초파리 melanogaster 회전 운동 정량화 시스템 (REQS)를 사용 하 여 운동 수준 측정

요약

회전 운동 정량화 시스템 (REQS) 초파리 melanogaster 동물에 의해 수행 활동의 금액을 동시에 측정 하는 동안 회전 운동을 유도할 수 있다. 여기, 선물이 회전 운동 치료는 REQS.를 사용 하 여 발생 하는 동물의 활동 수준을 측정 하는 방법을 자세히 설명 하 여 포인트 프로토콜

초록

초파리 melanogaster 운동 생물학에서 연구에 대 한 새로운 모델 생물 이다. 날짜 하려면, 두 개의 주요 운동 시스템, 전력 타워와는 Treadwheel 설명 되었습니다. 그러나, 운동 치료를 통해 유도 추가 동물 활동의 양을 측정 하는 방법 부족 되었습니다. 회전 운동 정량화 시스템 (REQS) 동물 발생 하는 회전 운동에 대 한 동물 활동의 측정을 제공이 필요를 채웁니다. 이 프로토콜은 REQS을 사용 하 여 회전 운동을 하는 동안 동물 활동을 평가 하는 방법을 자세히 설명 하 고 생성 될 수 있는 데이터의 종류를 보여 줍니다. 여기, 우리는 REQS를 사용 하 여 유도 된 운동 활동에 섹스 및 스트레인 특정 차이 측정 하는 방법을 보여 줍니다. REQS 운동 유도 활동에 나이, 다이어트, 또는 인구 크기와 같은 다른 다양 한 실험적인 매개 변수의 영향을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 다른 운동 훈련 프로토콜의 효능 비교에 사용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 그것 사이 긴장, 필요한 경우 그룹 사이 활동의 동일한 금액을 달성 하기 위해 연구원을 수 있도록 운동 치료를 표준화할 수 있는 기회를 제공 합니다. 따라서,는 REQS 운동 생물학 초파리 모델 시스템 작업에 대 한 주목할 만한 새로운 리소스 이며 기존 운동 시스템을 보완 한다.

서론

최근에, 연구원은 초파리 melanogaster 과일 파리를 사용 하 여 운동 생물학을 공부 하기 시작 했습니다. D. melanogaster 100 년^1,2유전자 모델 시스템 되었습니다. 그러나, 초파리 연구가 했다 공헌을 뿐 아니라 유전학 뿐만 아니라 생물학, 행동 생물학, 생리학³등 다른 분야의 다양 한. 2009 년 전력 타워 초파리에 대 한 첫 번째 운동 기계 설명된⁴했다. 전력 타워는 동물 들의 부정적인 geotaxis 응답 합니다. 방해, 초파리 그들의 케이스의 상단으로 이동 하는 경향이. 이 응답 잘 설립 하 고 등반 능력 및 체력 초파리에서 추정 하는 데 사용 되는 인기 있는 "반지" (급속 한 반복 부정적인 Geotaxis⁵) 분석 결과의 기초 이다. 전력 타워는 몇 인치에 의해 반복적으로 그들의 인클로저 내에서 동물의 집합을 리프트 모터 장치에 연결 된 지상에 다시 놓는 기계 팔 부정적인 geotaxis 응답 (Tinkerhess 외. 2012⁶ 유도를 사용 하 여 전원의 사용을 보여주는 동영상 제공). 장기간된 치료 전력 타워에 따라서 양을 증가 신체 활동 (실행 중 또는 비행)의 동물 치료 제어 동물 그리고 시간 리드 체력⁴링 분석 결과에서 향상 된 성능에 비해 수행. 따라서,이 작품 운동 생물학에 대 한 모델 초파리를 사용 하 여의 타당성을 설명 했다.

2016 년에 초파리 운동 연구에 사용할 수 있는 도구의 레 퍼 토리를 확장, 멘데스와 동료 두 번째 초파리 운동 기계, Treadwheel⁷설명. 전력 타워와 마찬가지로 Treadwheel 초파리의 부정적인 geotaxis 응답을 이용 한다. 그러나,이 응답 동물 인클로저, 지속적인된 회전 보다 해제 전원 타워에서 그들을 떨어뜨려 서 유도 된다. 이 유도 방법 gentler 이며 전력 타워에서 운동을 하는 동안 발생할 수 있는 모든 물리적 외상을 방지 하는 더 많은 지구력 지향된 운동 정권에 대 한 수 있습니다 (참조 Katzenberger, R. J. 그 외 여러분 2013⁸ 의 영향에 대 한 실제 반복 Drosophila 건강에 외상)입니다. 전력 타워⁴와 마찬가지로, 운동 치료는 Treadwheel에 동물의 다양 한 생리 적 반응, 체력, 트리 글리세라이드 수준, 그리고 몸 무게⁷에 변화를 포함 한 리드. 따라서, 두 가지 보완 방법 초파리 생물학 공부 하는 운동에 대 한 사용할 수 있습니다.

전력 타워와는 Treadwheel의 한계가 운동 치료에 의해 유도 된 활동의 양을 측정 하는 무 능력 이다. 비디오 녹화는 Treadwheel에서 가져온의 분석 시연 어떻게 운동 치료⁷반응에서 다양 한 초파리 긴장 사이 큰 차이가 있었다. 특히, 변종 공부 얼마나 동물 때 수행 하는 추가적인 활동 자극⁷에서 달랐다. 이 관찰 3 운동 시스템는 회전 운동 정량화 시스템 (REQS), 회전 유도 운동⁹동안 동물 활동 레벨을 측정 하기 위해 수 있도록 개발 하 라는 메시지가. REQS 상용 활동 단위는 Treadwheel 마찬가지로 회전 운동 자극을 회전 팔에 설치 된 모니터링을 활용 합니다. REQS와 초기 작업 확인 하는 다른 유전자 초파리 긴장-남녀-회전 자극에 대 한 다른 응답을 가질 수 있고 따라서 운동 유발의 금액은 다른 genotypes⁹ 중 동일 . 따라서,는 REQS는 지금 운동 분야에서 다양 한 새로운 연구도로 열고 초파리 생물학을, 치료에 의해 유도 된 운동의 양을 측정 하 있습니다.

여기 우리가 자세히는 REQS 회전 운동의 정량화에 대 한 사용 하는 방법을 설명 합니다. REQS 회전 운동을 유도 하 고 동시에 취급 되 고 동물의 활동 레벨을 측정 합니다. REQS 다양 한 운동 프로그램을 수용할 수 있다, 2 h 간단한에서 배열 연속 운동 정권 멘데스와 동료⁷및 자극에 의해 설명 된 대로 더 복잡 한 간격 훈련 방법에 여기 시연 통해 조정할 수 있습니다. 회전 속도 (분 당 약 1-13 회전) 사이. 활동 모니터 단위는 REQS을 생산 하는 데 사용에 따라이 메서드는 단일 파리의 분석 또는 동물의 큰 인구에. 이 다양성으로 인해는 REQS 기회 공부 하 고, 예를 들어, 다른 운동 정권, 규정식 내정간섭, 또는 인구 밀도의 영향의 배열 초파리 연구를 제공 합니다.

프로토콜

REQS 초파리 활동 모니터 단위 구성 됩니다 (소스 정보를 참조 하십시오 테이블의 자료) 모터 장치 (그림 1)에 의해 제어 되는 회전 팔에 장착. 활동 모니터 해 부 분석 결과 튜브의 중간 레이저 광선의 배열을 방해 주어진된 시간 범위에서 빈도 결정 합니다. 상세한 도면과 깊이 있는 특성에 대 한 우리의 이전 게시⁹를 참조 하십시오. 동안 우리의 시스템에서 LAM25H 단위를 사용 하는 REQS 뿐만 아니라 다른 초파리 활동 모니터 단위에 맞게 수정할 수 있습니다.

1. 테스트는 REQS의 설치

1. 부하 테스트 CO₂ 또는 처리, 빈 관으로 이동 하 고 튜브를 상한에 대 한 다른 선택된 방법으로 동물을 마비 유리 표본 튜브로 파리.
2. 활동 모니터 단위의 슬롯에 출장된 유리 표본 튜브를 삽입 합니다. 고무 오 링 (17-18 게이지)을 사용 하 여 튜브 확보 및 튜브를 보장 하기 위해 장치의 양쪽에 고무 밴드를 회전 하는 동안 이동 하지 않습니다.
   1. 하나의 링 견본 튜브에 슬립 하 고 튜브의 중간점 근처 링 위치. 앞에서 작업 모니터의 슬롯에 표본 튜브를 삽입 하 고 그것을 센터.
   2. 필요에 따라 o-링을 이동 하 고 표본 튜브를 중심으로 일단 o-링은 최대한 활동 모니터 단위에 가까운 미끄러져 확인 합니다. 다시는 링 가능한 활동 모니터 장치 가까이로 이동 하는 후면과에서 유리 튜브에 두 번째 오-링을 미 끄 러에 의해 장소에서 표본 튜브를 수정.
3. 기기 전면에 있는 전원 스위치를 내리고 여는 REQS의 회전을 시작 합니다. 원하는 속도 (4 rpm이 예에서 (분 당 회전))는 장치에 다이얼 회전 속도 조정 합니다.
   참고:이 예제에서 회전 속도 이전에 게시 연구⁷일치 하도록 선택 되었다. 새로운 연구를 시작할 때 다른 회전 속도에 다른 동물의 활동 수준, 발생, 특정 실험 설정 (유전자 형, 운동 시 합, 등등의 길이)에 대 한 회전 속도의 최적화가 필요할 수 있습니다.
   참고: 그들은 회전 하는 동안 REQS 단위의 하단을 따라 드래그 하지 마십시오 있도록 튜브는 제대로 위치를 보장 하기 위해 중요 하다.
4. DAMSystem308 소프트웨어를 열고 연결 빛 몇 회전에 대 한 녹색 남아 보장 하 여 초파리 활동 모니터 단위와 함께 제공 하는 데이터 수집 시스템에 대 한 연결을 테스트 합니다. 소프트웨어 시작 됩니다 녹화 데이터 텍스트 파일 "monitorX" (X 되 고 단위 번호 다중 모니터는 사용 하는 경우)에 즉시 시작 시. "기본 설정" 탭;에 조정 될 수 있다 주파수를 기록 우리는 일반적으로 5 분 간격으로 기록합니다.
5. 데이터 연결이 제대로 작동 하는지 확인 하는 DAMSystem308 소프트웨어에 의해 생성 된 텍스트 파일을 조사 합니다. 연결 문제 발생 단편, 시간 포인트 0 활동 ( 대표 결과 표 2참조)는 REQS에서 모든 위치에 대 한 기록 됩니다. 단편 발생, 회전, 하는 동안 느슨한 또는 꼬인이 연결 될 수 있다 회전 전화 잭, 이어지는 데이터 연결 조정 합니다. 우리는이 문제를 방지 하는 테이프와 연결을 안정 시키는 데 도움이 찾으십시오.

2입니다. 동물의 준비

참고: 모든 동물 제기 하 고 인큐베이터 (25 ° C, 습도 60-70%, 명암 주기 12 h) 당 밀/옥수수 가루 미디어¹⁰에 표준 조건 하에서 테스트 했다.

1. 2 주 전에 계획 된 실험; 실험 파리 수집 제어 동물 밀도와 튜브를 설정 우리가 일반적으로 설정 튜브 7 남성과 여성 10. 하나의 약 병에서 건강 한 재고와 4 일 기간 동안 약 15 처녀 남성 및 15 여성을 수집할 수 있습니다. 분석 결과;에 필요한 동물의 수에 따라 튜브 설정의 수를 조정 우리의 실험실에서 일반적인 분석 결과 10 처녀 남성 및 여성 유전자 형 (100 남성 및 여성 100) 당 10 세트를 포함합니다.
   참고: 비 처녀 파리 특정 실험적인 질문에 따라 사용할 수 있습니다. 비 처녀 동물과 장기 실험을 실시 하는 경우 크롤링 애벌레는 정확한 활동 모니터링 방해할 수 있습니다.
2. 부모 파리 1 주일 후에 튜브를 제거 합니다.
3. 튜브를 설정 후 10 일에 시작, 튜브에서 버진 파리를 수집 하 고 섹스를 구분 저장.
4. 실험 및 그들 필요,이 예제에서 3 일 나이 대 한 충분 한 동물을 수집 합니다.
   참고: 우리는 일반적으로 CO₂ 처리에 대 한 동물을 anesthetize. CO₂ 치료 후 시간의 연장된 기간에 대 한 동물의 활동 수준에 영향으로 알려져 있다 (예를 들어 바르 톨 로메 오 외. 2015¹¹참조). CO₂ 효과 계획된 다운스트림 분석 실험 또는 분석 방해를 하는 경우 얼음 anesthetization 같은 다른 마 취 방법을 사용 합니다.

3. 데이터 수집은 REQS와

1. CO₂ 또는 다른 마 취 방법 운동 정량화 연구에 사용 될 동물 anesthetize 필요에 따라 그룹으로 그들을 분할 하 고 활동 모니터;의 빈 유리 튜브에 동물의 그룹을 로드 이 예제에서는 같은 나이의 10 동물 유리 튜브, 각 동물의 종류 (성별/유전자 형)에 대 한 10 복제 당 로드 됩니다. 참고 각 관에는 동물의 종류 로드 되었는지 확인 합니다.
   참고: 더 이상 실험, 식품 표본 튜브에 포함할 수 있습니다. 이 경우에 음식 안전 하 고 회전 하는 동안 제거 될 하지 않습니다 필수적 이다.
2. REQS 단위로 유리관 분석 결과 로드 하 고 고무 O 링와 그들을 보호. 하나 이상의 섹스/유전자를 사용 하는 경우 무작위 블록 디자인 또는 랜덤은 REQS에서 동물의 위치를 사용 하 여 모든 잠재적인 위치 효과 제거 합니다. 랜덤 또는 스프레드시트에서 웹 기반 난수 생성기 (예: https://www.randomizer.org/)에서 예 각 유리병 임의의 숫자를 할당 하 고 다음 임의의 수에 따라 튜브를 주문 하 여 얻을 수 있습니다.
3. 일정 한 온도, 습도, 그리고 빛을 되도록 인큐베이터는 REQS 장소 조건. 데이터 및 전원 케이블이 제대로 연결 되어 있는지 확인 합니다.
4. 동물 마 취에서 회복 하 고 1 시간에 대 한 새로운 환경에 순응을 허용 합니다.
5. 원하는 속도로 REQS의 회전을 시작 하 여 실험을 시작 합니다.
   참고: 다른 옵션은 먼저 초기 계획 활동에서에서 데이터를 수집 회전 자극에 대 한 응답에서 활동 레벨을 기록 하 여 후 회전의 개시 전에 동물.
6. DAMsystem308 소프트웨어 (소프트웨어 초기화 데이터 수집 여)를 열어 데이터 수집을 시작 합니다. 데이터는 설정 된 간격에 (여기, 5 분); 텍스트 파일에 작성 됩니다. 필요한 경우, "기본 설정" 탭에서 간격 설정을 변경 (하십시오 단계 1.4 참조).
7. 데이터가 성공적으로 컴퓨터에 전송 하려면 하나 또는 두 시간 간격으로 통과 하 고 데이터 파일에 기록 되는 것을 확인 한 후 DAMsystem308 소프트웨어에 의해 생성 된 텍스트 파일을 열어 합니다. 닫고 다시 어떤 추가 시간 지점에서 데이터를 볼이 파일을 엽니다. 원하는 양의 시간;에 대 한 데이터를 수집 이 예제에 2 시간 합니다.
   참고: 열지 마십시오 인큐베이터 시험 기간 동안 동물 어떤 소요에 아주 과민 하 고 가능성이 증가 활동으로 반응할 것 이다.
8. 운동 분석 결과의 끝에, DAMsystem308 소프트웨어를 폐쇄 하 여 데이터 수집을 종료 후는 REQS. 해제 분석 결과 유리관에서 동물을 제거 하 고 튜브를 청소. 동물 이동할 수 있습니다 다시 음식 튜브로 다른 연령대에 대 한 조치는 필요를 반복 하는 경우.
   참고: 죽음 운동 정권 기간 동안 발생 하는 경우 그것은 기록 되어야 합니다, 죽은 파리의 존재 활동 카운트에 영향을 수 있습니다. 우리의 경험과 DGRP2 플라이 라인^12,13에서 2 h 어떤 죽음을 초래 하지 않았다 하지만 약한 긴장 다르게 응답할 수 있습니다 4 rpm을 운동.

4. 데이터 분석

1. 레이블이 "Monitor1" DAMSystem308 소프트웨어에 의해 생성 하는.txt 파일을 엽니다.
2. 데이터 수집 (놓친된 시간 포인트, 등; 하는 동안 발생 한 모든 문제에 대 한 데이터 파일 검사 표 1)입니다. 필요한 경우 시작 및 녹음의 끝 부분에서 데이터 요소를 제거 하 여 파일을 검열.
3. 수집 된 데이터 분석 (예를 들어, R), 선택의 통계 소프트웨어를 사용 하 여. 설명 통계를 생성 하 고 데이터는 일반적으로 배포 되는 경우 분산 분석 (ANOVA) 섹스와 유전자 형, 등의 효과 조사 하기 위해 실시. 데이터는 일반적으로 분산 되지 비패라메트릭 메서드를 Kruskal-월리스 테스트를 사용 하 여 그룹을 비교 하. 필요한 특정 분석 특정 과학적인 질문 및 실험 설계에 따라 달라 집니다.

결과

REQS와 개별 실행에서 출력 (예제 참조 추가 파일 1)에 대 한 기본적으로 "Monitor1.txt" 표시 됩니다 DAMSystem308 소프트웨어에 의해 생성 하는 데이터 테이블입니다. 같은 테이블에서 발췌는 표 1에 표시 됩니다. 각 열 행 실험 (맨 위)의 시작 부분에서 끝 (아래) 각 시간 간격을 측정 하는 활동을 포함 하는 동안 데이터는 개별 분석 결과 튜브를 포함 합니다. 에 있는 경우 케이블을 조정 해야 합니다 (예: 그에서 본된 표 2), 데이터의 단편은 처음 세 개의 데이터 요소를 모니터링 해야 합니다.

그림 2 는 4 가지 유전자 초파리 라인 (¹³

토론

대표 결과 제시는 REQS 초파리 운동 활동을 정확 하 게 측정 가능 하다. REQS 유연한 이며 운동 생물학 또는 운동 중재와 관련 된 연구 질문의 다양 한 연구자를 수 있습니다. 강조 하기 위해 프로토콜에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 테스트는 DAMSystem308에는 REQS에서 데이터 전송이 제대로 작동 하는지 확인을 REQS의 설정이 필수적 이다. 아니라면 제대로 설정, 데이터 케이블 수 될 엃 혀 있었습니다, 회전 하는 동안 그리고 때때로 REQS와 DAMSystem308는 연결 중단 마모로 인해 회전 연결에서 (비록는 REQS의 거의 매일 사용, 우리는 했다 대체 커넥터 2 년에 한 번). 그것은 교체 부품을 손에서 계속 하입니다. 둘째, 환경 매개 변수의 일관성은 실험의 성공에 필수적입니다. 초파리는 소음 또는 진동에 아주 과민 하 고 따라서, 실험 데이터 수집 하는 동안 방해 하지 중요 하다. 따라서, 이상적으로, 실험 실험 실행 하는 동안 액세스 하지 전용된 인큐베이터에서 실행 됩니다. 이러한 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
초파리 활동 모니터	Trikinetics	LAM25H	REQS 구성 요소
전화 코드 디탱글러	Uvital	uv20170719	REQS 구성 요소
바이알 마개 (플루그)	Genesee Scientific	49-102	초파리 배양 용품
바이알	Genesee Scientific	32-120	초파리 배양 용품
파리 배양 그물 캐	롤라이나 생물학 공급	173090	초파리 배양 용품
옥수수 가루	펩시코	43375	초파리 매체
당밀	골든 배럴	BLA-GAL	초파리 매체
한천	Apex Bioresearch	66-103	초파리 배지
비활성 건조 효모	Genesee Scientific	62-106	초파리 매체
Tegosept	Apex Bioresearch	20-258	초파리 매체
프로피온산	Genesee Scientific	20-271	초파리 매체