진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

요약

이 프로토콜 여러 모델 생물에서 녹음의 품질을 모니터링 하는 새로운 도구와 연구를 제공 합니다.

초록

정확한 전사는 유전 정보의 충실 한 식에 대 한 필요 합니다. 놀랍게도 하지만, 약간 녹음의 품질을 제어 하는 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 과학적 지식에이 격차를 채우기 위해 우리는 최근 Saccharomyces cerevisiae, 초파리 melanogaster, 및 꼬마 transcriptome 걸쳐 전사 오류를 감지 하 원-시퀀싱 분석 결과 최적화 선 충. 이 프로토콜은 전사 오류 진 핵 세포에서의 전사의 품질을 제어 하는 메커니즘 전례 없는 자세히 해명 될 수 있도록 지도 하는 강력한 새로운 도구와 연구를 제공할 것입니다.

서론

게놈 생명의 정확한 생물학 청사진을 제공합니다. 이 청사진을 제대로 구현 하기 좋은 정밀도로 변하게 하는 게놈에 대 한 중요 하다. 그러나, 전사 무료 오류일 가능성이 크다. 예를 들어 RNA polymerases 오류가 시험관에^1,2, 하 긴 알려져 있다 그리고 최근에 그들은 오류에서 vivo에서 뿐만 아니라^3,,56, 커밋 보였다 DNA에 직면 하는 경우에 특히^7,8,,910손상. 함께 찍은, 이러한 관측은 필 사 오류가 발생 지속적으로 모든 살아있는 세포에서 그들은 돌연변이 단백질의 강력한 원천이 될 수 있는 제안 나타냅니다.

Transcriptional mutagenesis 되 나,이 과정에서 두 가지 방법으....

프로토콜

1입니다. 준비

1. RNases는 편 재; 따라서, 철저 하 게 오염 시 약으로 그것을 아래로 분사 하 여 작업 영역을 청소 (예:, RNase 거리)와 70% 에탄올. 어떤 펫, 펜, 또는 튜브 랙 RNase 오염의 가능성이 소스를 제거 하는 스프레이.
2. 더 않도록 RNases 샘플 오염, 실험 중 실험실 코트 또는 긴 소매 t-셔츠를 착용 합니다. 장갑 및 사용 될 상자 또는 가방에서 그들을 검색 하는 경우에 특히 모든 튜브의 내부 사이의 접촉을 피하십시오.
3. 반전 녹음 방송 전에 글러브를 자주 변경 합니다.
   참고: 최적의 결과 대 할 하지 일시 중지 반전 녹음 방송 전에 실험.

2. 셀 및 동물 문화 및 수집

1. Saccharomyces cerevisiae 성장과 컬렉션
   1. C-seq 도서관 효 모에서 원하는 경우 먼저 S. cerevisiae 의 단일 식민지 중간 포함 효 모 추출 물, 아데닌, 펩, 그리고 포도 당 (YAPD)의 3 mL에 접종 하 고 하룻밤 회전 드럼에 30 ° C에서 그것을 품 어.
   <....

결과

모든 대규모 병렬 시퀀싱 방법 처럼 각 C-seq 실험 다루기, 큰 데이터 집합을 생성합니다. 처음 사용자를 위해 어려울 수 있습니다; 이러한 데이터 세트를 처리 하기 위해 따라서, 모든 사용자는 실험 전에 경험된 바이오-informatician 문의 하는 것이 좋습니다. 평균, 기대는 사용자 대부분 대규모 병렬 시퀀싱 플랫폼에서 실행 당의 55-70 기가 기지 (Gbases) 약을 생성 합니다. 이 프로토콜에 대 한 일반적으로 12-30 샘플 했다 다중화 실행 당 각 샘플에 대 한 약 2-6 Gbases 인수 했다 그래야. 어댑터 시퀀스와이 데이터 집합에서 낮은 품질 기본 호출 (< 20) 트리밍, 후 ~ 70% 초기 데이터 크기의 남아 있었다.

이 기지는 다음 생성 된 반복의 크기를 결정 하 여 RNA 조각화 및 circularization의 효율성 조사.......

토론

여기, 우리는 꼬마 선 충, 초파리 melanogaster에 Saccharomyces cerevisiae전송 오류 검출을 위한 C-seq 라이브러리의 준비를 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 대체 기술 뿐만 아니라 기존 프로토콜을 통해 수많은 장점이 있습니다.

지난 15 년 동안 수많은 기자 시스템 개발 되었습니다 luciferase^7,8 또는 Cre Lox 재결합^3,4,15,21 전사 검색에 의존 하는 오류입니다. 이러한 기자 시스템 연구팀은 그들은 유전자, 대립, 그리고 직접 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RiboPure RNA 정제 키트	ThermoFisher	AM1926	총 RNA 정제
Genelute mRNA 정제 키트	Sigma-Aldrich	MRN70-1KT	mRNA 정제
뉴클레아제가 없는 물	Ambion	AM9937	용출 및 희석
Ambion RNase III	ThermoFisher	AM2290	RNA 단편화
T4 RNA 리가아제 1(ssRNA Ligase)	New England Biolabs	M0204S	RNA circularization
Ribolock	ThermoFisher	EO0381	RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase	ThermoFisher	18080044	Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix	ThermoFisher	18427013	Rolling circle reverse transcription
Random hexamers (50 ng/µ L)	ThermoFisher	N8080127	롤링 서클 역전사
NEB 두 번째 가닥 합성 모듈	New England Biolabs	E6111S	두 번째 가닥 합성
NEBNext Ultra DNA 라이브러리 준비 키트 Illumina New	England Biolabs	E7370S	cDNA 라이브러리 준비
NEB Next 인덱스 프라이머	NEB	E7335S	멀티플렉스 PCR 프라이머
올리고 클린 & Concentrator	Zymo Research	D4061	RNA 및 DNA 시료 정리
DynaMag-2 자석	ThermoFisher	12321D	마그네틱 비드 정제
AMPure XP 비드	Beckman Coulter	A63881	마그네틱 비드 정제
Eppendorf 5424 마이크로 원심분리기	FisherScientific	05-403-93	원심분리
INCU-Shaker 10 L	Benchmark Scientific	H1010	세포 배양
T100 열 순환기	BIO RAD	1861096	중고온에서 고온 순환 조건
PTC-200 열 순환기	GMI	8252-30-0001	저온 사이클링 조건
RNase Away	Molecular Bioproducts	700S-11	멸균
50 mL 원심분리기 튜브	Corning	430290	뉴클레아제가 없는
15 mL 원심분리기 튜브	Corning	430052	Nuclease-free
Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	Nuclease-free
4200 Tapestation System	Agilent	G2991AA	RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리를 위한 뉴클레오티드 분석 장비
고감도 RNA 스크린 테이프	애질런트	5067-5579	RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리
RNA ScreenTape 샘플 버퍼	애질런트	5067-5577	RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리
RNA ScreenTape Ladder	Agilent	5067-5578	RNA 및 단일 가닥 DNA 샘플의 품질 관리
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	Double stranded DNA 품질 관리
고감도 DNA 키트	Agilent	5067-4626	이중 가닥 cDNA 샘플에 대한 품질 관리
조	VWR	462-0244	배양
NanoDrop 2000/2000C 분광 광도계	ThermoFisher	ND-2000C	RNA 농도 측정

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