망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

요약

쥐 망막 microvascular pericytes, 즉, cryo 섹션, 전체 마운트 및 혈관 네트워크의 침투성 절연의 immunohistochemical 시각화를 위한 3 개의 다른 조직 준비 기술을 설명합니다.

초록

망막 pericytes 눈의 많은 질병에 중요 한 역할을 한다. 얼룩 기법 및 microvascular 망막 혈관의 Immunohistochemical pericytes는 안 과학 연구의 중심. Microvascular pericytes를 시각화 하는 적절 한 방법을 선택 하는 것이 생명 이다. 곳을 알아내는-섹션, 전체 마운트, 그리고 혈소판 유래 성장 인자 수용 체 β (PDGFRβ)와 신경/glial 원 2 (NG2)에 대 한 항 체를 사용 하 여 소형 고립 된 맥 관 구조에 얼룩 망막 microvascular pericyte immunohistochemical을 설명 합니다. 장점과 망막 microvascular pericytes의 시각화에 대 한 세 가지 조직 준비의 각각의 단점을 강조 하기 위해 수 있습니다. 곳을 알아내는-섹션 모든 망막 층의 transsectional 시각화를 제공 하지만 단지 몇 가끔 가로의 상처는 microvasculature 포함. 전체-마운트 전체 망막 맥 관 구조에 대 한 개요를 제공 하지만 시각화는 microvasculature의 곤란 하실 수 있습니다. 침투성 격리 신경 세포의 제거로 전체 망막 맥 관 구조를 시각화 하는 방법을 제공 하지만이 조직 매우 깨지기 쉬운.

서론

이 세포는 맥 관 구조의 무결성에 중요 한 역할으로 망막 pericytes 많은 연구 실험실의 초점입니다. 당뇨병 성 망막 증¹, 허 혈², 녹 내장³ 등 병 적인 조건 pericytes의 기능을 포함 하는 혈관 특성이 있다. Pericytes는 내부 망막 모 세관 plexuses에서 발견 된다. 중앙 망막 동맥 내부 망막을 공급 하는 모 세관 plexuses의 2 개의 층으로 분기 한다. 내부 관 침대는 신경 절 세포와 안 핵 층 사이 위치 해 있습니다. 깊은 계층 더 조밀 하 고 복잡 한 이며 내부 및 외부 핵 층^4,5사이 지역화 됩니다. 또한, 망막의 일부는 또한 광선 parapapillary 모세 나 세 번째 네트워크를 포함 합니다. 이들은 긴, 신경 섬유 중 고 거의 직선 모 세관 다른 하나 또는 다른 두 plexuses⁶anastomose. 모 세관 벽에서 pericytes 지하실 멤브레인에 포함 하 고 혈관 내 피 세포의 abluminal 사이드 라인.

이 ....

프로토콜

프로토콜 최적화 하 고 성인 남성 알 비 노 쥐에 설명 했다. 모든 실험 절차, 동물 ARVO 문에서 규정 안과 및 비전 연구에 있는 동물의 사용에 대 한 치료 했다. 동물은 이산화탄소와 이후 자 궁 경부 전위에 의해 안락사 되었다.

1. 쥐 망막 조직 준비

1. 곳을 알아내는-섹션
   1. 메스로 쥐 눈 꺼 풀에 후부 및 이전 ~0.5 cm의 가늘고 길게 찢어진 곳을 확인 합니다.
      1. 선택 사항: 투 열 버너를 사용 하 고 포함 하는 동안 제복 패션에 눈을 찾으시는 시 신경을 통해 수직 cryostat 단면에 대 한 내부 각도에 눈을 표시 합니다.
   2. 집게와 눈을 신중 하 게 주변 조직이 노출 측면 기울기. 연결 및 근육 조직에 해 부가 위 컷 하 여 눈을 enucleate.
      주의: 당기지 마십시오 눈 너무 열심히 시 신경에 과도 한 압력 망막 손상이 발생할 수 있습니다.
   3. 넣어 눈 짧게 4% 포름알데히드에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 메스의 팁과 가벼운 압력을 적용 하 여 각 막 limbus에서 초기 구멍을 만들기 전에 안정.
   4. 현미경으로 각 막 제거 하 고 2-4 h에 대 한 PBS에 ....

결과

성공적인 프로토콜 microvascular pericytes를 시각화에 대 한 세 가지 다른 망막 준비를 제공 합니다. 이러한 각 메서드 PDGFRβ 및 NG2 immunoreactivity 공동 지역화와 모 세관 내 피 foridentification 주위에 포장 하는 pericytes의 독특한 위치를 사용 합니다.

곳을 알아내는-섹션, 신경 레이어 DAPI 셔 서 핵과 내부 형광 밀도 의해 확인 될 수 있다와 깊은 모 세관 plexuses 포함 PDGFRβ 그리고 NG2 immunoreactivity (그림 1)를 표시 하는 pericytes. 선박 (그림 1, 화살표)의 주변에 원형 또는 말굽 모양의 immunoreactivity로 혈관 벽에 peric.......

토론

선물이 microvascular 망막 pericytes의 연구에 적용 될 수 있는 3 개의 망막 준비 기술. 아래, 우리 각 메서드 사이 비교를 제공 하 고 프로토콜에서 중요 한 단계를 강조.

곳을 알아내는-단면, 망막은 잘라 화살 섹션에 따라서, 그것은 동일한 망막에서 수많은 견본을 얻을 수. 이 방법에서 결과 숫자 섹션 항 체 특이성 및 적정 테스트로 불필요 한 동물 희생을 방지 하기 위한 이상적인 선택 하기가. 예비 일은 좋은 결과 위해 결정적 이다. 그것은 눈을 안 하지만 눈 주위의 모든 근육을 잘라 눈 해 부 동안 중요 합니다. 힘을 사용 하는 경우 망막의 위험이 있다. 눈 컵은 얇은, 때문에 하나 하지 너무 오래 수정 해야 합니다. 2-4 h에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 침수 조직을 해결 됩니다. 더 이상 고정, 관심사의 항 원을 파괴의 위험이 있다. 최고의 가능한 immunostainings를 생성 하기 위해 그것은 유리에 대 한 가능한 플랫.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
돼지 껍질에서 추출한 젤레틴	Sigma-Aldrich	G2625-500G
닭 달걀 흰자에서 추출한 알부민	Sigma-Aldrich	A5253-500G
디옥시리보뉴클레아제(DNAse) 소 췌장에서 추출한 I	Sigma-Aldrich	D5025-15KU	0.15M NaCl에 용해
소 혈청 알부민(BSA)	VWR	0332-100G
일반 당나귀 혈청	잭슨 ImmunoResearch	017-000-121, 로트 129348
토끼 anti-PDGFRβ	Santa Cruz	sc-432	1:100
Mouse anti-NG2	Abcam	ab50009	1:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure 당나귀 Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-585-152	1:100
Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-095-151	1:100
Cy2 AffiniPure 당나귀 Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-225-152	1:100
Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 마우스 IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	1:100
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	DMSO
안티 페이딩 마운팅 매체	Vector Laboratories	H-1000
안티 페이딩 마운팅 미디어 with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Nunc Lab-Tek II 4웰 챔버 슬라이드	Thermo Fisher Scientific	154526

에 용해