암 관련 피로에 미토 콘 드리 아 기능의 역할 평가

Summary

우리의 목표는 암 환자의 피로와 관련 된 미토 콘 드 리아 기능 장애를 평가 하는 실용적인 프로토콜을 개발 했다. 이 혁신적인 프로토콜 임상 사용 관련 표준 정 및 기본적인 실험실 절차에 최적화 되어 있습니다.

Abstract

피로 공통 이며 조건에 영향을 미치는 대부분의 암 환자를 쇠 약. 날짜 하려면, 피로 남아 제대로 없는 진단 특징을 객관적으로 측정이 상태의 심각도 테스트 합니다. 여기는 PBMCs 피로 암 환자에서 수집의 미토 콘 드리 아 기능을 평가 하기 위한 최적화 방법에 설명 합니다. 조밀한 extracellular 플럭스 시스템 및 호흡 저 해제의 순차 주사를 사용 하 여, 우리 검사 PBMC 미토 콘 드 리아 기능 상태 측정 기저 미토 콘 드리 아 호흡, 예비 호흡기 용량 및 에너지 표현 형, 설명 스트레스에 대응 하는 기본 에너지 통로. 신선한 PBMCs 표준 정을 사용 하 여 임상 설정에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 전체 분석 결과 복잡 한 생 화 확 적인 기술의 참여 없이 4 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 또한,는 재현할 수 데이터를 얻기 위해 필요한 정규화 방법에 설명 합니다. 간단한 절차 및 정규화 방법 제시 동일한 환자 및 잠재적인 치료 효과 평가 하는 시간 포인트 사이 비교 될 수 있는 재현 가능한 데이터의 생성에서 반복된 샘플 컬렉션에 대 한 허용.

Introduction

피로 암 환자¹의 삶의 질에 부정적인 영향이 우세 하 고 비참 한 상태 이다. 이 날짜에 암 피로 가난 하 게 정의 된 유적과 환자²주관적인 보고에 의존. 따라서, 객관적 임상 설정^3,4에서 피로 특성을 쉽게 적응 진단 실험실 테스트를 식별 하는 긴급 한 필요가 있다.

미토 콘 드리 아 기능 장애를 포함 하 여 여러 기본 메커니즘을 피로⁵제안 되었습니다. 미토 콘 드리 아 발전소 세포, 산화 인 산화를 통해 세포 에너지의 95%를 제공 하 고 칼슘 신호, apoptosis, 면역 신호 및 다른 세포내 신호 이벤트⁶ 의 규칙에 중요 한 역 . 따라서 장애인된 미토 콘 드리 아 생체 및 결함 에너지 생산에 피로에 기여할 수 있습니다. 이 가설을 지원, 이전 연구는 만성 피로 증후군⁷환자에서 미토 콘 드리 아 DNA에 돌연변이 관찰. 피로의 병 태 생리 기원 중앙 신경 조직 또는 주변 조직, 골격 근육^8,9, 같은 거짓말 여부 불분명 남아 있지만 방법은 현재 없습니다 직접 정확 하 게 평가 하 미토 콘 드 리아 기능 장애, 다 셀에 피로 관련 된.

미토 콘 드리 아 기능 연구에 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 사용 하 여 여러 가지 이점을 제공 합니다. 첫째, PBMCs는 표준 정을 사용 하 여 임상 설정에서 쉽게 사용할 수 있으며 기본적인 실험 기법을 사용 하 여 신속 하 게 격리 될 수 있습니다. 둘째, 혈액 컬렉션 수집 근육 생 검 등 다른 조직 보다 적게 침략 적 이다. 따라서, 혈액 샘플을 수집할 수 있습니다 동일한 환자에서 반복적으로 시간이 지남에, 치료 효과의 경도 평가 용이. 흥미롭게도, PBMCs에서 미토 콘 드리 아 기능 동물 모델¹⁰신장 미토 콘 드 리아 상태와 상관 잘 될 것으로 보인다. 또한, 면역 세포 미토 콘 드리 아 다른 질병 조건^11,12에서 조직의 변화를 탐지 하기 위한 프록시로 사용 되었습니다. 순환 하는 면역 세포에서 미토 콘 드리 아 특히 면역성이 있는 기능에 있는 변화에 과민 하 고 면역 신호 분자 cytokines^13,,1415같은 있습니다. 예를 들어 류 마티스 급성 염증 성 질병을 가진 환자에서 PBMCs 높은 기준선 산소 소비¹⁴전시 관찰 되었습니다. 반면, 산소 소비는 패 혈 증¹⁶를 포함 하 여 조직의 염증 상태 환자에서 분리 된 PBMCs에서 감소 되었다. 염증 성 조건 하에서 자유 래 디 칼 역 기능 mitochondria 제작한 더 높은 산화 스트레스와 장기 염증¹⁷에 기여할 수 있습니다. 산화 긴장에서 뿐만 아니라 에너지 생산에 미토 콘 드리 아의 역할 암 환자 ¹³피로 공부에 대 한 프록시로 미토 콘 드리 아 기능을 사용 하 여 잠재적인 유틸리티를 나왔다.

생 화 확 적인 기술, 미토 콘 드리 아 막 잠재력 측정, 또는 임상 설정^5, 에서 쉽게 적응 되지 않을 수 있습니다 특정 세포 인구의 절연을 활용 하는 미토 콘 드리 아 기능을 검사 하는 이전 연구 ^14,18. 최근 몇 년 동안, 세포 외 유출 분석 실험의 개발 연구자를 쉽게 허용 하 고 정확 하 게 응답 호흡 억제제^19,20 의 자동된 주입으로 산소 소비 속도 (OCR)에 변화를 검사 ^{, 21 , 그러나 22}., 이러한 연구의 대부분은 특정 세포 유형에 대 한 디자인과 높은 처리량 대형 임상 설정에 적용 되지 않을 수 있습니다. 이 원고에서 우리는 임상 사용에 대 한 미토 콘 드리 아 기능을 조사 하기 위한 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다.

Protocol

현재 연구 (NCT00852111)에 의해은 기관 검토 위원회 (IRB)의 국립 보건원의 건강 (NIH), 베 데스 다, 메릴랜드 승인 되었다. 이 연구에 등록 참가자 euthymic 남자 18 세, 이전 전립선의 유무에 관계 없이 비 전이성 전립선 암 진단을 받은 사람과 했다 외부 광속 방사선 요법 (EBRT) 받을 예정. 만약 그들이 진보적인 질병 상당한 피로 일으킬 수 있는 잠재적인 참가자 제외 됐다 지난 5 년 이내 정신 질병을 했다, 했다 교정된 hypothyroidism 또는 빈 혈, 또는 두 번째 종은 했다. 진정 제, 스테로이드, 또는 비 스테로이드 항 염증 제 대리인을 사용 하는 개인도 제외 했다. 건강 한 제어 혈액 샘플 NIH 부의 수혈 의학에는 IRB 승인 프로토콜 (NCT00001846)에서 건강 한 기증자 로부터 얻은 했다. 모든 참가자는 Magnuson 임상 연구 센터는 NIH에서 보충 했다. 서명 된 서 면된 통지 해준 동의 연구 참여 전에 얻은 했다.

1. 미토 콘 드리 아 기능 측정 준비 (실험의 1 일)

1. 센서 카트리지 수 화 ( 재료의 테이블; 대략적인 기간을 참조: 5 분).
   1. 패키지에서 센서 카트리지를 제거 합니다. 400 μ Calibrant 솔루션으로 각 자 채우기 다음 유틸리티 플레이트의 각 음에 200 μ Calibrant 솔루션을 추가 합니다.
   2. 지금 그것에 있는 Calibrant 솔루션 유틸리티 접시에 센서 플레이트를 반환 합니다. 하룻밤 비 CO₂ 37 ° C 배양 기에서 카트리지를 하이드 레이트.
      참고: 센서 카트리지 4 h의 최소 및 최대 72 h 화 될 필요가 있다.

2. 임상 샘플 준비 (실험의 주 2)

1. 13 항목 기능 평가의 만성 질환 치료-(EBRT 개시) 전에 기준선, 중간점, EBRT, 1 년제 포스트 EBRT의 완성 피로 (FACIT-F)^2,23,24 를 사용 하 여 피로 측정 합니다.
   1. 0-사용 하 여 각 항목 응답, 어디 0 "전혀" 나타내고 4는 응답자에 관한 해당 문이 "대단히." 나타냅니다 4 규모 총 점수는 높은 피로 강도 반영 하는 낮은 점수와 16-53에서 범위 해야 합니다.
   2. FACIT F 점수 43, 보다 낮은 점수로 FACIT F ≥43의의 부재 또는 하지 임상-의미 있는 피로²나타내는으로 피로 정의 합니다.
      참고: 43 최고의 FACIT F 점수는 환자와 일반 인구²의 피로 점수 나눕니다.
   3. FACIT 피로 규모에 다음 13 항목을 포함: 1) 기분이 피로; 2) 나 온통; 약한 느낌 3) 기분이 무관심 ("세척 밖 으로"); 4) 나는 피곤해; 5) 나는 문제가 시작 하는 것 들 때문에 피곤; 6) 나는 문제가 피곤; 이기 때문에 일을 마무리 7) 나는 에너지; 8) 내가 내 평소 활동을 할 수 9) 나 낮; 자 필요 10) 내가 너무 피곤해 서 먹는; 11) 내가 내 평소 활동을 하 고 도움이 필요 12) 나; 하려는 일을 너무 피곤 되 고에 의해 좌절 해요 그리고 13) 나 난 피곤 때문에 내 사회 활동을 제한 하는.
2. 갓 수집 된 혈액 샘플에서 PBMC를 분리 (대략적인 소요 시간: 1 시간).
   1. 단 세포 준비 관으로 8 mL의 혈액을 수집 ( 재료의 표참조).
      참고: 혈액 샘플 컬렉션의 2 시간 이내 처리 한다. 혈액 샘플 샘플 수집 후 2 시간 이상 처리 하는 경우 PBMCs의 품질을 손상 될 수 있습니다.
   2. 실 온 (18-25 ° C)에서 30 분 동안 1750 x g에서 원심. 15 mL 원뿔 튜브에 흐림 레이어를 전송. PBS의 15 mL를 추가 하 고 5 번 반전.
   3. 4 ° c.에 15 분 동안 300 x g에서 원심 조심 스럽게 제거 하 고 방해 펠 릿 없이 상쾌한 삭제. 다시 10 mL PBS, 추가 하 여 펠 릿을 일시 중단 하 고 5 번 반전.
   4. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기 액체 표면에 뜨는 삭제 하 고 다시 1 mL PBS에에서 셀을 일시 중단. 1.5 mL microfuge 관에는 PBMCs를 전송 합니다.
   5. 610 x g에서 10 분간 원심. 신중 하 게 상쾌한을 제거 하 고 완전 한 RPMI-1640 년에 펠 릿을 resuspend (RPMI-1640 보충 10 %FBS, 10mm 페니실린/스).
3. 비 부착 한 세포에 대 한 셀 번호판 코트 (대략적인 소요 시간: 30 분).
   1. 세포 및 조직 접착제 솔루션을 준비 ( 재료의 표참조) 0.1 M 나트륨 중 탄산염 pH 8.0에서에서 재고 솔루션을 diluting 하 여. 작업 솔루션 3.5 μ g/c m² 의 영역에 있어야 합니다.
      참고:이 솔루션에는 해양 홍합 Mytilus 새싹에서 추출한 polyphenolic 단백질을 포함 되어 있습니다. 이 단백질은 표면에 자체를 홍합에서 분 비 하는 접착제의 주요 구성 요소. 우리는 세포 탁 PBMCs와 함께 최고의 작품을 찾을.
   2. 각 잘을 희석된 접착제 솔루션의 100 μ를 추가 하 고 실내 온도에 적어도 20 분 동안 품 어. 씻어 세 번 디 물과 공기 건조.

3. 미토 콘 드리 아 기능 측정

1. 분석 결과 미디어의 준비 (대략적인 소요 시간: 10 분).
   참고: 분석 결과 미디어 준비 되어야 한다 갓 실험의 날에.
   1. L-글루타민, pyruvate, 및 포도 당 미디어 (동일한 성분 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 하지 않고 탄산, 포도 당, 글루타민, 또는 나트륨 pyruvate) 기반 분석 결과 미디어를 추가 합니다. 미디어를 따뜻하게 37 ° c, pH 7.4에 조정.
      참고: L-글루타민, pyruvate, 및 포도 당 농도 일반적으로 정상적인 성장 미디어, 농도와 동일 하지만 분석 결과에 따라 조정 될 수 있다.
2. PBMCs 미토 스트레스 테스트에 대 한 준비 (대략적인 소요 시간: 2 시간).
   1. 각 잘 80-90 %confluency 도달에 2 단계에서에서 충분 한 PBMCs를 접시. 우리의 경험에서 1.5 x 10⁵ 셀/잘 가장 일관 된 결과 얻지 못했다.
      참고: 웰 스 A와 H 배경 우물 이며, 분석 결과 미디어 셀 포함. 스 B g, outliers를 담당 하기 위해 환자 샘플 당 적어도 3-6 우물을 도금 하는 것이 좋습니다.
   2. 우물의 바닥에 셀 수 있도록 2 분 200 x g에서 내려 접시를 회전 합니다. 한 번 분석 결과 미디어와 세포를 씻어. 이 단계는 성장 매체에서 혈 청 및 나트륨 중 탄산염을 제거합니다.
      참고: 우리의 경험에서 세척 단계 일반적으로 제거 됩니다 셀의 20-30%.
   3. 45-60 분에 대 한 비 CO₂ 37 ° C 배양 기에서 배경 웰 스 A와 헤 품을 포함 하 여 각 음에 180 μ 분석 결과 미디어를 추가 합니다.
3. 미토 스트레스 테스트 실행
   1. 마약 분석 결과 미디어와 미토 스트레스 키트에 다음과 같이 다시 구성:
      1. Oligomycin: 50 μ M에서 재고 솔루션을 생성 하기 위해 유리병에 252 μ 분석 결과 미디어를 추가 합니다.
      2. FCCP: 50 μ M에서 재고 솔루션을 생성 하기 위해 유리병에 분석 결과 미디어의 288 μ를 추가 합니다.
      3. Antimycin A /로 테 논: 25 μ M에서 재고 솔루션을 생성 하기 위해 유리병에 분석 결과 미디어의 추가 216 μ.
   2. 소용돌이 약 1 분간 약을 재구성 된다. 작업 솔루션으로 희석.
      참고: 작업 솔루션의 농도 적정 및 셀 유형에 따라 실험 전에 미리 결정 되어야 한다. PBMCs, 우리 찾을 Oligomycin의 그 1 μ M, 1 μ M FCCP, 그리고 0.5 μ M antimycin A로 테 논 최고 작동 /.
   3. 약 플라스틱 센서 카트리지에서 각 포트에 순차적으로:
      1. 포트 a: 10 μ M의 피 펫 20 μ Oligomycin, 1 μ M의 각 음에 최종 농도 대 한.
      2. 포트 b: 피 펫 22 μ 1 μ M의 각 음에 최종 농도 10 μ M FCCP의.
      3. 포트 c: 5 μ M antimycin A의 피 펫 25 μ / 0.5 μ M의 각 음에 최종 농도 대 한로 테 논.
4. 세포 외 유출 악기에 "미토 스트레스 테스트"를 선택 합니다. 악기 프롬프트를 따라을 센서 카트리지를 삽입 합니다. 악기는 자동으로 센서 캘리브레이션을 수행 합니다. 센서 교정 및 악기 분석 결과의 나머지를 완료 것입니다 셀 플레이트를 삽입 합니다. 530에서 산소 역학 측정 nm (여기) / 650nm (방출), 470에 양성자 농도 측정은 nm (여기) / 530 nm (방출).

4입니다. 미토 콘 드리 아 기능 데이터의 정규화

1. 셀 확산 분석 결과 솔루션 준비 (대략적인 소요 시간: 5 분).
   1. 48 μ 핵 산 얼룩 (500 x)와 240 μ 배경 억압 11.7 mL PBS 추가 (2 배). 핵 산 얼룩 셀 permeant DNA 바인딩 염료 이며 배경 억압은 죽은 셀 또는 셀에서 얼룩이 되 고 손상 된 세포 막 무결성을 차단 마스크 염료. DNA 묶는 염료와 배경 억압의 조합은 라이브 셀은 스테인드 보장 합니다.
   2. 미토 스트레스 테스트 완료 된 후에 각 잘 매체에 직접 작업 솔루션 (180 μ) x 2의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
2. 45-60 분 계량 508에서 플레이트 리더에 라이브 셀 (형광)의 수에 대 한 37 ° C 배양 기에서 세포 확산 분석 결과 솔루션의 셀을 품 어 nm (여기) / 527 nm (방출) OCR 데이터를 정규화 (대략적인 소요 시간: 10 분) .
   참고: 숫자 라이브 셀 이외에 선택할 수 있습니다 또한 셀의 총 수, 핵 산, 단백질 농도, 등등의 그들의 데이터를 정상화.

Results

미토 스트레스 테스트는 완전 한 미토 콘 드리 아 프로 파일을 매핑하는 데 다양 한 호흡 억제제의 순차 주사 후 산소 소비 속도 (OCR) 측정에 의존 합니다. 미토 콘 드리 아 건강에 관련 된 OCR 측정 후 각 약물 주입 다음 매개 변수를 계산 하는 데 사용 수: 기저 OCR 은 먼저 쉬고 레벨 ATP 수요를 충족 하는 데 필요한 산소 소비를 평가 하기 위해 어떤 약물 주입 하기 전에 측정. 기초 호흡 oligomycin 주입 전에 OCR 기준선에서 비-미토 콘 드리 아 호흡 속도 빼서 계산 됩니다. 다음, oligomycin ATP synthase (복잡 한 V)의 양성자 채널을 억제 하기 위해 주입 됩니다. Oligomycin 주입 후 OCR에 후속 드롭 ATP 생산 관련 산소 소비를 나타냅니다. FCCP (Carbonyl 시안 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), 양성자...

Discussion

암 환자의 피로 잘 정의 되지 않은 또는 특징¹쇠 약 조건입니다. 피로의 진단은 전적으로 주관적인 보고에 의존 하며 현재 진단 표준 또는 그것의 pathobiology²에 대 한 이해의 부족 때문에 주로이 조건에 대 한 치료. 암 환자에서 피로 기본 제안 된 메커니즘의 미토 콘 드 리아 기능에서 장애는 가장 치료 대상 경로 중 하나입니다. 따라서, 우리 임상 샘플 사전 개발을 일찍 피로를 포함 하 여 암 치료 관련 독성 위험 환자를 식별 하는 데 사용할 수 있는 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하기 위한 신속 하 고 실용적인 방법을 개발 관리는 제정 될 수 있다.

호흡 억제제의 순차 주사와 함께에서 세포 외 유출 기술 미토 콘 드 리아 기능 상태 평가 대 한 허용 사용 되었습니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo 모델¹⁹...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CPT 단핵 세포 준비 튜브	BD Biosciences	362761	정맥 절개술 후 PBMC를 분리하기 위한
RPMI-1640	Corning	10-040	PBMCs
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-010-CV	PBMCs
페니실린/스트렙토마이신	ThermoFisher	15140122	PBMCs
Cell-Tak	Corning	354240	세포 및 조직 접착 용액의 성장 배지 제작, 현탁 세포가 표면에
부착할 수 있도록 합니다.Seahorse XF Calibrant 솔루션	Agilent	103059-000	하이드레이팅 카트리지용
XFp Fluxpak (미니플레이트 및 센서 카트리지)	Agilent	103022-100	XFp 세포 배양 미니플레이트 및 센서 카트리지 포함
XF 기본 배지	Agilent	103335-100	XF 분석 매체
45% 세포 배양 D-(+)-포도당 용액	Corning	25-037-CI	XF 제조용 분석 매체
나트륨 피루브산 용액	Corning	25-000-CI	XF 분석 매체
L-글루타민 용액	ThermoFisher	25030081	XF 분석 매체 제조용
Seahorse XFp Mito 스트레스 테스트 키트	Agilent	103010-100	올리고마이신, FCCP, 항마이신 A/로테논
함유 CyQUANT 직접 세포 증식 분석	ThermoFisher	C35011	살아있는 세포의 정량화 및 데이터 정규화용
Seahorse XFp 분석기	Agilent	S7802AEA	살아있는 세포의 미토콘드리아 기능 측정용
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(또는 플레이트의 형광 세포를 정량화할 수 있는 모든 기기)	BioTek	BTCYT5PV	살아있는 세포의 정량화 및 데이터 정규화