신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

Summary

이 프로토콜의 목표에서 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 격리 장 중추에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 이 프로토콜 포함 플래시-냉동 인간 창 자 조직, cryosectioning, ethanolic 얼룩 및 탈수, LCM, 샘플 준비 및 RNA 추출.

Abstract

이 방법의 목적은 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여에서 수집 하는 장 신경에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 5 단계 워크플로에서 RNA-이 대 한 충분히 높은 품질과 수량 장의 중추에서 RNA 분리를 얻기위한 중요 한를 확인 했습니다. 첫째, 준비할 때 장 조직, 각 샘플 아래쪽 큰 기본 금형의 가능한 serosa 병합 전에 blotting에 의해 제거 하는 모든 초과 액체를가지고 있어야 합니다. 다음 샘플 2 methylbutane 드라이 아이스의 슬러리 꼭대기 신속 하 게 고정 됩니다. 둘째, 조직 단면, 그것 장 섹션 슬라이드 당 장 신경의 가장 큰 표면 영역을 양보 함으로써 myenteric 총의 전체 평면 병렬 cryomolds 위치에 중요 하다. LCM, 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 중 세 번째-최고의 속도 장의 중추를 수집 하는 때 장 중추의 비균일 도형의 윤곽에 유연성을 제공 하는 막 슬라이드. 넷째, 섹션 내 장 신경의 고유한 시각화를 위한 Cresyl 바이올렛 같은 에탄올 호환 염료 수성 염료를 기준으로 RNA 무결성의 우수한 보존을 제공합니다. 마지막으로, 캡처된 중추에서 RNA 추출, 우리는 DNA 오염을 제거 하는 동안 우수한 RNA 수량 나왔고 상업적인 RNA 추출 키트와 품질, 차이점 관찰. 현재 프로토콜에서 이러한 요소의 최적화 크게 워크플로우를 가속화 하 고 뛰어난 RNA 품질 및 수량 장의 중추 샘플을 생성 합니다.

Introduction

이 메서드는 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 인간의 창 자 조직에서 장의 중추의 높은-품질 RNA 샘플을 얻기 위해 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)에 대 한 충분 한 RNA 품질 및 수율을 제공 하도록 최적화 된 하며 갓 절제, 고정, 플래시-냉동 인간 창 자 조직으로 사용 될 것입니다.

기능성 위장 하 고 본질적인 운동 성 장애는 미국에서 4 명 중 하나에 영향을 줍니다. 장 신 경계 (ENS), 두 번째 뇌¹라고도 종종 이러한 장애의 중심에 직감 항상성 및 운동에 중요 한 역할. 창 자 운동 성의 조작 일반적으로 aganglionic/noncontractile 조직, 만성 식이 수정 및/또는 약물의 외과 절제술으로 제한 되었습니다. 놀랍게도, 성인 팔의 전체 transcriptome 시퀀싱 할 약물 타겟 줄기 세포 치료에 활용 될 수 있는 ENS 내의 분자를 식별 하는 우리의 기능을 크게 제한 남아 있습니다.

인간의 장 중추에서 RNA를 분리 하는 데 상대적으로 몇 가지 방법이 있다. 첫 번째 접근 방법, 셀 분리², 필요 높은 부 화 온도 및 긴 보육....

Protocol

여기에 설명 된 모든 프로토콜에 의해는 밴 더 빌 트 대학 기관 평가 위원회 (IRB) 승인 있다.

1입니다. 조직 도착 전 준비

1. 적절 한 IRB 승인을 하 고 연구에 필요한 모든 연구 조건을 만족 하는 기증자 로부터 갓 절제, 떼어낸 장 조직을 얻기 위해 인간 장기 기증 기관 조정.
   참고:이 프로토콜 쥐 및 다른 설치류 모델 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.
   1. 즉시 각 장 세그먼트의 절제, 따라 철저 하 게 냉장된 PBS 또는 조직 저장 매체 잔여 luminal 자료 또는 배설물 제거 루멘 플러시.
   2. 홍 조 및 적절 한 생물 소켓에 폐기물 폐기, 후 충분 한 양의 조직을 저장 매체 (예: 3-5 회 장 조직의 볼륨)에서 조직 잠수함 하 고 개별적으로 표시, 방수 플라스틱에 저장 컨테이너, 얼음에 빠져들 또는 사용까지 냉장).
   3. 상당한 RNA 저하를 방지 하기 위해 컬렉션의 시간 18-26 시간 이내 조직 프로세스.
      참고: 장 세그먼트 및 스토리지의 청결에 따라 수 있습니다 우리의 제안된 시간 제한 확장.
2. 이 프로토콜에 표시 된 대로 사전에 인간의 조직 컬렉션에 필요한 모든 자료를 준비 (더 자세한 제품 정보에 대 한

Results

기존 프로토콜 RNA-이 대 한 기준을 충족 하는 LCM을 사용 하 여 인간의 장 샘플에서 장의 중추의 상대적으로 빠른 컬렉션을 사용할 수 있는 여러 가지 개선을 하였습니다. 첫째, 우리는 2-mb (그림 1B) 드라이 아이스의 슬러리의 표면에 배치 하는 큰 기본 금형에서 장 조직 세그먼트의 급속 동결 최적화. Cryosectioning 및 후속 LCM 동안 최고의 성공 (1B-1 C 수치)를 점 막 쪽에 직면, 기본 금형 내 평면 장 세그먼트 누워 하 여 얻은 했다. 로 어떤 곡률을 myenteric 총의 큰 단면도를 훨씬 더 어렵게 만들 것입니다 기본 금형 기지, 가능한 평면 인지 확인 합니다. 이 이렇게 쉽게 8 µ m 두께 (그림 1E) 구분 및 착 색 과정에서 TFM.......

Discussion

이 절차 RNA-이 대 한 RNA를 파생 하는 원본으로 수많은 장 중추의 효율적인 수집 가능 여기, 우리가 극대로 RNA 무결성을 유지 하면서 기존 프로토콜에서 설명 하는 프로세스를 가속 있다. 이 절차의 모든 단계는 상호 의존, 그것은 중요 한 연구의 개시에서 모든 문제를 제거 하 고는 모든 샘플 준비가 되어로 유사 하 게 다른 가능한 신뢰할 수 있는 RNA-이를

절차의 개시에서 RNA 무결성 수 있습니다 부정적인 영향을 받을 경우 실험실에서 처리를 위해 장기 기증 시 조직의 컬렉션 및 조직의 영수증 사이 시간 간격 (찬 허 혈 성 시간) 너무 깁니다. 이 문제를 감안할 때, 우리는 높은-품질 RNA 여전히에서 추출 수 있습니다 장 샘플 24 시간 냉 허 혈 성 후에 놀 랐 다. 장 샘플은 냉장 냉장 솔루션에 제대로 저장 때 조직의 무결성 및 RNA 품질의 최상의 보호가 이다. 장 조직 기관 컬렉션 팀 내장의 소화 효소, RNases 및이 기간 동안 RNA 품질에 영향을 줄 수.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% 중립 완충 포르말린	Sigma	HT501128-4L
2-Methylbutane	Fisher	O3551-4
3-mL 주사기	BD	309628
50-mL 원뿔형 튜브, 폴리프로필렌	Corning	05-526B
베이스 몰드 37x24x5mm, 일회용	전자 현미경 과학	5025511
Belzer UW  냉장 보관 솔루션	Bridge to Life	N.A.
CapSure 매크로 LCM 캡	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
클링 랩, 프레스 N 씰	다행스럽다	N.A.
Cresyl Violet Acetate	Acros Organics	AC405760025
Cutting Board	Electron Microscopy Sciences	63308
에탄올, 190-proof	Pharmco-AAPER	111000190
에탄올, 200-proof	Pharmco-AAPER	111000200
유리 현미경 슬라이드	Fisher	12-550-343
장갑, 확장 커프	Microflex
가운, 수술용	일회용 킴벌리-클라크	19-088-2116
트레이, 20 L (대형 폴리프로필렌 살균 팬)	Nalgene	1335920B
Kimwipes (대)	킴벌리-클락	34120
Kimwipes (small)	킴벌리-클락	34133
레이저 캡처 미세해부 시스템(ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Leica Cryostat 척, 대형,  40 mm	남동부 병리학 기기 서비스	N.A.
광학 현미경	Olympus	CX43
현미경 대물렌즈(20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
현미경 대물렌즈 (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Molecular Sieves	Acros Organics	AC197255000
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
PicoPure RNA 추출 키트	Applied Biosystems	12204-01
펠렛 유봉	Kimble Kontes	4621973
PEN 멤브레인 LCM 슬라이드	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
RNase-free 튜브, 1.5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
RNA 추출 키트 "A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
RNA 추출 키트 "B" (RNeasy  마이크로 키트)	Qiagen	74004
RNA 추출 방법 "C"(TRIzol)	Invitrogen	15596-026
RNA 추출 키트 "D"(RNeasy PLUS Mini 키트)	Qiagen	74134
스플래시 쉴드, 일회용 안면 보호대	Fisher	17-310
가위, 외과용, 14.5cm "날카롭게"	정밀 과학 도구	14002-14
주사기 필터, 셀룰로오스 아세테이트(0.2 & m)	Nalgene	190-2520
조직 냉동 매체	일반 데이터 의료	TFM-5
자일렌	피셔	X3P1GAL