여기, 우리는 예를 들어 Ala97Ser, 대만, 가장 일반적인 발병 변이 사용 하 여 유전 transthyretin amyloidosis의 진단에 대 한 점 돌연변이의 존재를 확인 하는 프로토콜 제시.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 검사 이며 유전 transthyretin에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 테스트 관련 amyloidosis transthyretin amyloidosis (ATTR)의 대부분의 경우에서 수행 되어야 합니다. 속성은 유형이 다른 고기;와 희귀 하지만 치명적인 질병 따라서, 진단 때로는 지연 됩니다. 관심과 ATTR 신흥 치료의 초기 발현에 광범위 한 인식 증가 함께 transthyretin (TTR) 유전자를 포함 하 여 적절 한 진단 연구, 테스트, 종류를 확인 하 고 ATTR의 변종 따라서 예 후를 개선 하기 위해 근본적인. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법으로 유전자 분석 TTR 점 돌연변이의 존재를 훨씬 더 신속 하 게 확인 하 고 남쪽 오 점 등 기존 방법 보다 안전. 여기, 우리가 ATTR Ala97Ser 돌연변이, 대만에서 가장 일반적인 발병 돌연변이의 유전자 확인을 보여 줍니다. 프로토콜 구성 4 가지 주요 단계: 수집 전 혈 견본, DNA 추출, PCR와 모든 4 개의 TTR exons의 유전자 분석 및 DNA 연속.
서론
Transthyretin (TTR) amyloidosis (ATTR) 조직의 유전 amyloidosis1, 가장 일반적인 형태 이며 transthyretin (TTR) 유전자2상 염색체 지배적 상속 된 돌연변이 의해 발생할 수 있습니다. TTR 돌연변이 tetrameric 단백질 구조를 불안정 하 게 하 고 녹말 체 소2로 재어셈블합니다 단위체로 그것의 분리 이어질. 100 amyloidogenic TTR 변이 보고 전세계1되었습니다. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법으로 유전자 분석 TTR 점 돌연변이의 존재를 확인 하 고 피하는 남쪽 오 점3에 비해 방사성 레이블이 프로브의 처리를 포함 하는 장점이 있다. PCR은 현대 과학4에 수많은 분야에 적용 된, 쉽게, 저렴 한, 빠르고 신뢰할 수 있는 기술입니다.
이 진보 및 치명적인 질병의 조기 진단의 phenotypic이 주어진 도전 이다. 관심과 ATTR 신흥 치료5의 초기 발현에 광범위 한....
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프로토콜
임상 실험실 개선 개정 (CLIA) 1988 년의 기관 검토 위원회의 장 궁 메모 리얼 병원에서 승인 하는 규정 요구 사항에 따라 실시 되었다 테스트 실험실에서 수행 하 고 대학 (라이센스 번호 100-4470A3 및 104-2462A3). 동의 모든 환자에서 얻은 했다.
1. 혈액 표본 수집
- 상업적으로 사용할 수 있는 치료를 EDTA 튜브로 전체 혈액을 수집 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 처리까지 4 ° C에서 혈액 샘플을 저장 합니다.
2. 말 초 혈액에서 DNA 추출
DNA 추출 키트를 사용 하 여 게놈 DNA 추출 ( 재료의 표참조).
- 4.0 mL 혈액 샘플을 솔루션 1의 10 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 2000 x g에서 샘플을 원심 제거 하 고 상쾌한을 신중 하 게 삭제. 솔루션 1의 3 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 다시 4 ° C에서 5 분 동안 2000 x g에서 샘플을 원심 하 고 상쾌한 삭제. 솔루션 2의 3 mL에 펠 릿을 resuspend.
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결과
Agarose 젤 전기 이동 법 두 환자와 exon TTR 유전자 (그림 1)의 4에 대 한 454 bp의 PCR 제품을 포함 한 예상된 크기에의 한 건강 한 개별 계시 밴드.
그림 1 . 젤 전기 이동 법 묘사 PCR 증폭 TTR 유전자. 일반: 건강 한 개인입니다. 분자 크기 표식으로 레인 m: 100 bp DNA 사다리. 레인 1: 246 bp (exon 1) 레인 2: 292 bp (exon 2) 레인 3: 299 bp (exon 3) 레인 4: 454 bp (exon 4).......
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토론
프로토콜 내에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 백혈구 세포의 충분 한 수를 위해, hemodiluted 견본 피할된11이어야 한다. 둘째, 적절 한 PCR 뇌관의 사용이 이다 신뢰할 수 있는 결과12를 기본. 디자인 뇌관4,13; 뇌관 폭발 웹 도구를 사용 하는 우리 4 개의 TTR exons의 각 측에 40의 기본적인 쌍의 최소 처리 되어야 합니다. 우리는 또한 뇌관의 특이성을 확인 하는 NCBI에 폭발을 실행 합니다.
일부 수정 DNA 추출 단계에서 만들어집니다. 첫째, 사용 하는 세 가지 솔루션의 양을 줄일 수 있습니다. 이 수정 또한 충분 한 양의 DNA 생성 하 고 솔루션을 저장 합니다. 둘째, 소 프로 파 놀 또는 100% 에탄올 DNA.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리가 실험에서 그녀의 도움에 대 한 미스 신 재미 우 감사 하고자 합니다. 이 연구는 장 공 의학 연구 프로그램 (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373)와 IRB 100-4470A3, 104-2462A3, 대만에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| EDTA 처리된 튜브 | BD | ||
| DNA 추출 키트 | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 분광 광도계 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| 섬세한 작업 와이퍼 | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR 유전자 인트로닉 프라이머 | 엑손1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' | |
| 엑손1 | R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' | ||
| 엑손2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' | ||
| 엑손2 | R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' | ||
| 엑손3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' | ||
| 엑손3 | R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' | ||
| 엑손4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTGGTCAGTCAT-3' | ||
| 엑손4 | R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR 시스템 9700 | |
| 전기영동 셀 | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA 사다리 | Protech | PT-M1-100 | |
| 염료 | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| 자동 시퀀서 | Applied Biosystems | 3730xl DNA 분석기 |
참고문헌
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264
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