개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

Biomechanical 세력, hemodynamic 전단 응력, 같은 심장 morphogenesis에서 친밀 하 게 포함 된다. Hemodynamic 전단 세력에 대 한 응답, 심근 능선과 홈 개발 전단 응력의 방향으로 정렬에 파도 같은 배수 네트워크에 걸쳐 것 (AV) 밸브¹. Trabeculation 심장 수축 기능 및 심근 질량²증가 필요가 있다. 노치 신호 통로에서 돌연변이 인간과 다른 척추 동물³에서 선 천 성 심장 결함 발생. 예를 들어, gata1a⁴ , tnnt2a⁵ morpholino oligonucleotides (MO) erythropoietin (EPO) mRNA⁶ 및 Isoproterenol (ISO)⁷ 증가 빨간 혈액 적혈구를 줄이기 위해 표시 되었습니다 있다 세포와 심장 박동 각각, 그리고 그러므로 전단 응력 (WSS) 벽. 또한, ErbB2 신호, 하류, 노치의 cardiomyocyte 확산 및 차례 차례로 활성화 노치 신호^8,9수축 성 힘을 생성 하는 차별화를 촉진. 노치 신호 심 실 개발에 대 한 제어 trabeculation를 지배 하는 그 전단 응력이 좋습니다. 현재, 추가 선 천 성 심장 결함 (CHD)^10,,1112, 선도 유전자 프로그래밍 이벤트를 이해 하려고 많은 연구 하지만 거의 조사 하는 방법 기계적인 힘 영향 형성 심장.

기계적인 힘 조사 연기 endocardium, 발달 기간 동안 가까운 관측에 구현 해야 합니다. 그러나, vivo에서 박동 때문에 전통적인 현미경 검사 법¹³의 판매세 샘플의 좋은 품질의 이미지를 얻기 위해 도전 이다. 샘플 내에서 시간이 지남에 개발을 관찰 하기 위해 실제 단면 및 얼룩, 따라서 필요가 발생 하는^13,,1415. Confocal 현미경 검사 법은 널리 샘플^14,16의 3 차원 구조를 이미지 하는 데 사용 됩니다, 비록 이러한 이미징 시스템이 인수는 여전히 느린 검색 속도 의해 제한 됩니다.

빛-시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM)은 긴 작동 거리¹³동적 이벤트 vivo에서 의 시각화 수 있도록 독특한 이미징 기술입니다. 이 기술은 빛 시트 형광 현미경을 사용 하 여 광학 샘플¹⁷섹션. 샘플에 빛의 단지 얇은 시트의 조명으로 인해 사진 표백 및 사진 독성^13,18에 감소가입니다. 보기 및 긴 작동 거리의 큰 분야 대형 샘플 이미지^13,,1417은 그대로 남아 있습니다. 낮은 확대 긴 동안 이미지를 더 큰 영역에 대 한 허용 작업 거리 신호 대 잡음 비율을 타협 하지 않고 이미지를 두꺼운 샘플에 대 한 수 있습니다. 많은 그룹 이미지 전체 배아¹⁷LSFM 사용,^14,18, 근육 및 심 혼¹⁹ 다른 조직 중 몇 군데 수 샘플의 다양 한 종류를 보여주는 두뇌.

이전 연구 zebrafish 심장의 유입 또는 유출 트랙 경색으로 감소 hemodynamic 전단 힘 설명, 정보는 전적으로 질적. 그것은 결과 비정상적인 3 챔버, 저하 심장 루핑, 장애인된 밸브 대형²⁰. 4 차원 LSFM 이미지 hemodynamic 전단 세력에 영향을 미칠 방법으로 심장 조직 개발 새로운 관점 제공 합니다. 이러한 기계적인 힘 힘 민감한 신호 분자를 활성화 하 고 배수 능선의 형성을 유발 수 있습니다. 4 차원 영상의 추가 시간 측면 때문에 하나는 개발 이전 주목 했다 새로운 폭로 이어질 수 있는 실시간으로 변경 내용을 추적할 수 있다. Zebrafish는 과학자만 세포 세포 상호 작용에 대 한 전체 척추 동물을 관찰할 수 있기 때문에 이미지에 대 한 이상적인 모델입니다. 산소 또한 포유류 개발에서와 달리 혈관 시스템에 따라 하지 않고 발생 하는 개발을 수 있는 전체 태아 통해 무마 수 있습니다. Zebrafish 심장 필요 4 연 발 심장, 폐 장기 부족 하더라도 심장 유전자가 zebrafish와 인간²¹사이 보존의 큰 숫자가입니다.

이 원고에 우리는 다양 한 상황에서 zebrafish 마음에 개발 trabeculae 이미지를 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 주입 gata1a⁴ 또는 tnnt2a⁵ 의 모스 낮은 혈액 점성을 따라서 WSS 사용 되었다. 심장의 형태학 다음 기록 했다. 물고기의 별도 그룹에서 우리 EPO mRNA⁶ 또는 isoproterenol⁷ 을 투여 하 여 WSS를 증가 하 고 결과 관찰 했다. 우리는 또한 다른 타악기 또는 진동 흐름 율을 가진 셀 연구를 실시. 후 각 그룹 이미징, 우리 발견 WSS 노치 통해 endocardium에 의해 감지 신호 시작 trabeculation.

우 타와 UCLA IACUC 프로토콜에 따라 다음 방법은 수행 했다. 이러한 실험적인 그룹 유전자 변형 Tg(cmlc2:gfp)와 함께 사용 되었다 wea (약한 아 트리 움) 나 clo (접속이) 돌연변이: (a) 야생-타입 (WT) 제어, (b) gata1a 미주리, 및 (c) tnnt2a 모 주사 (표 1).

표 1: 제 브라 대 한 설명입니다. 정의 하 고 실험에 사용 된 Zebrafish의 설명입니다.

1. 연구 설치

1. Trabeculation 구조에 대 한 Nrg1 및 EPO mRNA를 준비 합니다.
   1. 인간의 Nrg1 cDNA를 기증자 플라스 미드에서 증폭.
      참고: 인간의 Nrg1 cDNA는 스탠포드 대학에서 윌리엄 Talbot에서 재능 했다.
      1. 필요한 시 약 및 재료, 즉 PCR mastermix (-20 ° C에 저장), 뇌관 (참조 표 2) (-20 ° C에 저장)는 PCR 플레이트 (실내 온도에 저장), 그리고 20 μ 피 펫 (실내 온도에 저장)을 꺼내. 예를 들어 제품에 대 한 자료의 표 를 참조.
         
         표 2: 인간 Nrg1 복제를 위한 뇌관.
      2. mastermix triplicate 20 μ 피 펫을 사용 하 여 설정 하는 각 뇌관을 위한 준비. Triplicates의 1 세트는 mastermix의 37.5 μ, DNA 무료 물 3 μ, 뇌관의 4.5 μ를 사용 하 여. 더 많은 triplicates에 대 한 샘플의 수로 곱하면 단순히.
      3. 샘플 당 잘 당 총 10 μ 있다 그래야 DNA 무료 물 뇌관 지구에서 작업 솔루션 인간 Nrg1 cDNA (20 ng/μ g 농도)을 희석.
         참고: 각 솔루션 단계 1.1.1 고르게 분포 되어 있는지 확인 합니다. 아래로 pipetting으로 각 솔루션을 혼합 하 여 이렇게 합니다. 교차 오염을 방지 하기 위해, 하나의 샘플에 대 한 하나의 피 펫 팁을 사용 합니다.
      4. 약 수 10 μ 다중 채널 피 펫 PCR 접시에 원하는 웰 스와 Nrg1 cDNA.
      5. 우물에서 cDNA를는 mastermix의 14.5 μ를 추가 합니다. 웰 스, 밀봉 하 고 PCR 기계를 PCR 접시에 스티커 덮개를 적용 합니다.
      6. PCR 기계를 시작 하 고 주기 효소와 뇌관 사용에 따라 적절 한 온도 도달 하면 확인 합니다.
   2. 플라스 미드 pCS2에 Nrg1 cDNA를 클론⁺ 사용 하 여 초과 효소 BamHI 및 EcoRI cDNA 모든 플라스 미드에 출혈 BamHI EcoRI 사이트에서.
      1. 기증자와 플라스 미드 pCS2 Nrg1 cDNA를 믹스⁺, 상용 마스터 혼합 솔루션 및 뇌관 (표 2).
         참고: 총 반응 볼륨 마스터 믹스, 뇌관의 3 μ와 Nrg1 cDNA와 20 ng/μ 기증자 플라스 미드의 1 μ의 25 μ와 50 μ 이어야 한다.
      2. PCR 기계에 단계 1.1.2.1에서에서 믹스 하 고 다음 사양을 충족 시키기 위해 매개 변수를 설정: 98 ° C 10 s 5 또는 15 s, 55 ° C, 5 s/kb에 대 한 72 ° C.
      3. 제조업체의 지침에 따라 정화 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화. 차입 버퍼의 50 μ로 제품을 elute.
      4. 순화 된 PCR 제품 및 pCS2의 5 μ g 소화⁺ BamHI와 200 μ 반응 볼륨에서 2 h 동안 37 ° C에서 별도로 EcoRI. 상업적인 장비로 결과 소화를 정화 하 고 각각 20 μ에 Tris HCl (pH 8.5)의 100 μ elute.
      5. Nrg1 cDNA의 4 μ와 소화 pCS2의 2 μ 선⁺ 25 μ 반응에 1 μ와 16 ° C에 리가 촉매의 하룻밤 플라스 미드.
         참고: 절차 야간 보육에 대 한 여기 중지 될 수 있습니다.
      6. 1.1.2.5 단계에서 결 찰 솔루션 및 변환의 2 μ를 사용 하 여 복제 ( 재료의 표참조)에 대 한 적합 한 대장균 박테리아 세포의 50 μ로.
   3. 확인 변환 Nrg1 cDNA 클론 PCR를 사용 하 여 심사에 의해 일어났다. 클론을 무작위로 선택한 특정 뇌관, 중 합 효소, 및 deoxyribonucleotide 된 (dNTPs)의 솔루션에 추가 합니다.
      참고: 컨트롤 했다 벡터 (pCS2⁺)와 삽입 (인간 cDNA) 없이. 선택 하지 너무 큰 식민지의 과도 한 박테리아 PCR을 억제할 수 있는 때문에.
      1. 변환 및 화면 pCS2에서 8 식민지를 선택⁺-Nrg1는 표 2에서 PCR 뇌관을 사용 하 여 복제.
      2. 한 복제는 pCS2을 Nrg1 cDNA와 문화⁺-Nrg1 플라스 미드 DNA. PCS2와 대장균 박테리아의 100 μ와 접종⁺-파운드 미디어와 문화 (160-225 RPM) 37 ° c.에 떨고 하 여 100 mL로 플라스 미드 Nrg1
   4. Transfect 순화 pCS2⁺-HEK 293으로 플라스 미드 Nrg1 제조업체의 지침에 따라 상업 transfection 시 약을 사용 하 여 6 잘 플레이트 세포.
   5. transfection, 후 24 h lyse 세포 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여 SDS 페이지 젤을 통해 실행, 젤 막에 전송 하 고 안티-Nrg1 항 체²²얼룩. Nrg1 단백질 표정을 서쪽 오 점 사용 하 여 확인 합니다.
      참고: 컨트롤은 빈 pCS2⁺ 플라스 미드. 수 수 일시 중지 여기 젤 막 전송 하룻밤 발생 하는 경우.
   6. 테이블의 재료 에서 비슷한 상용 제품을 사용 하 여 Nrg1 mRNA를 합성 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.
      1. 받아 5 μ는 pCS2의⁺-플라스 미드를 선형화를 37 ° C에서 2 시간 200 μ 반응에서 노트와 고립 된 박테리아 문화 다이제스트에서 Nrg1 DNA.
      2. 상업적인 장비로 선형화 플라스 미드 정화 하 고 Tris HCl (pH 8.5)의 20 μ에 elute.
      3. 제조업체의 지침에 따라 선형화 플라스 미드의 5 μ를 사용 하 여 20 μ 반응에 상업적인 RNA 격리 키트와 함께 녹음 방송 생체 외에서 실시 합니다.
      4. 생체 외에서 베 꼈 다 Nrg1 RNA 세포의 용 해 버퍼의 350 μ를 추가 하 고 RNA 격리 키트 정화. Tris HCl (pH 8.5)의 60 μ에 RNA을 elute.
      5. RNA 농도 측정 하 고 나중에 사용-80 ° C에서 저장.
   7. 따라 단계 1.1.6.1- EPO cDNA 및 mRNA 준비 하지만 클론 EcoRI와 XhoI pCS2 + 플라스 미드에 cDNA 대신 사이트에 대 한 위의 1.1.6.5.
2. Zebrafish Morpholino 주입
   1. ²³ 개월 주사 gata1a⁴ (5 '-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3) 및 tnnt2a⁵ (5 '-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3) ATG 시퀀스에 대 한 온라인 도구 (테이블의 재료)를 사용 하 여 디자인 합니다.
   2. 8 ng/nL와 4 ng/nL의 최종 농도 각각 있도록 nuclease 무료 물에 gata1a 및 tnnt2a 모 별도로 추가 합니다. 20 세/nL의 최종 농도와 EPO mRNA와 반복. 마지막 볼륨 1 mL 인지 확인 합니다.
   3. 1 주사 nL 8 gata1a 모의 nL와 1의 심 실 벽 전단 응력 (WSS)²⁴를 줄이기 위해 4 tnnt2a 모 4 셀 단계 1에서 별도 zebrafish 태아로의 nL의 nL. WSS를 증가 하기 위하여 주사 1 1-4 세포 단계에서 zebrafish 태아에 EPO mRNA⁶ 의 20 세/nL의 nL.
3. 제 브라 trabeculation를 억제 하기 위해 화학적 치료
   1. 30 5 μ M의 최종 농도에 E3 매체에 1 %DMSO 10 mg/mL AG1478 희석 20 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 관으로 hpf. 컨트롤, 각 물고기 1 %DMSO을 처리 합니다.
   2. 1 %DMSO N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-부 틸 에스테 르 (DAPT) 추가 (100 μ M) 40에서 노치 신호를 억제 하기 위해 15 mL 튜브에 E3 매체 hpf 비슷한 방식. 컨트롤로 1 %DMSO 치료.

2. 이미징 기술

1. 4 차원 심장 LSFM 이미징 동기화 알고리즘
   1. 여러 심장 박동 주기 (그림 1) 아래 단계를 사용 하 여 전체 물고기 태아의 2 차원 이미지를 인계. 빛-시트 두께 약 5 μ m 인지 확인 합니다. 나이 키스 트 샘플링 원리²⁵에 따르면 무손실 디지털 샘플링에 대 한 1 μ m 500 x-y 프레임 10 양 세트 z 검색의 노출 시간을 가져가 라.
      1. 100 ml agarose의 1 g을 추가 하 고 모든 agarose 해산 때까지 열 하 여 1% (w/v) agarose 젤을 만듭니다. 배아와 agarose 20 μ 피 펫을 사용 하 여 작은 플라스틱 튜브를 로드 하 고는 무대에 그것을 확보.
      2. 이미지 보기 소프트웨어 열고 라이브 샘플의 라이브 뷰를 보려면 클릭 합니다. 목표는 샘플 초점에서 손잡이 사용 하 여 조정 합니다. 마찬가지로, 샘플의 라이브 뷰 태아의 맨 위에 표시 되도록 스테이지를 이동 합니다.
      3. 5에 대 한 500 번 이미지에서 10 배 확대 현미경의 소프트웨어²⁶를 사용 하 여 s.
      4. 새 레이어 (z 축에서 1 μ m)에 모터를 사용 하 여 스테이지를 이동 하 고 이미징 절차를 반복 합니다.
      5. 전체 심장 군데 완전히 될 때까지 위의 2 단계를 반복 합니다.
   2. 첫 번째 및 마지막 심장 주기 이미지를 무시 하 여 데이터 무결성을 확인 합니다. 심장 주기, 하지만 다른 기간에 같은 시간 지점에서 찍은 이미지를 일치 하 여 심장 주기의 기간을 찾아. 기간을 찾기 위해 개발 되었다 다음 식을 사용 하 여:
      (1)
      D 기간 가설 피팅 사용 비용 함수는 나_m 캡처된 이미지 τ' 이미지가 캡처된 시간 z_k 이미지의 z 방향 인덱스, x_m 는 픽셀 인덱스의 벡터와 T' 정기 가설입니다.
   3. 다음 방정식을 사용 하 여 유사한 단계에 두 사진 사이의 상대 shift를 찾을.
      (2)
      여기서 Q_{k', k} 나타냅니다 상대적 변화, R 에 대 한 비용 함수는 가능한 공간 이웃 L 이미지 캡처의 총 시간, x 는 픽셀 인덱스, z_k 및 z_k' 첫 번째 및 두 번째 z-방향으로 분할 영역, 이며, t 는 시간, s 는 상대 shift 가설.
   4. 첫 번째 이미지에 대해 절대 변화에 상대 shift를 변환 하 고 앞에서 설명한²⁷이미지의 다음 섹션을 정렬 하려면 절대 관계를 찾으려고 의사 역 접근을 사용 하 여 선형 방정식을 해결.
   5. 마지막 4 차원 이미지 이미지 프로세싱 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 처리 되었습니다.
      1. 3 차원으로 2 차원 이미지를 스태킹
         1. 상업 이미지 프로세싱 소프트웨어를 엽니다.
         2. 오픈 데이터를 클릭 합니다.
         3. 모든 이미지를 3 차원으로 쌓을 수 선택 > 클릭 부하.
         4. 0.65 x 0.65 x 1의 복 크기에 추가 > 확인을 클릭 합니다.
         5. 3 차원 이미지를 시각화에 Multi-Planar 보기 상자를 클릭 합니다.
         6. 블루 slice_1.tiff 상자를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 > 디스플레이 선택 > Volren를 선택 합니다.
         7. 편집 을 클릭 > 옵션 > 편집 색상표선택.
         8. 빨간색으로 설명 된 상자를 사용 하 여 색상 조정 > 확인을 클릭 합니다.
      2. 4 차원 3 차원 변환
         1. 클릭 "파일 > 시계열 데이터를 엽니다.
         2. 그냥 만들어진 3 차원 tiffs 선택 > 클릭 부하.
         3. 앞으로 동일한 복 크기를 입력 합니다.
         4. 블루 slice_1.tiff 상자를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 > "디스플레이"를 선택 > Volren를 선택 합니다.
         5. 편집 을 클릭 > 옵션 > 편집 색상표선택. 상자를 사용 하 여 색상 조정 > 확인을 클릭 합니다.
         6. 시간 시리즈 컨트롤 마우스 오른쪽 클릭 > Movie maker 를 클릭 > 영화를 시청 하려면 재생 단추를 누릅니다.
         7. 추가 파일 이름, 프레임 크기, 프레임 속도, 품질 1, 평면 입력 > 클릭 적용
         8. 비디오를 내보냅니다. 적절 한 소프트웨어에서 비디오를 엽니다.

3. qRT-PCR 분석

1. Zebrafish 노치 ligands, 수용 체, 계량 RNA 격리 마음과 대상 유전자의 식
   1. Tricaine methylate^,2829의 과다 복용에 그들을 쓰는 하 여는 제 브라를 희생. 앞에서 설명한 프로토콜³⁰을 사용 하 여, zebrafish 마음 excised 했다 고 RNA 격리에 대 한 준비.
   2. 총 RNA를 분리 하 고 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용 하 여 cDNA를 합성.
   3. PCR 뇌관 디자인 노치 ligands Jag1, Jag2, Dll4, Notch1b, 수용 체 및 신호 관련 유전자 Nrg1 및 ErbB2. 우리가 사용 하는 뇌관 표 3을 참조 하십시오.
   4. 단계의 3.1.3 뇌관, 단계의 3.1.2, 고립 된 mRNA와 상업 mastermix PCR 접시에 추가 합니다. 적절 한 온도 시간에 따라 사용 하는 효소에서 qRT-PCR을 실행 합니다. 정상화 zebrafish α-걸을 결과.
      참고: 이 ligands, 수용 체, 그리고 유전자의 각 식 레벨을 계산 합니다.

4. 인간의 대동맥 내 피 세포 (항구적) 실험 체 외에

1. 동적 전단 응력 모델
   1. 항구적 문화 미디어와 문화 항구적 셀입니다. 일단 완전히 confluent 층 류 및 23 x 10^-5 N 24 h에 대 한 1의 속도 타악기 흐름 셀을 표시 합니다.

LSFM은 고해상도 2 차원 및 3 차원 사진을 얻기 위해서는이 원고에 사용 되었다. 그림 1A 및 1B에서 보듯이 조명 렌즈 빛 시트 샘플에 지시 합니다. 빛 시트의 두께, 때문에 단일 평면 조명 이다. 감지 렌즈 조명 렌즈에 수직으로 위치 이며 조명된 평면 (그림 1B)에 초점을 맞추고. 조명 렌즈에서 빛 시트 다음 왼쪽에서 오른쪽 (그림 1C) 샘플을 검색합니다. 스캔 덜 사진-표백, 사진-독성, 허용 하 고 더 낮은 신호 대 잡음 비율.

LSFM 빠른 스캐닝 (> 30 s) 복 셀 해상도 0.65 x 0.65 x 1 µ m입니다. 단일 평면 조명 때문에 의해34 전체 심장 구조 시각화 하기 위해 Tg(cmlc2a:gfp) 배아에 적용 된, 배경 잡음은 크게 감소 (그림 1). 75에서 심 실 루멘으로 배수 능선 protruded hpf, 그리고 배수 네트워크 명확 하 게 표시 했다 100 hpf (그림 2A, B). Gata1a 모 마이크로 주입 904,35조 고 점도 감소. 이 줄어든된 점도 감쇠는 지연된 개시 및 75에 배수 네트워크의 밀도 결과 hemodynamic 전단 응력, hpf와 100 hpf 제어 그룹 (그림 2 C, D)에 비해. 또한, 단계에서 (Dll4, Jag1및 Jag2), 수용 체 ligands (Notch1b), 그리고 하류 신호 구성 요소 (Nrg1 및 ErbB2) gata1a 모에 대 한 응답에서 아래로 통제 했다 주입 (p < 0.05, n = 5) (그림 2 K)2,,836. Gata1a 모 Nrg1 mRNA 위로 노치 신호 관련 유전자 발현 및 배수 구조 형성의 5 μ M와 75에서의 공동 주입 hpf와 100 hpf (그림 2E, F, K). 따라서, gata1a 모 Nrg1 mRNA 위로 노치 관련 유전자를 구출 하는 반면 노치 신호, 다운-레 귤 레이 션을 이끌어 hemodynamic 세력을 감소 하 고 trabeculation를 다시 시작.

추가 우리의 가설을 강제로 hemodynamic 변경 및 따라서 노치 신호, wea 돌연변이 소개를 통해 trabeculation를 증명 하기 위하여는 비 수축 성 심37을 개발 한다. 심 실 유입 및 심 방 systole 동안 hemodynamic 세력의 부재, wea 돌연변이 익스프레스 노치 신호 구성 요소 유전자의 낮은 심장 mRNA 수준 및 대상 유전자 컨트롤에 비해 비 trabeculated, 작고 약하게 항구 심 (그림 2G, L) 계약. 그러나, Nrg1 mRNA 마이크로 주입 wea 돌연변이에 최대-규제 비 수축 성 아 트리 움 (에도 불구 하 고 더 발음된 수축 성 심 선도 노치 신호 전달 경로, 배수 능선의 부분 구조와 함께 그림 2 H, L)2. 이러한 맥락에서 wea 돌연변이 노치 신호를 통해 trabeculation의 hemodynamic 변조 강조 비 수축 성 아 트리 움과 비 trabeculated 심 실 사이의 관계를 뒷받침.

Tnnt2a 모는 심장 수축 심장 분 T38,39억제 들러 전달 했다. Tnnt2a 모 주입 물고기 순환 및 중요 한 아래로 노치 신호, 부드러운 심 실 표면 및 얇은 벽에 제어 그룹 (그림 2I, M) 에 비해 선도 인 심 실 WSS 없는 완전히 했다 . WSS는 endocardium에 trabeculation에 대 한 요구 였는 지 여부를 조사 하는 endocardium 및 심장 내 피 막 개발 하지 않습니다40,41 접속이 (clo) 돌연변이 있습니다. Clo 돌연변이 심장 trabeculae 개발 하는 데 실패 하 고 작은 크기의 심 실 및 (그림 2J)를반복 하는 불완전 한 심장 보였다. 따라서, endocardial 안 대기는 감각 hemodynamic 전단 응력을 노치 신호 (그림 2 M)를활성화 하는 데 필요한. 그러나, hemodynamic 전단 응력 조 또는 isoproterenol 수축 증가 증가 의해 증가 했다 때 노치 관련 유전자의 표현 레벨을 증가 하지 않았다 하 고 배수 네트워크 형태를 변경 하지 않은 (그림 3)입니다.

더 설명 하기 위해 전단 응력 및 노치 신호 사이의 관계, HAECs 생체 외에서 테스트를 위해 사용 되었다. 타악기 흐름 시뮬레이션 내 피 세포에 의해 관찰 hemodynamic 전단 응력 confluent 셀에 발휘 했다. 그것은 정적에 비해 문화, 타악기 문화 노치 관련 유전자 (그림 4)의 표현을 증가 표시 됩니다. 또한, ADAM10 억제제 치료는 크게 노치 신호 (그림 4)감소.

다음, 심 실 분수 단축 및 심 실 구멍 변화 볼륨에는 야생-타입, gata1a 모, AG1478에 대 한 시간이 지남에 계산 하 고 그 Nrg1 주입 그룹 50에 의해 구출 hpf, 75 hpf, 및 100 hpf (그림 5A-C) . ErbB 신호 억제 물, AG1478, 치료 크게 지연 및 감소 100 심 실 심장 중 소수 단축 hpf (그림 5A). Gata1a 모 및 AG1478 치료 4 차원 LSFM (그림 5E, F)에 있는 변화에 의해 평가 동안 수축, 심 실 챔버 크기 감소. 두 그룹 모두를 증가 끝 심장 수축-이완 볼륨 야생-타입에 비해 개발. Gata1a 모와 Nrg1 mRNA의 공동 주입 야생 타입의 사람들 방출 분수와 소수 단축, 복원.

그림 1 : 형광 빛 시트 개요. (A) 대표 LSFM 시스템 샘플 조명 렌즈 (IL)에서 빛 시트의 교차와 감지 렌즈 (DL)의 검색 경로에 배치 됩니다. (B) IL 뒤에 원통형 렌즈 미크론 크기의 빛 시트 (퍼플) 샘플, 내 흥분 샘플의 얇은 시트를 만듭니다. 감지 렌즈 방출된 형광 신호를 기록합니다. (C)는 회로도 광학 zebrafish 태아를 왼쪽 오른쪽 이동 단면 얇은 레이저 시트 (퍼플) 이 그림은 리 외17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 심 실 형태학의 유전자 조작 Tg(cmlc:gfp) zebrafish 노치 Ligand와 수용 체, 대상 유전자 발현. (A) 배수 네트워크 75에 표시 됩니다 제어 zebrafish의 hpf. (B) 100에 배수 네트워크 제어 zebrafish의 hpf. (C) 1-4 세포 단계에서 gata1a 미주리의 주입 거의 아무 trabeculation에서 보였다 75 hpf. (D) gata1a 모 zebrafish에의 주입 배수 네트워크 형성을 지연 했다. (E) gata1a 모와 인간 Nrg1 mRNA의 공동 주입 부분적으로 복원 75에서 trabeculation hpf. (F) gata1a 모와 인간 Nrg1 mRNA의 공동 주입 거의 완전히 복원 100 배수 네트워크 hpf. 100 (G) wea 돌연변이 hpf 아무 trabeculation와 부드러운 심 실 벽을 보여줍니다. (H) wea 돌연변이 제 브라에 인간 Nrg1 의 주입 부분적으로 복원 100 trabeculation hpf. (I) tnnt2a 75에서 아무 trabeculation 했다 미주리의 주입 (표시 되지 않음) 하는 hpf와 100 hpf. (J) 100에서 아무 trabeculation를 보였다 clo 돌연변이 hpf. (K) gata1a 미주리의 주입 크게 감소 Notch1, Nrg1, 및 Jag2 의 mRNA 표현 (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). Gata1a 모와 인간 Nrg1 mRNA의 공동 주입 크게 Notch1b, Nrg1, ErbB, 및 Jag1 제어에 비해 표현의 증가. (L) wea 돌연변이 했다 노치 관련 유전자의 상당히 낮은 식 (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). 인간 Nrg1 의 주입 증가 노치 관련 유전자;의 표현 Jag1 및 Jag2 컨트롤 보다 훨씬 더 높은 했다. (M) tnnt2a 모 주입 및 clo 돌연변이 보여 상당히 낮은 표현의 노치 관련 유전자 (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). 스케일 바: 50 μ m. 데이터는 평균 표준 편차로 표시 됩니다. 이 그림은 리 외17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 조작에 WSS 증가 Tg(cmlc:gfp) 노치 ligand, 수용 체 및 대상 유전자 발현과 제 브라 vivo에서 . EPO(A) 의 주입 또는 심장 박동 증가 통해 ISO (B) 의 추가-표현의 조 통해 WSS 증가 trabeculation를 증가 하지 않았다 하 고 배수 네트워크 컨트롤의 저것과 유사 했다. (C) EPO mRNA 또는 Isoproterenol 주입 노치 ligand, 수용 체 또는 대상 유전자의 표정 변화 하지 않았다 (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). 이 그림은 리 외17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 진동 또는 타악기 전단 응력에 따라 내 피 세포 생체 외에서 . 평균 τ의 타악기 전단 응력에 따라 HAECs 30 x 10-5 1에서 n = upregulated 노치 관련 유전자 표현과 노치 관련 유전자 표현의 downregulated ADAM10 억제제 적용 했다 (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). 이 그림은 리 외17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 소수 단축 및 방출 분 율의 trabeculation의 효과. (A-C) AG1478 및 gata1a 모 추가 크게 감소 100 소수 단축 hpf, 하지만 인간의 Nrg1 및 gata1a 모 공동 주입 그것을 개선. (D) gata1a 주입 및 AG1478 크게 감소 100 소수 단축 hpf (t-검정, * P < 0.05, n = 5 대 제어). Gata1a 및 Nrg1 mRNA의 공동 주입 부분 단축 개선. (E-F) AG1478 및 gata1a 모 75에서 끝 심장 수축과 심장 확장 볼륨을 증가 했다 하는 것을 보여주었다 LSFM와 4 차원 동기화 알고리즘을 통합 hpf (E) 및 100 hpf (F). 데이터는 평균 표준 편차로 표시 됩니다. 이 그림은 리 외17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Zebrafish 심사에 사용 한 표 3: 뇌관

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