이 문서에서는, 종의 단 세포 변화 조류 자연 필드 사이트에서 수집 된 클론 문화의 설립을 설명 합니다.
이 논문에서
요약
초록
다양 한 주제, 생리학, 유전학, 분류학, 미생물학 등의 연구에 사용 하기 위해 미세 클론 문화 확립에 필수적 이다. 따라서, 매우 클론 문화를 구축 하는 기술을 개발 하는 것이 중요 하다. 이 문서에서는, conjugating 조류의 클론 문화의 설립을 설명합니다. 물 샘플은 현장에서 수집 됩니다. 그 후, 세포를 유리 모 세관 피 펫, 미디어에 배치 하 고 클론 문화 생성을 위해 적당 한 조건 하에서 재배를 사용 하 여 격리 됩니다.
서론
동산 (의 주문 Zygnematales) 조류, 일컬어 conjugatophytes, 차지 토지 식물1,2의 즉시 조상의 가장 가까운 살아있는 친척으로 주요 계통 발생 위치. 설립된 클론 문화 조류의 분류학, 생리, 그리고 유전자 연구의 광범위 한 지난 몇 년간 끌고있다. 자연적인 분야에서 미생물의 절연 기술을 오랜 전통3,4있다. 최근 몇 년 동안, cytometry 사용 하는 기술도 있다 자동화 된 격리 설립5. 클론 문화의 설립에 대 한 단일 셀을 가져오는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법이입니다 유리 모 세관 피펫은6을 사용 하 여 단일 셀 격리. 이 전통적인 방법 기술과 정확한 실험 프로토콜에 필요합니다.
이 문서에서 설명 해 조류의 샘플링 필드 샘플 및 Closterium 종 같은 단 세포의 변화 조류의 클론 문화의 설립에서 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 합니다. 식물 세포를 포함 하는 물 샘플 필드 사이트 (예를 들면, 호수, 연못, 또는 논)에서 수집 됩니다. 세포는 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 물 샘플에서 격리 하 고 씻어. 셀 16 h 빛: 8에서 24 ° C에서 질소 보충 매체 (CA 중간)를 포함 하는 테스트 튜브에 교양-h 어두운 정권. 이 메서드는 또한 클론 문화 생성 하 다른 미세 분리에 적합.
프로토콜
1. 해 조류를 포함 하는 물 샘플의 수집
참고: 단 세포 conjugatophytes 호수, 늪, 논 등 정체 민물 지역에서 성장 한다. 조류-포함 된 물 샘플은 문화 긴장을 생산 하기 위해 이러한 환경 중 하나에서 수집 됩니다. 프로세스를 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 플랑크톤 넷, 일회용 피 펫, 그리고 병 또는 50 mL 튜브 물 샘플을 수집.
- 플랑크톤 호수 환경에서 인터넷을 사용 하 여 물에서 조류를 수집. 사용 목적에 따라 적절 한 net.
참고: 그물의 상부는 물 침투성. 그물에 의해 조류 그물 플랑크톤의 하단 컨테이너에 집중 된다. 굵고 메쉬 작은 조류를를 통해 전달할 수 있습니다. 좋은 메쉬 쉽게 막힌 가져옵니다. - 50 mL 튜브 또는 100 mL 플라스틱 병에 물 (약 50ml)을 전송 합니다. 실험실에 집중된 물 샘플을가지고.
- 단 세포 conjugatophytes는 또한 늪 이나 논에서 성장 한다. 이 얕은 물 지역에서 조류를 포함 하는 물 샘플 직접 스포이드와 함께 샘플링 될 수 있습니다. 그런 다음, 전송 (30-50 mL) 물 50 mL 튜브 또는 50 mL 플라스틱 병.
참고: 물은 신중 하 게 샘플링 토양 표면 위의 샘플 어떤 토양을 포함 하지 않습니다.
2입니다. 조류의 확인
참고: 다음 항목은 필요 시는 루 페 또는 휴대용 현미경 및 60 m m 관찰에 대 한 접시.
- 일회용 피 펫에는 샘플에 조류의 존재를 확인, 샘플을 직접 관찰 하는 루 페를 사용 합니다.
참고: 약의 더 큰 셀 400-1000 µ m 길이 (예를 들어, Closterium ehrenbergii)에 쉽게 수 있습니다이 방법을 사용 하 여 관찰. - 휴대용 현미경 조류를 확인 하려면 플라스틱 실험실 접시에 물 샘플을 붓는 다.
- 윗부분의 안쪽 부분에 샘플 (약 3 mL)을 넣어 (뚜껑) 60 mm 페 트리 접시의 위에 뚜껑의 안쪽 부분을 직면 하 고 그것의 바닥 부분과 아래쪽 절반 장소.
참고:이 메서드는 이동에서 샘플을 유지 하 고 관찰을 쉽게.
- 윗부분의 안쪽 부분에 샘플 (약 3 mL)을 넣어 (뚜껑) 60 mm 페 트리 접시의 위에 뚜껑의 안쪽 부분을 직면 하 고 그것의 바닥 부분과 아래쪽 절반 장소.
3. 격리 한 유리 모 세관 피 펫 파스퇴르 피 펫에서의 준비
참고: 프로세스를 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 살 균 파스퇴르 펫, 파스퇴르 펫, 장갑, 고무 전구, 정신 램프, 유리, 쓰레기통, 집게, 라이터, 정신 램프에 대 한 메탄올에 대 한 랙 및 클린 룸 또는 층 류 흐름 후드 (필요한 경우)입니다.
- 알콜 버너 점화.
- 격리에 대 한 정밀한 유리 모 세관 피펫은 생산, 불꽃은 경 경 하지 있는지 확인 합니다. 불꽃을 날카롭게 하 고 파스퇴르 피 펫의 끝을 녹여.
- 지원 되는 고무 전구 측면에 손으로 및 팁 사이드에 집게를 사용 하 여 불꽃에 파스퇴르 피 펫 멸 균 유리 열.
- 불꽃에서 파스퇴르 피 펫을가지고 고 그것을 스트레칭.
- 유리 용 해, 신속 하 게 불꽃에서 파스퇴르 피 펫을 제거 하 고 키를 누릅니다.
참고:이 실험에서 파스퇴르 피펫으로 확장 되었다에 의해 15-20 cm. 확인 확실을 피펫으로 불꽃을 당기는 동안.
- 유리 용 해, 신속 하 게 불꽃에서 파스퇴르 피 펫을 제거 하 고 키를 누릅니다.
- 적절 한 길이를 유리 모 세관 피 펫의 끝을 휴식. 때문에 굴복 부분은 최고의 팁에 이상적입니다.
참고:이 연구에서 5-10 cm의 팁과 유리 모 세관 피펫은 준비 되었다.- 그것을 용융 후 모 세관을 삭제 하 고 불꽃 나오는 것을 확인 해야 합니다.
- 거품 유리 모 세관 피 펫에서 발표 여 팁의 크기를 나타냅니다. 격리 되어야 하는 셀에 대 한 적절 한 크기를 선택 합니다. 약 1 m m 거품의 셀 폭이 10-20 µ m의 Closterium 종의 격리에 대 한 적절 한입니다.
4. 단일 셀 격리 유리 모 세관 피 펫
참고: 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 거꾸로 가벼운 현미경, 시계 안경, 플라스틱 접시, 그리고 메 마른 스레드 시험관 CA 매체 (표 1)를 포함 하거나 CA 중간7조건.
- 몇 가지 시계 안경 (22 m m 직경에서 및 깊이 1 m m), 살 균 CA 매체의 각 포함 1 mL를 준비 합니다.
- 현장에서 수집 물 샘플에서 목표 셀을 격리 합니다.
- 플라스틱 그릇에 대상 셀을 포함 하는 물 샘플 (약 30-40 mL)를 따르십시오.
- 거꾸로 가벼운 현미경 플라스틱 접시에 샘플을 관찰 하는 동안 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 단일 셀을 선택 합니다.
- 모 세관 작용에 의해 세포의 포부를 촉진 하기 위하여 셀 근처 유리 모 세관 피 펫을가지고.
- 살 균 CA 매체 (그림 1a)의 1 mL를 포함 하는 시계 유리에 셀을 전송 합니다.
- 다시 새로운 유리 모 세관 피펫은 멸 균 CA 매체에서를 사용 하 여 셀을 선택 하 고 메 마른 캘리포니아 매체 (그림 1b)를 포함 하는 두 번째 시계 유리에 그것을 전송.
참고:이 프로세스는 단일 셀 자리 플레이트 (그림 1c)에 격리 될 때까지 반복 됩니다. - 새로운 유리 모 세관 피펫은를 사용 하 여 단일 셀을 선택 하 고 마지막으로 CA 매체 또는 조건된 CA 매체 (그림 1의 d)의 14 mL를 포함 하는 테스트 튜브에 전송. 16 h 빛: 8에서 23 ° C에서 샘플을 품 어-어두운 h 2 주 주기.
참고: 주변 환경으로 성장 하는 세포에서 분 비 되는 세포 증식에 대 한 알 수 없는 factor(s)4세포 분열 촉진 하기 위하여 조절된 매체에 포함 됩니다. 클론 문화를 설립 하는 경우 배양4에서 바른된 CA 매체를 준비 합니다. 문화 성공 하면 녹색을 돌 것 이다.
결과
50 mL의 물 샘플 (Inba1) 한 샘플링 지점 호수 바 numa에서에서 수집 (pH 8.1 24.7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E)에 사쿠라 시, 치 바, 일본, 6 월 25 일, 2016. 물 샘플은 4-8 ° c.에 저장 된 Closterium sp.의 표본 수집 후 다음날 식물 세포를 포함 하는 물 샘플에서 분리 했다. 동일한 형태학의 15 식물 세포 (Inba1-1,-2,-3,-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14, 및-15) 샘플에서 고립 되었고 다음 세척 방법 피 펫을 사용 하 여 세척. 15 고립 된 단일 셀 조건된 CA 매체의 15 mL를 포함 하는 독립적인 테스트 튜브에 교양 있었다. 2 주 후 부 화, 세포 증식 9 테스트 튜브에서 관찰 되었다 [Inba1-1,-3,-4,-5 (그림 2a),-6,-9,-10,-(그림 2b), 12와-13; 표 2]입니다. 9 클론 문화 Inba1 샘플 분리 (그림 3)에서 설립 되었다.
그림 1 : 단일 셀 격리의 흐름. 첫 번째 시계 유리에서 (은)는 살 균을 원래 물 샘플에서 단일 대상 조류 셀 전송 매체. (b, c) 씻어 다음 시계 유리 셀을 다시 전송 합니다. 없는 다른 셀/오염 매체; 대상 보다는 때까지이 절차를 반복 해야 합니다. 3 개의 시계 유리는 예를 들어 여기에 다이어그램에 표시 됩니다. (d) 마지막으로, 성장에 대 한 적절 한 매체의 테스트 튜브를 씻어 셀을 전송. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 식물 세포의 사진 Closterium sp. (한) Inba1-5와 (b) Inba1-12 여기에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Inba1 샘플에서 클론 문화의 설립. 2 주 동안 배양 시험관 바닥에서 촬영 했다. 별표는 셀 확산을 나타냅니다. 눈금 막대 = 2 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 미디어의 이름 | 참조 | 코멘트 | |
| CA | Ichimura와 와타나베12 | 캘리포니아 (3)2·4H2O | 2 밀리 그램 |
| 알 것3 | 10 mg | ||
| NH43 | 5 mg | ||
| Β-나2glycerophosphate·5H2O | 3 밀리 그램 | ||
| MgSO4·7H2O | 2 밀리 그램 | ||
| 비타민 B12 | 0.01 μ g | ||
| 비타민 b 복합체 | 0.01 μ g | ||
| 티 아민 HCl | 1 μ g | ||
| PIV 금속 | 0.1 mL | ||
| Fe (EDTA;로 1:1 어 금 니) | 0.1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| 100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다 | |||
| pH 7.2 NaOH로 조정 | |||
| P 4 금속 | Provasoli 및 Pintner13 | 나2EDTA·2H2O | 100 mg |
| FeCl3·6H2O | 19.6 mg | ||
| MnCl2· 4 H2O | 3.6 mg | ||
| ZnCl2* | 1.04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0.4 밀리 그램 | ||
| 나2무4·2H2O | 0.25 mg | ||
| 100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다 | |||
| Fe (EDTA;로 1:1 어 금 니) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(이렇게4)2·6H2O, | 70.2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 밀리 그램 | ||
| 100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다 | |||
| 바른된 CA 매체 | 아베 외7 | 14-20 일에 대 한 신선한 CA 매체에 세포를 품 어. 교양된 매체 여과 질적 필터 종이 사용 하 여 수집 하 고 압력가 마로 소독 (15 분 동안 121 ° C)에 의해 필터링 된 매체를 소독. | |
| *에 NIES 1.04 mg ZnCl2 2.2 mg ZnSO4·7H2o.에 의해 대체 됩니다. | |||
표 1:이 연구에 사용 된 미디어의 공식.
| 물 샘플 | 셀의 이름 | 문화 후 상태 | 스트레인 이름 |
| Inba1 | -1 | 세포 증식 | Inba1-1 |
| -2 | 변경 되지 | ||
| -3 | 세포 증식 | inba1-3 | |
| -4 | 세포 증식 | inba1-4 | |
| -5 | 세포 증식 | inba1-5 | |
| -6 | 세포 증식 | inba1-6 | |
| -7 | 변경 되지 | ||
| -8 | 변경 되지 | ||
| -9 | 세포 증식 | inba1-9 | |
| -10 | 세포 증식 | inba1-10 | |
| -11 | 변경 되지 | ||
| -12 | 세포 증식 | inba1-12 | |
| -13 | 세포 증식 | inba1-13 | |
| -14 | 변경 되지 | ||
| -15 | 변경 되지 |
표 2:에서 격리 시험 요약입니다.
토론
현재 메서드를 사용 하 여 Closterium sp.의 9 클론 문화 긴장 15 셀 60%의 성공률을 나타내는 물 샘플 (Inba1)에서 고립에서 설립 되었다. 종 식별 밖으로 미래에 형태학 관찰 분자 계통 발생 분석8같은 DNA 분석에 의해 실행 될 것 이다.
현재의 방법에서 물 샘플의 신선도 성공률에 중요 하다. 필드 컬렉션 후 즉시 물 샘플에서 세포를 분리 하는 것이 낫다. Closterium 종 (예를 들어, C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale 복잡 한)의 세포는 4-8 ° C에서 그것을 저장 하 여 약 7 d 물 샘플에서 유지 될 수, 세포의 분리는 바람직한 컬렉션 또는 다음 날의 하루. 그것은 또한 세척 반복의 수를 증가 하는 그래서 대상 셀 이외의 어떤 오염 물질을 제거 하는 것이 중요 (즉, > 3 x) 미생물 토양과 셀에 의해 문화의 오염 되지 않을 수 있습니다.
이 기술은 한계 (CA 또는 CA 매체 조절된)이이 프로토콜에 사용 된 문화 미디어는 항상 모든 conjugating 조류에 대 한 적절 한입니다. 경우에 따라 그것은 다른 매체 뿐 아니라 다른 빛과 온도 조건을 사용 하 여 필요할 수 있습니다. 또한, 그것은 하나의 단일 셀에서 문화 성장 여부를 증명 하기 어려운, 그것은 테스트 튜브에 세포를 전송할 때 정확 하 게 1 셀을 선택 하는 데 필요한. 따라서, 전송 할 수 새로운 유리 모 세관 피 펫을 각 시간.
이 피 펫 세척 방법 클론 문화 수립 클래식/표준 방법 이며, 연구에 대 한 원하는 셀을 사용 하는 가장 신뢰할 수 있는 방법입니다. 많은 연구8,9,,1011 에 사용 되는 조류를 동산의 클론 문화는 현재 메서드를 사용 하 여 설치 되었다. 클론 문화 없이 변화 조류를 분석 하는 것이 어렵습니다. 또한, 최근 몇 년 동안, 드 노 보 전체 게놈 시퀀스를 (예를 들어, 미니 언 nanopore 시퀀서를 사용 하 여), 쉽게 되었고 클론 문화 구축 더 드 노 보 시퀀싱을 촉진 한다. 즉,이 메서드는 첫 번째 단계는 미래에 더 그들의 생물 다양성을 이해 하는 것이 조류의 연구.
안정적인 문화 긴장을 설정 하기 위해 그것은 정확 하 게는 프로토콜 내에서 특정 중요 한 단계를 수행 하는 데 필요한입니다. 가장 중요 한 단계는 단일 셀만의 통과 허용 하는 최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫의 준비 합니다. 유리 모 세관 피 펫의 조리개의 셀의 작은 축 길이 보다 약간 더 있어야 합니다. 최적의 유리 모 세관 피펫은 모 세관 작용에 의해 단일 셀을 발음 수 있습니다. 그러나, 조리개의 직경이 너무 크면, 모 세관 비 생활 오염 물질 또는 심지어 (는) 다른 organism(s), 목표 셀 외에 그릴 것입니다.
최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫을 얻기 위해 다음 사항을 주의 하는 중요 하다. 첫째, 불꽃의 기둥 유리 모 세관 피 펫을가 열 하는 때 좁은 수 있어야 합니다. 다음, 파스퇴르 피 펫, 당기는 불꽃;에서 제거 그렇지 않으면, 파스퇴르 피 펫의 조리개 붕괴 됩니다.
장비 및 컨테이너가이 프로토콜에 표시 된 기본은 하 고 수정할 수 있습니다. 예를 들어 사용 하 여 멀티 잘 플레이트 한 잘 시계 안경 대신, 셀 세척 할 수 있다 더 효율적. 또한, 기타 유사한 것 들에 대 한 컨테이너를 교체하실 수 있습니다. 마지막 단계에서 문화 매체에 단일 셀을 전송 하 여 클론 문화를 설정할 수 있습니다.
멸 균된 용기를 준비 하 고 후드에서 axenic (오염된) 긴장을 설정 합니다. 오염을 방지 하기 위해, 그것은 이상 3 x 신선한 aliquots와 세척 단계를 반복 해야 합니다. 가끔은, 박테리아는 또한 항생제15을 추가 하 여 멸 균.
이 방법에 초점을 맞춘 desmid (Zygnematales) 절연, 하지만 유리 모 세관 피펫은 조리개의 크기를 바꾸어 서, 그것은 다르게 크기의 플랑크톤의 고립에 적용할 수 있습니다.
감사의 글
우리 감사 히사요 노자 키 (도쿄 대학), 오 나카 다 (게이오 대학), 유카 Marukawa 하시 모토 (일본 여자 대학교), 히로유키 Sekimoto (일본 여자의 대학). 그들의 의견에 대 한 검토자에 게 감사 하 길. 이 연구는 과학의 승진, 일본, 일본 사회에서 과학 연구 (No. 26440223 및 15 H 04413)에 대 한 특정 고 유키 Tsuchikane에 새로운 기술 개발 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, 일본 | N-NO380T | 메쉬 크기: 32 & 마이크로; m |
| 휴대용 현미경 (예 : Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN : 4960759 206725 | 배율 : 20 배; |
| 확대경 (예: Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., 일본 | 1985-20 | 배율 : 20 배; |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. 일본 | 멸균 spuit No.4 | |
| 50 mL 튜브 (나사 캡이 있는 50 mL 원심분리기 튜브) | Labcon, 미국 | 3181-345-008 | |
| 병 (100 mL 폴리카보네이트 병) | AS ONE Corporation, 일본 | 1-7403-01 | |
| 60 mm 접시 | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | 조류 관찰을 위해. 60mm/처리되지 않은 접시 |
| <강한>마이크로피펫 준비 | |||
| 파스퇴르 피펫(면 플러그 9") Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, 미국 | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| 고무 전구 (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| 스테인리스 펜치 | AS ONE Corporation, 일본 | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| 시계 유리 (혈액 반응 보드) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | 은 격리 중에 세포를 헹굽니다. 지름 22mm, 깊이 1mm |
| 나사식 시험관 | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170mm |
| 도립 광 현미경 | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | 조류 분리용. |
| 플라스틱 접시 | Asahi glass Co. Ltd., 일본 | SH90-15E | 90 &번; 15의 mm |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
