속적으로 결 찰 지점 식별을 필요로 해당 transcriptome에 대 한.
3. 결 찰 포인트를 식별 하기 위해 참조 transcriptome 폭발 같은 정렬 도구 (BLAT)¹⁹를 사용 하 여에 대 한 합의 시퀀스의 concatemer을 매핑하십시오.
   1. 매핑된 시퀀스에 하나 이상의 전체 중단된 발생 초기 RNA 조각 시퀀스의 포함 되어 있는지 확인 하는 합의 시퀀스의 두 인스턴스를 연결 합니다. 합의 시퀀스 예측된 결 찰 지점 위치에서 시작 하는 다음, 회전.
4. 회전된 합의 시퀀스 TopHat²⁰ 를 사용 하 여 게놈에 대 한 지도를 사용 하는 정렬 어떤 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 전송 오류에 대 한 오해 될 수 있는 검색.
5. 매핑된 회전된 합의 시퀀스에서 전사 오류를 호출 하 고 후보 오류 4 개의 추가 테스트를 통과 하는지 여부를 테스트.
   1. 먼저, 전송 오류 (일반적인 요구는 최소한 20 읽기 커버 보다는 읽기의 5% 대체 기본 호출을 지원할 수 있습니다 더 이상 기본 특정 필요가)는 SNP와 겹치지 않도록 확인 하십시오.
   2. 둘째, 합의 시퀀스는 각각의 호출 하는 동일한 기본적인 쌍; 3 탠덤 반복에서 파생 된다 확인 그리고 셋째, 그 위치의 품질 점수의 합 100 이상 이어야 다는 것을 확인.
6. 네 번째 및 마지막 확인 하 고 모든 가능한 조합 (결 찰 포인트의 모든 가능한 위치 시뮬레이션)에서 합의 순서를 회전 TopHat를 사용 하 여 참조 게놈에 대해 각 버전을 매핑하십시오.
   참고: 회전된 시퀀스 중 하나는 게놈에 있는 완벽 한 일치를 발견, 해당 결 찰 포인트 지금 정확한 것 여겨진다 고 필 사 오류 호출을 거부 합니다.

결과

모든 대규모 병렬 시퀀싱 방법 처럼 각 C-seq 실험 다루기, 큰 데이터 집합을 생성합니다. 처음 사용자를 위해 어려울 수 있습니다; 이러한 데이터 세트를 처리 하기 위해 따라서, 모든 사용자는 실험 전에 경험된 바이오-informatician 문의 하는 것이 좋습니다. 평균, 기대는 사용자 대부분 대규모 병렬 시퀀싱 플랫폼에서 실행 당의 55-70 기가 기지 (Gbases) 약을 생성 합니다. 이 프로토콜에 대 한 일반적으로 12-30 샘플 했다 다중화 실행 당 각 샘플에 대 한 약 2-6 Gbases 인수 했다 그래야. 어댑터 시퀀스와이 데이터 집합에서 낮은 품질 기본 호출 (< 20) 트리밍, 후 ~ 70% 초기 데이터 크기의 남아 있었다.

이 기지는 다음 생성 된 반복의 크기를 결정 하 여 RNA 조각화 및 circularization의 효율성 조사...

토론

여기, 우리는 꼬마 선 충, 초파리 melanogaster에 Saccharomyces cerevisiae전송 오류 검출을 위한 C-seq 라이브러리의 준비를 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 대체 기술 뿐만 아니라 기존 프로토콜을 통해 수많은 장점이 있습니다.

지난 15 년 동안 수많은 기자 시스템 개발 되었습니다 luciferase^7,8 또는 Cre Lox 재결합^3,4,15,21 전사 검색에 의존 하는 오류입니다. 이러한 기자 시스템 연구팀은 그들은 유전자, 대립, 그리고 직접 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RiboPure RNA 정제 키트	ThermoFisher	AM1926	총 RNA 정제
Genelute mRNA 정제 키트	Sigma-Aldrich	MRN70-1KT	mRNA 정제
뉴클레아제가 없는 물	Ambion	AM9937	용출 및 희석
Ambion RNase III	ThermoFisher	AM2290	RNA 단편화
T4 RNA 리가아제 1(ssRNA Ligase)	New England Biolabs	M0204S	RNA circularization
Ribolock	ThermoFisher	EO0381	RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase	ThermoFisher	18080044	Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix	ThermoFisher	18427013	Rolling circle reverse transcription
Random hexamers (50 ng/µ L)	ThermoFisher	N8080127	롤링 서클 역전사
NEB 두 번째 가닥 합성 모듈	New England Biolabs	E6111S	두 번째 가닥 합성
NEBNext Ultra DNA 라이브러리 준비 키트 Illumina New	England Biolabs	E7370S	cDNA 라이브러리 준비
NEB Next 인덱스 프라이머	NEB	E7335S	멀티플렉스 PCR 프라이머
올리고 클린 & Concentrator	Zymo Research	D4061	RNA 및 DNA 시료 정리
DynaMag-2 자석	ThermoFisher	12321D	마그네틱 비드 정제
AMPure XP 비드	Beckman Coulter	A63881	마그네틱 비드 정제
Eppendorf 5424 마이크로 원심분리기	FisherScientific	05-403-93	원심분리
INCU-Shaker 10 L	Benchmark Scientific	H1010	세포 배양
T100 열 순환기	BIO RAD	1861096	중고온에서 고온 순환 조건
PTC-200 열 순환기	GMI	8252-30-0001	저온 사이클링 조건
RNase Away	Molecular Bioproducts	700S-11	멸균
50 mL 원심분리기 튜브	Corning	430290	뉴클레아제가 없는
15 mL 원심분리기 튜브	Corning	430052	Nuclease-free
Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	Nuclease-free
4200 Tapestation System	Agilent	G2991AA	RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리를 위한 뉴클레오티드 분석 장비
고감도 RNA 스크린 테이프	애질런트	5067-5579	RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리
RNA ScreenTape 샘플 버퍼	애질런트	5067-5577	RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리
RNA ScreenTape Ladder	Agilent	5067-5578	RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	Double stranded DNA 품질 관리
고감도 DNA 키트	Agilent	5067-4626	이중 가닥 cDNA 샘플에 대한 품질 관리
조	VWR	462-0244	배양
NanoDrop 2000/2000C 분광 광도계	ThermoFisher	ND-2000C	RNA 농도 측정