방법 논문

망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

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⸱

DOI:

10.3791/57733

⸱

2018년 10월 7일

 ,  , 
1Department of Clinical Experimental Research, Glostrup Research Institute, 2Department of Clinical Sciences, Division of Experimental Vascular Research, Lund University

이 논문에서

요약

쥐 망막 microvascular pericytes, 즉, cryo 섹션, 전체 마운트 및 혈관 네트워크의 침투성 절연의 immunohistochemical 시각화를 위한 3 개의 다른 조직 준비 기술을 설명합니다.

초록

망막 pericytes 눈의 많은 질병에 중요 한 역할을 한다. 얼룩 기법 및 microvascular 망막 혈관의 Immunohistochemical pericytes는 안 과학 연구의 중심. Microvascular pericytes를 시각화 하는 적절 한 방법을 선택 하는 것이 생명 이다. 곳을 알아내는-섹션, 전체 마운트, 그리고 혈소판 유래 성장 인자 수용 체 β (PDGFRβ)와 신경/glial 원 2 (NG2)에 대 한 항 체를 사용 하 여 소형 고립 된 맥 관 구조에 얼룩 망막 microvascular pericyte immunohistochemical을 설명 합니다. 장점과 망막 microvascular pericytes의 시각화에 대 한 세 가지 조직 준비의 각각의 단점을 강조 하기 위해 수 있습니다. 곳을 알아내는-섹션 모든 망막 층의 transsectional 시각화를 제공 하지만 단지 몇 가끔 가로의 상처는 microvasculature 포함. 전체-마운트 전체 망막 맥 관 구조에 대 한 개요를 제공 하지만 시각화는 microvasculature의 곤란 하실 수 있습니다. 침투성 격리 신경 세포의 제거로 전체 망막 맥 관 구조를 시각화 하는 방법을 제공 하지만이 조직 매우 깨지기 쉬운.

서론

이 세포는 맥 관 구조의 무결성에 중요 한 역할으로 망막 pericytes 많은 연구 실험실의 초점입니다. 당뇨병 성 망막 증1, 허 혈2, 녹 내장3 등 병 적인 조건 pericytes의 기능을 포함 하는 혈관 특성이 있다. Pericytes는 내부 망막 모 세관 plexuses에서 발견 된다. 중앙 망막 동맥 내부 망막을 공급 하는 모 세관 plexuses의 2 개의 층으로 분기 한다. 내부 관 침대는 신경 절 세포와 안 핵 층 사이 위치 해 있습니다. 깊은 계층 더 조밀 하 고 복잡 한 이며 내부 및 외부 핵 층4,5사이 지역화 됩니다. 또한, 망막의 일부는 또한 광선 parapapillary 모세 나 세 번째 네트워크를 포함 합니다. 이들은 긴, 신경 섬유 중 고 거의 직선 모 세관 다른 하나 또는 다른 두 plexuses6anastomose. 모 세관 벽에서 pericytes 지하실 멤브레인에 포함 하 고 혈관 내 피 세포의 abluminal 사이드 라인.

이 날짜에, 다른 혈관 세포에서 그들을 차별화 수 있는 이러한 pericytes의 독특한 생물 학적 마커 없는 있다. 혈소판 파생 된 성장 인자 수용 체 β (PDGFRβ)와 신경/glial 원 2 (NG2)는 일반적으로 사용 되 마커는 모두 다른 혈관 세포도 하지만 pericytes에 선물. Pericytes의 더 다양 한 형태 및 단백질 식7에서 pericyte 하위 집합의 존재에 의해 복잡 합니다. 현재, 최고의 식별 마커 단백질의 조합 및 혈관 벽에서 pericyte의 독특한 위치에 의존 합니다. 여기 쥐 망막 microvascular pericytes, 즉, cryo-섹션, 전체 마운트, 당뇨의 및 절연 혈관 네트워크의 immunohistochemical PDGFRβ/NG2 얼룩에 대 한 세 가지 다른 조직 준비 기술 설명 합니다.

곳을 알아내는-섹션, 망막과 공 막 시 신경을 통해 잘립니다. 신경의 모든 계층 구조의 시각화 수 있습니다. 망막의 고유 10 층 등 되며/오신 형광 핵 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8얼룩으로 구상 될 수 있다 핵 및 axonal/돌기 구조를 교환으로 명백 하다. 레이어9 와 그것은 신진 대사 요구 사항을 다 특정 층의 두께 또는 총 휴무를 결정 하는 방법을 제공 한다 (예를 들어, 망막 신경 절 세포의 손실 이다 망막 허 혈10의 특징 중 하나 11). 맥 관 구조 가로 각각 망막 층12,13내의 모 세관 plexuses를 별도로 공부 하는 게 가능 하 망막을 통해 삭감으로 분명 하다.

더 전통적으로, 망막 맥 관 구조 네트워크의 조사는 망막 전체-마운트에 수행 됩니다. 이 조직 준비, 망막은 잘라내어 꽃 모양의 구조로 결합. 메서드는 전체 아키텍처 망막 맥 관 구조를 강조 표시할 수 있습니다 상대적으로 빠른 조직 준비 기술 이며 따라서 neovascularization murine 망막에서의 조사에 적용 종종. 전체 장착 망막에 microvasculature의 성공적인 시각화 또한 개발 신생아 마우스와 쥐 망막14,15,,1617,18, 에서 보고 19.이 연구는 신생아 망막14에 비해 성인에서 더 큰 모 세관 자유로운 지역으로 더 정의 된 pericytic 활동을 공개.

시각화의 또 다른 방법은 소형 격리 후 망막 microvasculature입니다. 이 조직 준비 기술 망막 혈관과 신경 세포의 해제 되 고 모세 혈관에서 발생 합니다. 격리 망막 혈관 네트워크의 2 차원 이미지의이 유형은 일반적으로 망막 트립 신 소화20 후 수행 하 고 pericyte 손실 및 모 세관을 포함 하 여 당뇨병 성 망막 증의 혈관 이상이 평가 하는 데 사용 변성20,,2122. 침투성 격리 방법 그들은 RT-PCR와 서쪽 더 럽 히23,,2425완료 되었습니다 망막 혈관 유전자와 단백질 규제 응답의 조사를 제공 합니다. 여기 검사 microvascular pericytes 트립 신 소화 하는 대신 소형 고립 된 망막 맥 관 구조의 무료-플 로트 immunohistochemical 얼룩에 대 한 프로토콜을 제공 합니다.

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프로토콜

프로토콜 최적화 하 고 성인 남성 알 비 노 쥐에 설명 했다. 모든 실험 절차, 동물 ARVO 문에서 규정 안과 및 비전 연구에 있는 동물의 사용에 대 한 치료 했다. 동물은 이산화탄소와 이후 자 궁 경부 전위에 의해 안락사 되었다.

1. 쥐 망막 조직 준비

  1. 곳을 알아내는-섹션
    1. 메스로 쥐 눈 꺼 풀에 후부 및 이전 ~0.5 cm의 가늘고 길게 찢어진 곳을 확인 합니다.
      1. 선택 사항: 투 열 버너를 사용 하 고 포함 하는 동안 제복 패션에 눈을 찾으시는 시 신경을 통해 수직 cryostat 단면에 대 한 내부 각도에 눈을 표시 합니다.
    2. 집게와 눈을 신중 하 게 주변 조직이 노출 측면 기울기. 연결 및 근육 조직에 해 부가 위 컷 하 여 눈을 enucleate.
      주의: 당기지 마십시오 눈 너무 열심히 시 신경에 과도 한 압력 망막 손상이 발생할 수 있습니다.
    3. 넣어 눈 짧게 4% 포름알데히드에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 메스의 팁과 가벼운 압력을 적용 하 여 각 막 limbus에서 초기 구멍을 만들기 전에 안정.
    4. 현미경으로 각 막 제거 하 고 2-4 h에 대 한 PBS에 4% 포름알데히드에 잠수 하기 전에 집게를 가진 렌즈를 제거 해 부가 위 각 막 limbus 따라 자릅니다.
    5. 자당 10%와 25% 자당 Sörensen의 인산 염 버퍼에 순차적으로 헹 구 십시오.
    6. Yazulla 매체 돼지 피부와 30% 알 부 민 닭고기 달걀 흰색에서에서 3% 젤라틴 준비에 포함 합니다.
      참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기-20 ° c.에 조직 스토리지
  2. 전체-마운트
    1. 메스로 쥐 눈 꺼 풀에 후부 및 이전 ~0.5 cm 가늘고 길게 찢어진 곳을 확인 합니다.
    2. 집게와 눈을 신중 하 게 주변 조직이 노출 측면 기울기. 연결 및 근육 조직에 해 부가 위 컷 하 여 눈을 enucleate.
      주의: 당기지 마십시오 눈 너무 열심히 시 신경에 과도 한 압력 망막 손상이 발생할 수 있습니다.
    3. 짧게 메스의 팁과 가벼운 압력을 적용 하 여 각 막 limbus에서 초기 구멍을 만들기 전에 안정화를 PBS에서 4% 포름알데히드에 눈을 넣어.
    4. 현미경으로 각 막 제거 하 고 집게로 렌즈를 제거 해 부가 위 각 막 limbus 따라 자릅니다.
    5. 망막 시 신경으로 망막 색소 상피에서 집게 주요 찢는 피하기 위해 작은 개방 움직임을 사용 하 여 구분 합니다.
    6. 해 부가 위 시 신경에서 망막 및 시 신경 머리 쪽으로 망막 주변에서 몇 밀리미터 길이의 4 개의 가늘고 길게 찢어진 곳을 확인 합니다.
    7. 유리 슬라이드에 망막을 확산 하 고 5-10 분 동안 건조 허용 합니다.
    8. 포름알데히드는 망막에 떨어지는 여 20-30 분 동안 4% 포름알데히드를 수정 했다.
      주의: 유리에서 분리 수 있습니다으로 망막에 직접 적용 되지 않습니다.
    9. PBS와 린스. 최적의 결과 rinsing 후 직접 면역-얼룩
  3. 침투성 절연
    1. 메스로 쥐 눈 꺼 풀에 후부 및 이전 ~0.5 cm 가늘고 길게 찢어진 곳을 확인 합니다.
    2. 집게와 눈을 신중 하 게 주변 조직이 노출 측면 기울기. 연결 및 근육 조직에 해 부가 위 컷 하 여 눈을 enucleate.
      주의: 당기지 마십시오 눈 너무 열심히 시 신경에 과도 한 압력 망막 손상이 발생할 수 있습니다.
    3. 메스의 팁과 가벼운 압력을 적용 하 여 각 막 limbus에서 초기 구멍을 확인 합니다.
    4. 현미경으로 각 막 제거 하 고 집게로 렌즈를 제거 해 부가 위 각 막 limbus 따라 자릅니다.
    5. 망막 시 신경 머리 쪽으로 망막 색소 상피에서 집게 주요 찢는 피하기 위해 작은 개방 움직임을 사용 하 여 구분 합니다.
    6. 망막 시 신경에 해 부가 위 무료, 망막 24-잘 접시에 이온된 수 1 mL에 놓고 실 온에서 1 시간에 1.5 m m 진동 궤도와 200 rpm에 흔들.
      참고:이 하, 망막 표시 됩니다 덜 가장자리에서 정의 된.
    7. 1 망막 맥 관 구조에서 lysed 세포 파편을 분리 하 여 실 온에서 또 다른 30 분 동안 흔들어 200 U DNAse를 추가 합니다.
      참고: 파편 우물에서 폼을 시작할 수 있습니다.
    8. 최소 3 번 신경 세포 파편을 제거 하려면 150-300 rpm에서 떨고와 5 분 동안 이온된 물에에서 린스. 망막 신경 세포 파편의 제거를 나타내는 각 린스 더 투명 하 게 될 것입니다.
      1. 어두운 백그라운드를 사용 하 여 투명 한 절연된 망막 맥 관 구조를 명확 하 게 볼을 24-잘 접시로 봐야.
      2. (선택 사항): 진동 속도 맥 관 구조 나타나지 않으면 무료 신경 레이어 (반투명)의 시점에서 더 린스 단계를 추가 하거나, 또는 피펫으로 액체는 맥 관 구조에 발음을 사용 하 여.
        주의: 선택적 단계 중 하나는 맥 관 구조를 손상 수 있습니다.
    9. 실 온에서 PBS에 4 %paraformaldehyde 린스 PBS에 3 번의 1 mL에 10 분을 수정.
      참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 4 ° c.에 조직 스토리지

2입니다. Immunohistochemistry

  1. 곳을 알아내는-섹션의 얼룩
    1. 10 µ m cryo-섹션 젤라틴 포함 망막 시 신경 통해 수직 단면으로 잘라내어 유리 슬라이드에 게 건조 (최소 1 시간) 곳을 알아내는-섹션을 두고.
    2. 0.25%와 PBS에서 유리 슬라이드 잠수함 트라이 톤 X-100 (PBS-T) 15 분.
    3. 1: 100 PDGFRβ, PBS-T + 1% BSA cryo-섹션에 희석 1: 500 NG2 기본 항 체를 drip 하 고 하룻밤 4 ° C에서 보육 실에서 품 어.
    4. PBS-T 15 분에 2 번 유리 슬라이드 잠수함 그리고 1: 100 반대로 마우스 알 렉 사 Fluor 594 연결 하 고 1: 100 반 토끼 FITC 연결 보조 항 체 PBS-T cryo-섹션에 3 %BSA에서 희석을 똑.
    5. 유리 슬라이드는 어둠 속에서 실 온에서 1 h를 품 어.
    6. PBS-T 2 x 15 분에에서 유리 슬라이드를 씻어.
      참고: 옵션: 더블, 트리플 immunofluorescent 얼룩이 지기에 대 한 순차적 얼룩 수행할 수 있습니다 2, 3 번 각각 2.1.6 2.1.3에서 절차를 반복 하 여.
    7. 안티-페이딩 마운팅 중간 포함 DAPI는 coverslip로 얼룩진된 곳을 알아내는-섹션을 탑재 합니다.
  2. 전체-마운트의 얼룩
    1. PBS-T 전체 마운트에 똑 하 고 15 분 동안 실 온에서 품 어.
    2. 부 어 하 고 1: 100 PDGFRβ, PBS-T + 1 %BSA 희석 1: 500 NG2 기본 항 체 물방울 4 ° C에서 촉촉한 실에서 밤새 품 어.
    3. 부 어 하 고 PBS-T를 2 x 15 분에 유리 슬라이드를 씻어에 똑.
    4. 부 어 하 고 1: 100 반 토끼 Cy2-고 1: 100 반대로 마우스 Cy3 연결 이차 항 체 품 어 어둠 속에서 실 온에서 습 한 약 실에 1 시간에 3 %BSA PBS-T에 희석에 똑.
    5. 부 어 하 고 어둠 속에서 2 x 15 분에 린스를 PBS-T에 똑.
      참고: 옵션: 더블, 트리플 immunofluorescent 얼룩이 지기에 대 한 순차적 얼룩 수행할 수 있습니다 2, 3 번 각각 2.2.5 2.2.2에서 절차를 반복 하 여.
    6. 안티-페이딩 마운팅 중간 포함 DAPI는 coverslip로 얼룩진된 전체 마운트를 탑재 합니다.
  3. 소형 고립 된 맥 관 구조의 얼룩
    1. 소형 고립 된 맥 관 구조 100 rpm 및 실내 온도 10% 당나귀 혈 청 PBS에 희석의 500 µ L/잘 떨고와 1 시간을 차단 합니다.
    2. 하룻밤 실 온에서 품 어와 1: 100 PDGFRβ 및 1: 500 NG2 1 차 항 체에 PBS에 10% 당나귀 혈 청 희석의 600 µ L/잘 100 rpm 동요.
    3. 행 구 기는 망막 5 분에 대 한 PBS에 3 x 네트워크와 1: 100 반대로 마우스 알 렉 사 Fluor 594 연결 하 고 1: 100 반 토끼 FITC 연결 보조 항 체에 PBS 떨고 100 rpm 및 어둠 속에서 1 시간 실 온에 10% 당나귀 혈 청 희석에 품 어
    4. 5 분에 대 한 PBS-T에서 헹 구 고 어둠 속에서 PBS-T에서 3 x 5 분 린스 다음 15 분 동안 0.2 ng/mL PBS T에 DAPI에서에서 품 어.
    5. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로의 끝을 잘라, PBS-T와 함께 그것을 축 축 하 고 4-잘 유리 챔버 슬라이드를 망막 네트워크를 전송 하는 데 사용할.
      참고: moistening 단계는 파스퇴르 피펫으로의 내부에 집착 하는 망막 맥 관 구조를 방지 해야 합니다.
    6. 망막 맥 관 구조를 전개. 이 엉 킴을 맥 관 구조를 발생할 수 있습니다 집게와 망막 맥 관 구조를 만지지 마십시오.
      참고: 전개 할 수 챔버 슬라이드를 앞뒤로 기울이기 또는 망막 맥 관 구조에 액체의 방울 발음.
    7. 우물에서 매체를 제거 합니다. 액체의 표면 장력은 슬라이드의 아래쪽에 맥 관 구조를 평평 것입니다.
    8. 현미경으로 올바른 전개 챔버 슬라이드에서 우물 플라스틱을 제거 하기 전에 확인 합니다.
    9. 안티-페이딩 장착 매체와는 coverslip 스테인드 맥 관 구조를 탑재 합니다.

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결과

성공적인 프로토콜 microvascular pericytes를 시각화에 대 한 세 가지 다른 망막 준비를 제공 합니다. 이러한 각 메서드 PDGFRβ 및 NG2 immunoreactivity 공동 지역화와 모 세관 내 피 foridentification 주위에 포장 하는 pericytes의 독특한 위치를 사용 합니다.

곳을 알아내는-섹션, 신경 레이어 DAPI 셔 서 핵과 내부 형광 밀도 의해 확인 될 수 있다와 깊은 모 세관 plexuses 포함 PDGFRβ 그리고 NG2 immunoreactivity (그림 1)를 표시 하는 pericytes. 선박 (그림 1, 화살표)의 주변에 원형 또는 말굽 모양의 immunoreactivity로 혈관 벽에 peric...

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토론

선물이 microvascular 망막 pericytes의 연구에 적용 될 수 있는 3 개의 망막 준비 기술. 아래, 우리 각 메서드 사이 비교를 제공 하 고 프로토콜에서 중요 한 단계를 강조.

곳을 알아내는-단면, 망막은 잘라 화살 섹션에 따라서, 그것은 동일한 망막에서 수많은 견본을 얻을 수. 이 방법에서 결과 숫자 섹션 항 체 특이성 및 적정 테스트로 불필요 한 동물 희생을 방지 하기 위한 이상적인 선택 하기가. 예비 일은 좋은 결과 위해 결정적 이다. 그것은 눈을 안 하지만 눈 주위의 모든 근육을 잘라 눈 해 부 동안 중요 합니다. 힘을 사용 하는 경우 망막의 위험이 있다. 눈 컵은 얇은, 때문에 하나 하지 너무 오래 수정 해야 합니다. 2-4 h에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 침수 조직을 해결 됩니다. 더 이상 고정, 관심사의 항 원을 파괴의 위험이 있다. 최고의 가능한 immunostainings를 생성 하기 위해 그것은 유리에 대 한 가능한 플랫...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

연구는 Lundbeck 재단, 덴마크에 의해 투자 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
돼지 껍질에서 추출한 젤레틴Sigma-AldrichG2625-500G
닭 달걀 흰자에서 추출한 알부민Sigma-AldrichA5253-500G
디옥시리보뉴클레아제(DNAse) 소 췌장에서 추출한 ISigma-AldrichD5025-15KU0.15M NaCl에 용해
소 혈청 알부민(BSA)VWR0332-100G
일반 당나귀 혈청잭슨 ImmunoResearch017-000-121, 로트 129348
토끼 anti-PDGFRβSanta Cruzsc-4321:100
Mouse anti-NG2Abcamab500091:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure 당나귀 Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-585-1521:100
Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-095-1511:100
Cy2 AffiniPure 당나귀 Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-225-1521:100
Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 마우스 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-165-1501:100
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MGDMSO
안티 페이딩 마운팅 매체Vector LaboratoriesH-1000
안티 페이딩 마운팅 미디어 with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Nunc Lab-Tek II 4웰 챔버 슬라이드Thermo Fisher Scientific154526
에 용해

참고문헌

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