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방법 논문

치과 임 플 란 트에 대 한 다른 자료에 구두 Biofilm 형성

11.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57756

⸱

2018년 6월 24일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

이 논문에서

요약

여기, 선물이 세균성 세포 생존 및 형태학 상 특성의 분석을 포함 하 여 치과 보 철물 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 구두 biofilm 형성 평가 하는 프로토콜. 현장에서 모델 관련 강력한 현미경 검사 법 기술 된 구두 biofilm 분석에 사용 됩니다.

초록

치과 임 플 란 트 및 보 철 그들의 구성 요소 세균성 식민 및 biofilm 형성 하는 경향이 있다. 제공 하는 낮은 미생물 접착 재료의 사용 정도와 요정 이식 질병의 진행을 줄일 수 있습니다. 보기는 구강 환경 복잡성과 구강 biofilm이, 치아와 치과 재료의 표면에의 한 biofilm 분석 수 있는 현미경 기술 필요. 이 문서에서는 일련의 프로토콜 비교 형태학 및 세포 수준에서 구두 biofilms 분석에 관련 된 방법으로 구두 biofilm 형성 티타늄 및 보 철 abutments에 대 한 세라믹 재료에 대 한 구현. 이 연구에 설명 된 대로 치과 족 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 구두 biofilm 형성 평가를 제자리에 모델 방법론 타당성을 시연 함으로써 48 h biofilm의 만족 스러운 보존을 제공 합니다. Multiphoton 현미경 시험 자료에 형성 된 biofilm의 지역 담당자의 분석을 수 있습니다. 또한, fluorophores의 사용 및 multiphoton 현미경을 사용 하 여 이미지의 처리에는 세균 생존 능력의 분석을 미생물의 아주 이질적인 인구에 있습니다. 전자 현미경 검사 법 생물학 견본의 준비 biofilm, 좋은 해상도, 이미지 및 아무 유물의 구조 보존을 촉진합니다.

서론

박테리아 biofilms 복잡 한, 기능적 및 구조적으로 미생물 지역 사회 조직, 세포 외, 생물학적으로 활성 폴리머 매트릭스1,2합성 미생물 종의 다양성에 의해 특징. 생물 비 생물 적인 표면에 세균성 접착 침 glycoproteins1,,34주로 구성 된 인수 박막의 형성에 의해 앞에 있습니다. 미생물 및는 박막 사이의 약한 물리 화학 상호 작용 처음 설립 하 고 세균성 adhesins 인수 박막의 당단백질 수용 체 사이 강한 상호 작용에 의해 따라. 미생물 다양성 형성 multispecies 커뮤니티1,,34, , 이미 연결 된 박테리아의 수용 체에 보조 식민지 개척자의 coaggregation를 통해 점차 증가 5.

구두 microbiota 및 호스트와의 공생 관계의 항상성 구강 건강 유지에 중요 하다. 구두 biofilms 안에 dysbiosis 카 리에 스 그리고 치 주 질환2,5의 개발에 대 한 위험을 증가할 수 있습니다. 임상 연구는 치아 나 치아에 biofilm의 축적과 치은 염 또는 페리-임 플 란 트 mucositis6,7의 개발 원인-효과 관계를 보여 줍니다. 염증 과정의 진행 임 플 란 트8의 필연적인 손실과 peri implantitis 이끌어 낸다.

치과 임 플 란 트 및 보 철 그들의 구성 요소는 세균성 식민 및 biofilm 형성9경향이 있습니다. 화학 성분 및 표면 지형 낮은 미생물 접착을 제공 하는 자료의 사용 정도와 요정 이식 질병9,10의 진행을 줄일 수 있습니다. 티타늄 임 플 란 트;에 대 한 보 철 abutments의 제조에 대 한 자료를 가장 많이 사용 되는 그러나, 세라믹 재료 최근에 도입 되었다 그리고 그들의 미적 속성 및 생체 적합성11,12티타늄 대신 인기를 얻고 있다. 또한 중요 한 것은, 세라믹 재료 미생물, 주로 그들의 표면 거칠기, 습윤, 및 표면 자유 에너지10,13때문에 살 일 걸 요 감소 잠재력 관련 되어 있다.

생체 외에서 연구 보 철 인접 표면9,14,15,,1617미생물 접착의 이해에 중요 한 발전에 기여 했다. 그러나, 구강, 전단 세력의 존재에 의해 뿐만 아니라 다양 한 온도 산도 및 양분 가용성 특징의 동적 환경이 이다 생체 외에서 실험 프로토콜18, 재현할 수 19. 이 문제를 해결 하려면 대신 advantageously 비보 전 분석10,20, 의 3 차원 구조를 유지 하는 biofilm 형성의 현장에 모델의 사용은 21 , 22 , 23 , 24.

구두 기판에 형성 된 biofilm의 복잡 한 구조의 분석 현미경 검사 법 기술 광학 밀도 문제25표시할 수 있는 사용을 해야 합니다. Multiphoton 레이저 스캔 현미경 biofilm 구조 분석26현대 옵션입니다. 그것은 적외선 파장, 펄스 femtoseconds27에 가까운 조명 소스와 비선형 광학의 사용에 의해 특징입니다. 이 메서드는 autofluorescence 자료 또는 자료 fluorophores, 비선형 광학 신호 제 2 고조파 발생으로 알려진 현상에서 파생 된에 의해 생성 된 이미지 외에 의해 표시의 이미지 수집에 대 한 표시 됩니다. Multiphoton 현미경의 장점 중27여기 빛 강도 의해 발생 하는 최소 세포 손상으로 얻은 좋은 이미지 깊이입니다.

Multiphoton 현미경에 의해 abiotic 표면에 biofilm의 생존 능력 분석, 형광 핵 산의 사용 다른 스펙트럼 특성을 가진 염료 그리고 세균성 세포에 침투 수 용량 필요28. 라이브 하 고 죽은 박테리아28,,2930사이의 시각적 차별화 Fluorophores SYTO9 (그린 형광) 및 propidium 요오드 화물 (레드 형광)를 사용할 수 있습니다. Propidium 요오드 화물 SYTO9는 손상과 손상 된 막으로 세균 세포를 입력 하는 동안 손상 된 멤브레인과만 박테리아 침투. 두 염료 셀 안에 있는 경우, propidium 요오드 화물 핵 산에 대 한 큰 선호도 있으며 배 수량 SYTO9, 그것에 게 빨간28,30을 표시 합니다.

보기는 구강 환경 복잡성과 구강 biofilm이, 치아와 치과 재료의 표면 biofilm 분석 수 있는 현미경 기술 필요. 이 문서에서는 일련의 프로토콜 비교 형태학 및 세포 수준에서 구두 biofilms 분석에 관련 된 방법으로 구두 biofilm 형성 티타늄 및 보 철 abutments에 대 한 세라믹 재료에 대 한 구현.

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프로토콜

이 연구는 리 베이 라 오프 레 토의 치과 학교의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 자원 봉사 참가자 서명 동의서 (2011.1.371.583 프로세스).

1. Biofilm 형성에서 제자리에

  1. 참가자의 선택
    1. 다음 포함 기준에 따라 환자 선택: 완전 한 치열과 구강 질환의 임상 표시 없이 건강 한 개인.
    2. 다음 제외 기준에 따라 환자 제외: 임신, 수 유, 치과 카 리에 스, 치 주 질환 또는 지난 3 개월 동안, 흡연 자, 또는 치 주 상태에 영향을 미칠 수 있는 조직의 질환에 항생제 치료.
  2. Intraoral 장치 준비
    1. Alginate 인상을 통해 상 악 아치를 기록 합니다.
    2. 유형 IV 돌 돌 가루 100 g을 물 19 mL을 추가 하 여 준비 합니다. 돌 상 악 아치의 모델을 만들 alginate 몰드에 붓으십시오.
    3. 디자인과 테스트 표본 (티타늄과 세라믹 디스크)를 지원 하기 위해 아크릴 intraoral 장치 조작.
      1. NiCr 와이어 (0.7 m m에 직경) 교정 플라이어 # 139를 사용 하 여에서 못 벗어난 걸쇠를 조작 하 고 모델에 그들을 배치 합니다. 그들은 루프를 형성 하 위 구치 사이 클램프 위치, 각 와이어의 한쪽 끝을 구 부.
        1. 치 간 시의 지역에서 루프를 적응. Occlusal에서 연락처의 포인트는 폐색과 방해를 하지 않도록 부드러운 곡률을 삽입 합니다. 아크릴에 보존에 대 한 클램프의 끝에 접어 90 °를 확인 합니다.
        2. 위 두 번째 어 금 니에 클램프를 맞게 적응 자 궁 경부 3에서 와이어의 곡률 (vestibular) 90 ° 아크릴에 보존에 대 한 클램프의 끝에 배를 (원심) 치아 윤곽.
          참고: intraoral 장치에 적절 한 보존/안정성 제공, 보유 clasps 위 구치 원심 부분의 치과 아치의 양쪽에 두 번째 어 금 니 사이 배치 했다.
      2. 제조업체의 지침에 따라 자체 경화 아크릴 수 지를 조작 하 고 3 m m 두꺼운 시트를 만들기 위해 플라스틱 단계 2 유리 접시 (interposed 두께 3mm 스페이서) 사이 아크릴 수 지를 누릅니다.
      3. 소자의 디자인에 따라 모델의 경구개 지역에 아크릴 시트를 카 버, 중 합 전에 잉여 아크릴 수 지를 떨어져 트림.
      4. 공고히 하는 매트릭스에 녹은 왁 스를 놓고 왁 스에 대 한 대기 금속 매트릭스 [10 밀리미터 직경, 2mm 두께 (78.5 m m2의 면적)]를 사용 하 여 왁 스 디스크 조작. 수동으로 아크릴 수 지, 그들의 2는 구치와 두 번째 어 금 니 옆 다른 2 사이 4 왁 스 디스크를 포함 합니다.
      5. 20 분에 대 한 압축 공기의 미만 20 psi 압력 냄비에 유해 아크릴 수 지를 보자.
      6. 전기 치과 실험실 핸드 피스와 커터 intraoral 장치를 완료 하 고 연마 고무 폴란드어.
      7. 위에서 설명한 장비를 사용 하 여 입에 적당 한 적합을 위한 장치를 조정 합니다.
  3. 티타늄과 지 르 코니 아 표본의 준비
    참고: 표본 (n = 14) 10 mm 직경에서 및 두께에서 2 m m 이며 78.5 m m2의 면적을가지고.
    1. 감소 하는 abrasiveness의 수냉식된 sandpapers 표본 표면 폴란드어 (600, 1200, 2000 모래), 약 20 분.
      참고:는 표본의 연마 0.2 µ m에서 표면 거칠기 표준화를 수행 했다.
    2. 청소 하 고 소독 표본 및 액체 세제와 수돗물, intraoral 장치 다음 이소프로필 알코올 초음파 목욕을 사용 하는 15 분 흡수 성 종이 타 올 그들을 건조.
    3. 비-독성 핫 멜 트 접착제 (그림 1)의 약 0.1 mL와는 표본 intraoral 구강 장치에 수정.
    4. 구강에서 견본을 포함 하는 장치를 설치 합니다.
      참고: 포함 하는 표본 intraoral 장치 48 h에 대 한 착용 한다. 장치 제거 하 고 환자는 먹고 구강 청소를 수행 하는 동안 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 저장 되었습니다.

2입니다. 세균 생존 능력의 평가

참고: 샘플 크기 n = 10.

  1. SYTO9의 3 µ L을 추가 하 여 염색 솔루션 준비 (녹색 형광 핵 산 염료)와 3 µ L propidium 요오드 화물 (빨간색 형광 핵 산 염색) 살 균의 1 mL의 증류수.
    참고: 빛 으로부터 보호 하는 솔루션을 준비 합니다.
  2. 24-잘 접시에는 견본을 전송 하 고 모든 비 부착 한 세포를 제거 하는 PBS와 함께 그들을 씻어.
  3. Biofilm 포함 된 견본을 충당 하기 위해 형광 염료 솔루션의 적절 한 볼륨 (1 mL)을 추가 합니다. Disorganize는 biofilm를 하지 않도록 매우 신중 하 게 염료를 추가 합니다.
  4. 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 20-30 분에 대 한 견본 품 어.
  5. 부드럽게 biofilm 샘플 어떤 과잉 염료를 제거 하는 멸 균 증류수로 씻는 다.
  6. 유리 하단 접시에는 견본을 놓고 multiphoton 레이저 현미경 biofilm 분석에 대 한 검색을 수행 합니다.
    참고: 세균성 세포 생존 능력 분석 multiphoton 현미경 시스템을 사용 하 여 실행 되었다. Propidium 요오드 화물의 형광 546/680의 여기/방출 파장 필터를 사용 하 여 검색 및 477/600 nm SYTO9에 대 한. 가져온 이미지의 크기는 5.16188 x 5.16188 m m, 각 표본 (78.5 m m2)의 전체 면적의 전체 면적의 33.94 %26.64 m m2 에 해당 했다. 이미지는 1024 x 1024 픽셀의 해상도 샘플의 가장 중앙 부분에서 만들어졌다. 빨강 채널 및 녹색 이미지는 별도로 피지 소프트웨어31를 사용 하 여 분석 되었다. 선택 도구를 사용 하 여 각 셀을 선택한 및 형광의 강도 빼서 이미지 배경 픽셀의 통합된 밀도 통해 측정 했다.

3. 에너지 흩어지는 분광학 (EDS)에 의해 표본 화학 성분의 분석

참고: 샘플 크기 n = 3.

  1. 각 biofilm 무료 테스트 소재의 3 표본 선택 하 고 전자 빔 전압 10 kV32의 분산 에너지 분석기를 결합 하는 스캐닝 전자 현미경을 사용 하 여 각 시료의 2 가지 영역에서 화학 성분 평가.

4. 전자 현미경 검사 법을 검사 하 여 세균성 Biofilm의 형태소 분석

참고: 샘플 크기 n = 1.

  1. 2.5%도 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼, pH 7.0-7.3, 24 h에에서 희석에 표본 immersing 하 여는 biofilm를 해결.
  2. PBS 버퍼에 샘플을 세척 (pH 7.6 =).
  3. 1 시간에 1% 오스뮴 tetroxide와 biofilm 접미사
  4. PBS 버퍼에 샘플을 세척 (pH 7.6 =).
  5. 탈수 biofilm 샘플 신중 하 게, 에탄올 솔루션 (50%, 70%, 90%, 95%, 및 100%)의 농도 증가 그들을 유지.
    참고: 100% 농도에서 에탄올의 3 교류를 수행 합니다. 총 탈수 단계 약 2 시간 걸립니다.
  6. 임계점 건조 기에 견본을 전송 하 고 이산화탄소 (CO2)와 함께 여러 대체는 표본 건조 될 때까지.
  7. 장치에서 말린된 견본을 제거 하 고 스캐닝 전자 현미경 소유자에 그들을 마운트.
  8. 스퍼터-코트 120에 대 한 시료의 표면에 금 20 nm 층 s.
  9. 스캐닝 전자 현미경 실에서 골드 코팅 된 디스크를 삽입 합니다. 각 표본, 가변 압력 하에서 20-30 kV와 650 X 배율12의 5 가지 다른 영역에서 이미지를 가져옵니다.

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결과

후 48 h 제자리에 성장의 biofilm의 식민 밀도 multiphoton 현미경 (시료의 총 스캔된 영역에 관하여 티타늄 및 지 르 코니 아 디스크에 식민지 지역의 비율에 의해이 연구에서 대표 되었다 26.64 mm2)입니다. 그림 2 3 시험된 재료의 표면에 세균성 식민 밀도를 나타냅니다. 캐스팅의 표면에 biofilm의 높은 밀도 관찰 되었다 가공된 티타늄 디스크 (0.0292 µ m2 와 0.0213 µ m2를 각각) 보다 지 르 코니 아 디스크 (0.0099 µ m2; p < 0.05; Kruskal-Wallis 테스트, 뒤에 던의 테스트).

그림 ...

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토론

이 연구에서 설명 하는 프로토콜 세균성 세포 생존 능력 및 형태학 상 특성의 분석을 포함 하 여 보 철 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 biofilm 형성을 평가 하기 위해 개발 되었다. 이 작업을 수행 하기 위해 biofilm 형성의 현장에 모델 intraoral 장치 시험 자료의 샘플 및 48 h에 대 한 동적 구강 환경에 노출 그들을 유지 하는 능력의 구성 설계 되었습니다. 장치는 편안 하 고 쉽게 삽입, 제거 및 청소 자원 봉사에 의해 고려 되었다. 그러나, 그것은 음성학과 미학에 거의 영향을 미치지는 간단 하 고 낮은-비용, 조작 하 고 표본 biofilm 구조의 중단 없이 쉽게 복구를 허용 보여주었다. 또한, 메서드는 세균 세포와 세포 외 매트릭스의 무결성의 보존 허용. 표본와 혀의 접촉 및 실험 기간 동안 디스크의 실수로 손실 제안 된 모델의 제한이 있습니다. 방법의 제한 최소화, intraoral 장치에 있는 디스크의 위치는 무작위로 배포; 또한, 디스크 비 독성 뜨거운...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자 감사 호세 아우 구 스토 Maulin 현미경 다중 사용자 실험실 (의 리 베이 라 오프 레 토 의학의 학교)에서 EDS와 sem의 그의 관대 한 지원에 대 한 분석 및 비디오 판에서 그의 관대 한 기술 지원에 대 한 브라 더 텍사스 마차.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Hydrogum 5Zhermack 치과C302070
Durone IVDentsply17130500002
NiCr 와이어 Morelli55.01.070
JET 자동 중합 아크릴Clá ssico
치과 왁스 클&아큐트; ssico
압력 냄비 Essencedental
Sandpapers 600 그릿NORTONT216
사포 1200 그릿NORTON T401
사포 2000 그릿NORTONT402
금속 조직 연마기Arotec
이소 프로필 알코올SIGMA-ALDRICHW292907
핫멜트 접착제TECSILPAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD 바이오필름 생존 키트InvitrogenL10316
피펫 팁, 10 &마이크로; L카스비K8-10   
파이펫 팁, 1,000 µ LKASVIK8-1000B   
24웰 플레이트 KASVIK12-024
유리 바닥 접시Thermo Scientific150680
AxioObserver 반전 현미경 ZEISS
Chameleon vision ii 레이저Coherent
Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DICZEISS440452-9903-000
SDD 센서 - X-Max 20mm²Oxford Instruments
글루타알데히드 용액SIGMA-ALDRICHG5882
소듐 카코딜레이트 버퍼 시그마-알드리치97068 
오스뮴 테트록사이드SIGMA-ALDRICH201030
Na2HPO4>SIGMA-ALDRICHS9638인산염 완충 식염수 제조에 사용
KH2PO4SIGMA-ALDRICHP9791 
NaClMERK1.06404
Kcl시그마-알드리치P9333 
분석용 에탄올 절대 EMSUREMERK1.00983
CPD 030 임계점 건조기BAL-TEC
JSM-6610 시리즈 주사 전자 현미경JEOL
SCD 050 스퍼터 코터BAL-TEC

참고문헌

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