신선 하 고 냉동 위장 표본에서 subcellular 분류

요약

여기, 우리는 인간의 신선 하 고 냉동 장 biopsies에 세포질 및 핵 단백질의 subcellular 분리에 대 한 간단한 세포 분별 법을 수행 하는 프로토콜을 제시.

초록

이 프로토콜의 목적은 인간의 창 자 조직 특정 단백질 또는 다른 조직 (즉, 건강 한 상태에서 단백질 복합물의 지역화 분석에 대 한 핵 및 세포질 구획에 내 시경으로 얻은 충분치 대 질병)입니다. 이 메서드는 모두 신선 하 고 냉동 장 조직 샘플;의 분류 그것은 모든 실험실에 대 한 편리 하 고 시간이 소요입니다.

서론

단백질 세포 내의 거의 모든 생물 학적 기능에 참여 하 고 그들의 구조, 수량 또는 위치에 달라진 병원 성 시나리오를 발생할 수 있습니다. 조직 샘플 분류 메서드는 질병의 복잡성을 줄이기 위해 유용한 접근 관련 단백질 분석. 일부 연구 단백질 지역화 정보를 사용 하거나 특정 세포질 격실에서 단백질을 풍부 하 게 그대로 단백질의 재현 분별에 대 한 프로토콜은 특정 생물 학적 질문에 대답 하는 데 유용 합니다. 단백질의 subcellular 지 방화를 결정 하 고 그들의 compartmental 재배포 또는 기저에 상호 작용을 모니터링 질병 상태 질병을 식별 하는 데 도움이 됩니다 관련 기능 차이^1,2. 따라서,이 방법은 reproducibly 장 조직 생 검, 두 신선 하 고 냉동, 세포질 및 핵 subcellular 구획으로 충분치를 목표로 합니다.

장 생 샘플 정기적으로 내 시경 절차³ (그림 1) 동안 얻은 고 단백질 정량화 또는 immunoprecipitation 연구에 효과적으로 사용할 수 있습니다. 이후 조직 샘플에서 장의 상피 질병 병 인

프로토콜

이 연구는 Cruces 대학 병원 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 모든 과목 또는 그들의 부모 로부터 동의 가져온 후 분석 수행 했다.

1. 생 컬렉션

참고: 환자의 원심 십이지 장 생 검 표본 얻을 수 있습니다 일상적인 진단 내 시경 생 검 관리 동안 무게에 2, 10 밀리 그램 사이 범위. Biopsied 조직 상피, 면역과 내 피 세포를 포함 하 여 다른 세포 유형으로 구성 된 복잡 한 조직이 이다. 임상 소화기 전문 내과 내 시경을 수행 다음 임상 지침을 설립.

1. 내 시경 후 생 검 살 균 필터 종이에 놓습니다.
2. 집게를 사용 하 여을 1.5 mL 튜브에 biopsies 전송, PBS, 담가 cryotube로.
3. 실험실에 도착할 때까지 얼음에 튜브를 유지.
   1. 즉시 신선한 biopsies의 처리를 시작 합니다.
4. 냉동된 생 검, 플래시 동결 튜브를 포함 하는 생 검 및 사용까지 액체 질소에 저장.
   참고: 그것은 차가운 보충된 버퍼 1 추가 될 때까지 냉동 샘플을 유지 하는 것이 중요입니다.

2. 버퍼 준비

결과

그림 1 에서는 그대로 villi와 토 굴 구조는 장 생 섹션의 얼룩이 지는 hematoxylin 오신.

이 프로토콜을 사용 하 여 핵과 세포질 분별 법의 대표적인 결과 그림 2 와 3에 나와 있습니다. 신선한 (Fh), 냉동된 (Fz), 그림 2에 표시 된 실험에서 생 검 했다 동시에 분류 한 다음 여기에 제시 된 프로토콜 그리고 서쪽 오 점 각 샘플의 20 μ g를 사용 하 여 수행 되었다. 각 분수와 생 검에 단백질 농도 표 2에 표시 되 고 단백질 농도 매우 신선한 냉동된 조직 사이 다른. 2 mg biopsies에서 추출한 단백질의 수익률은 주위 3-4 µ g.......

토론

여기에 설명 된 프로토콜 장 검의 핵과 세포질 분별 법에 사용 됩니다. 순화 된 단백질 변성 하지 하 고 그림 2 와 3 만 immunoprecipitation, 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA) 같은 네이티브 접힌 단백질을 필요로 하는 분석 실험에 또한 같이 서쪽 오 점 분석에 사용 될 수 있다 또는 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 (페이지)

설명된 방법 삼 투 세포 세포 막 핵 막에 영향을 주지 않고 버스트 함께 조직의 기계적 균질에 의존 합니다. 다운스트림 분석에 사용할 세포질 및 핵 단백질의 깨끗 한 분별입니다. 그것은 단백질과 인산 가수분해 효소 억제제의 추가 의해 과정에서 단백질의 저하를 제어 해야 합니다. 또한, 추출 된 단백질 다운스트림 기능 분석에 사용 될 경우, 변성 및 샘플의 베이스를 피하기 위해 중요 하다 또한. 4 ° C에서 프로세스를 수행 해야 하.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HEPES	시그마 Aldrich	H4034-1kg
KCl	시그마 Aldrich	P9333-1kg
EDTA	시그마 Aldrich	E9884-100G
NaCl	시그마 Aldrich	5588886-1kg
DTT	시그마 Aldrich	10197777001
PMSF	Thermo Scientific	36978
단백질분해효소 및 인산가수분해효소 억제제	Thermo Scientific	A32959
NP-40	Sigma Aldrich	CA-630	세제
BCA 분석	Thermo Scientific	23227	단백질 정량 키트
일회용 플라스틱 유봉	Sigma Aldrich	Z359947-100EA
Dounce 균질기	VWR	431-0100
Microcentrifuge	Eppendorf	5415-R
Shacker	IKA	MS3 basic