Bronchoalveolar 게 Exosomes Lipopolysaccharide 유도 정화 조 폐 상해에

요약

복 LPS에 드러낸 쥐에는 miRNAs와 함께 패키지 된 Broncho-치경 게 (BAL) 액체에 exosomes 분 비. 공동 문화 시스템을 사용 하 여, 우리 보여줍니다 발 액체에서 발표 하는 exosomes 기관지 상피 세포에서 꽉 접합 단백질의 표현을 방해 폐 상해를 강조 하는 프로 염증 성 cytokines의 표현을 증가.

초록

심각한 폐 상해 (알리) 및 급성 호흡 곤란 증후군 (아즈)는 높은 질병 률 및 사망률을가지고 계속 해 서 폐 질환의 이질적인 그룹을 나타냅니다. 알리의 분자 병 인 되 고 더 나은 정의; 그러나, 질병의 복잡 한 특성으로 인해 분자 치료는 아직 개발. 여기 급성 패 혈 증 폐 상해의 lipopolysaccharide (LPS) 유도 마우스 모델 사용 하 여 exosomes 염증 반응에서의 역할의 윤곽을 그리 다. 이 모델을 사용 하 여, 쥐 복 LPS에 노출 되는 miRNA와 염증 반응 조절 cytokines 패키지 된 폐에서 Broncho 치경 게 (BAL) 액체에 exosomes 분 비는 보여줄 수 있었습니다. 추가 공동 문화 모델 시스템을 사용 하 여, 우리는 대 식 세포에서 풀어 놓인 exosomes 기관지 상피 세포에서 꽉 접합 단백질의 표현을 방해 보여. 이 결과 건의 염증 반응에 기여 하는 크로스 토크 1) exosomal 왕복을 통해 타고 난 면역 및 구조 세포 사이 및 구조상 방 벽 및 2) 타겟팅이 miRNAs의 치료 하는 새로운 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 알리 고 아즈입니다.

서론

알리와 아즈 생명이 형태의 약 1 백만 명 전세계에 영향을 미치는 비 cardiogenic 폐 부 종으로 인 한 심한 hypoxemia 호흡 실패는 매년¹. 아즈의 병 인 폐 감염 또는 포부와 간접 모욕의 다양 한에서 직접 상해를 포함합니다. 그러나 지난 10 년간 아즈의 분자 병 인의 증가 이해 되었습니다, 그리고, 아즈에 대 한 특정 타겟된 치료는 아직 수 개발^2,3.

심각한 폐 상해의 여러 동물 모델 실험 치료 인간 연구^4,5번역에 대 한 다리를 제공 하는 개발 되었습니다. 일반적으로 사용 되는 모델의 올레 산, 박테리아, LPS, 및 bleomycin 로컬 설치 포함. 다른 접근 국 소 빈 혈 reperfusion, cecal 결 찰 빵 꾸, 기계 환기-유발 스트레치 부상, hyperoxia 또는 박테리아의 LPS⁵조직 관리 포함. 임상 가설을 테스트 하는 유용한 생물 학적 시스템을 제공 하는 이러한 모델 및 잠재적인 치료의 개발에 대 한. 인....

프로토콜

전체 프로토콜에는 패 혈 증 유도의 첫날 및 동물, 및 마우스 BALF exosomes 절연에 대 한 두 번째 날에서 발 액체의 절연을 포함 하 여 2 일 필요 합니다. 모든 절차를 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 애틀랜타 VA 의료 센터에 의해 승인 되었습니다.

1. 마우스 급성 패 혈 증 폐 상해 모델

1. 사용 6-8 주-오래 된 남성 야생-타입 C57BL/6J 마우스 (20-22 g 중량) 동물에 대 한 모델, 그리고 무 균 기술 및 장비를 사용 하 여 모든 절차를 수행 합니다. 오토 클레이 브 집게와가 위 121 ° c.에 20 분을 포함 한 모든 수술 기구
2. 임의로 실험에 쥐 및 제어 그룹을 배포 합니다. 외과 보드에 쥐를 제 지. 복 경로 의해 대장균 lipopolysaccharide (LPS, 15 mg/kg)와 쥐를 취급 합니다. 개별 몸 무게에 따라 적절 한 LPS 복용량 마우스, 당 0.1 mL PBS에 희석 다음 LPS 솔루션 27 G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 주입 하 고 주입 제어 동물 PBS의 해당 볼륨.
3. 동물 BSL2 시설, 적절 한 실내 온도에서 깨끗 한 케이지로 구성 되어 마우스를 유지.
4. 24 h 후, CO

결과

정화 조 폐 상해를 유도, 쥐 복 LPS (15 mg/kg)로 대우 되었다. 그림 1A와 같이 LPS 관리의 24 시간 이내 neutrophilic 유입 폐에서 본 했다. 마우스 발 유체, 격리 및 정화 exosomes의 그려 했다. 형태학 BALF exosomes의 전자 전송 현미경 검사 법 (그림 1B)에 의해 확인 됐다.

선택적 프로-염증 성 miRNAs 미르-155와 미르-146a 표현 순화 exosomes에서 q-RT-PCR에 의해 감지 되었다. 미르-155와 미르-146a 식 수준 LPS, PBS (미르-155, 1 ± 0.16 대 11.6 ± 0.6, 미르-146a, 1 ± 0.12 대 13.5 ± 1.186) 제어 마우스 치료에 비해 치료 된 .......

토론

질병 마우스 모델은 특정 유전자의 생리 기능을 평가 하 고 실험²의 비용을 줄이기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 설명 된 급성 패 혈 증 폐 상해 여기 아즈와 인간에서 선 동적인 응답을 싫어 하지. 이 모델은 관련 분자 병 인, 바이오 마커의 개발 조사 하 고 잠재적인 새로운 치료⁵를 테스트 합니다.

공동 문화 시스템은 RNA, DNA, 지질, 및 단백질 체 외 시스템^23,30에 같은 생물 분자의 이동의 잠재적인 메커니즘을 조사 하는 맥락에서 vivo에서 학문에 대 한 관련. 이러한 플랫폼의 일부 기계적 이해의 평가 및 복잡 한 질병^22,23에 대 한 치료의 개발에 큰 유.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
지질다당류	Sigma-Aldrich	Escherichia coli 055:B5
PBS pH7.2(1X)	Life technologies	20012-027
mirVana miRNA 분리 키트	Thermo Fisher	449774
TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스	Thermo Fisher	4369016
mmu-miR-155 (002571) 프라이머	Thermo Fisher	4427975
has-miR-146a (000468) 프라이머	Thermo Fisher	4427975
U6snRNA 프라이머	Thermo Fisher	4427975
TNF-α( Mm00443258_m1 ) 프라이머	Thermo Fisher	4331182
IL-6 (Mm00446190_m1    ) 프라이머	써모 피셔	4331182
ZO-1 (Mm00493699_m1  )프라이머	Thermo Fisher	4331182
minimal essential medium (MEM)	Thermo Fisher	11095-072
Trysin-EDTA solution(0.05%)	Thermo Fisher	25300054
Exosomes는 PKH67에서 PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit으로 라벨링되었습니다.	Sigma-Aldrich	MINI67-1KT
엑소좀 스핀 컬럼 (MW3000)	Thermo Fisher	4484449
Beckman Coulter Optima L-100XP 초원심분리기	벡크만 쿨터	L-100XP
초투명 원심분리기 튜브	벡크만 쿨터	344058
Applied Biosystems 7500 고속 실시간 PCR 시스템	Thermo Fisher
투과 전자 현미경(TEM)	JEOL Ltd	120kV TEM
올림푸스 BX41 현미경	올림푸스	BX41