신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

인간의 신장 질환을 모방 murine 모델의 사용은 점점 일반적 되고있다. 이러한 murine 모델 포함 자발적인 모델을 자연스럽 게 고혈압 쥐 (SHR)¹, streptozotocin (STZ)-당뇨병 쥐와 쥐², 유도 및 db/db 타입 II 당뇨병 쥐³와 같은 유전자 조작된 모델 기본 podocyte 특정 초점 단편 사 경화 증 (FSGS) 모델⁴, podocyte 특정 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF-A) 노크 아웃 (VEGF-A 코) 모델⁵, 그리고 Alport 증후군⁶, 모델 인수 5/6 신⁷ 과⁸의 일방적인 ureteral 방해 (UUO) 모델 등 모델. 이러한 모델에서 사 기능의 다양 한 측면을 평가, 몇 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 이 방법은 종이의 목적은 완전히 평가 사 기능 신장 질환의 마우스 모델에서 수행 해야 하는 포괄적인 작업 최대 보여.

이 메서드를 사용 하 여 뒤에 근거는 그것 완전히 여러 측면에서 평가 하 사 형 수 있습니다. 이 평가 사 침투성, 단백질, 물, 사 구조 이상, 그리고 식/mRNAs 및 단백질 정상 사 기능에 대 한 필수의 접합에 변화를 포함 한다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있다. 이것은 이러한 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요한은 질병의 메커니즘에 대 한 중요 한 정보 이다.입니다.

문학, 그것은 사 질병 표현 형의 소변에서 알 부 민 증가 수준에 의해 결정 됩니다의 마우스 모델을 제시 하는 일반적인 발생. 그러나, 증거가 제안 사 기능을 결정 하는 하나의 방법을 하지 항상 효과; 총 신장 기능, 그리고 개별 glomeruli의 정보를 제공 합니다만 요 알 부 민 배설 속도 또는 오 줌 알 부 민 크 비율 (uACR)를 측정. 이전 연구 침투성 다른 glomeruli 같은 신장^5,,910에서에서 변화할 수 있다 설명 했다. 또한, 개별 glomeruli의 침투성의 평가 평가 사 기능;의 더 민감한 방법 개별 사 물 침투성 측정 기술 (L_pA / V_나) uACR⁹측정 보다 사 기능에서 변화에 더 민감한 것으로 나타났습니다. 이 분석 결과 저항 proteinuria c57BL/6 배경¹¹등을 마우스 모델에서 유용 합니다. 현재 방법 종이의 장점은 그것은 알 부 민을 총 신장 침투성 뿐만 아니라 개별 사 침투성 물 검사.

사 구조적 이상이의 검사는 종종 얼룩 등 정기 산 Schiff (PA), trichrome, 그리고 실버 얼룩의 배터리에 의해 평가 됩니다. 이러한 점수 매기기 방법을 통해 신장 질병의 수준을 평가 하는 훈련된 신장 병리학 자 가능 모든 좋은 방법, 사 매크로 구조에 변화에 항상 나타나지 않으면 비록 급성 신장 손상 모델¹². 이 메서드는 실행 위에서 설명한 신장 조직학 기술, 뿐만 아니라 사 울트라 구조 또한 평가 되어야 합니다 전자 현미경 (EM)를 통해 제시 한다. 얼룩진된 glomerulus 상대적으로 일반 조명 현미경; 정상 볼 수 있습니다. 그러나, EM, 작은 변화, 사 지하실 멤브레인 (GBM) 폭에서과 평가 시 podocyte 발 과정 겸, 내 피 fenestrations, 그리고 하위-podocyte 공간 범위 분석 이다. 따라서, 사 울트라-구조와 마이크로 구조 사 역의 메커니즘을 확인 평가 생명 이다.

평가 사 구조 이상, 뿐만 아니라 사 질병의 메커니즘을 더 명료 하 mRNA와 단백질 표정 및 접합로 단백질 활성화 (예를 들어, 인 산화), 변화를 시험 한다. 사 병을 볼 때 또는, 예를 들어, 코/오버-expressing 유전자는 podocyte 전용 VEGF-A 코 마우스⁵, 같이 사 셀에 특히 중요 하다 단백질 mRNA의 변화만 내 검사는 사 세포, 그리고 전체 신장 하지입니다. 이 프로토콜 있는 glomeruli 마우스 신장 피 질에서 격리 되며 다음 단백질/RNA 격리 하는 방법을 설명 합니다. 이 질병 모델의 glomeruli 단백질/mRNA dysregulation의 특정 분석을 수 있습니다.

이 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에서 실행 되어야 하는 최대-전체 신장 작업에 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

모든 실험은 영국 입법 및 지역 윤리 위원회 승인에 따라 실시 했다. 동물 연구는 연구 윤리 위원회는 브리스톨의 대학에 의해 승인 되었다.

1. 오 줌 알 부 민 크 비율 (uACR)

참고: uACR는 알 부 민을 GFB의 침투성을 평가 하기 위해 사용 됩니다. 소변에서 알 부 민의 존재는 크 소변 유량 변화에 대 한 제어를 정규화 GFB 걸쳐 증가 침투성을 나타냅니다. 단백뇨는 만성 신장 질환에 대 한 일반적인 마커.

1. 실험적인 끝점까지 실험 초기에 고 (일단 일단 월간에 주간) 정기적으로 소변을 수집 합니다.
2. 물과 농축 다이어트와 마우스 대사 케이지를 설정 합니다. 조용한 방에 6 h에 대 한 개별 장에 마우스 (남성, 세 6-8 주)를 배치 합니다.
3. 빈 연습장에서 일반 주택 및 수집 소변 반환 쥐 50 µ L의 최소가 필요 합니다.
   참고: 경우 마우스는 주어진된 시간에 소변을 생성 하지 않는, 따뜻한 방에 또 다른 날에 반복 합니다.
4. 원심 500 x g 10 분 수집에서 소변 소변 그리고 podocyte 손실을 평가 하기 위해 토사를 유지 합니다. 이 시점에서 짧은 기간에-20 ° C에서 소변을 저장 합니다.
5. 1 버퍼링 x Tris 염 분 (TBS pH 7.5)에 단백뇨의 정도 따라 1:10000 희석을 1: 500에에서 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)로 소변을 희석.
   참고: 최종 볼륨 이어야 한다 > 400 µ L. 각 시간에 바로 희석을 결정 하는 최적화 포인트.
6. 요 알 부 민 농도 마우스 알 부 민 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 당 제조업체의 지침을 사용 하 여 계량.
   1. 간단히, ELISA 격판덮개, 실 온에서 1 h에 대 한 반대로 마우스 알 부 민 주 항 (0.5 M 탄산-중 탄산염 ph 9.6 10 µ g/mL)의 100 µ L 단백질 바인딩을 최적화 코트.
   2. 5 번 1 x TBS 플러스 0.05%와 우물에서 워시 초과 항 체 트윈 (pH 8.0), 솔루션 (1 x TBS 1% BSA ph 8.0) 실 온에서 하룻밤 차단의 200 µ L을 추가 하 고.
7. 세척 접시 5 번 하 고 기준의 100 µ L를 추가 (직렬 희석: 15.63 µ g/ml 1 %BSA, pH 8.0와 1 x TBS에서 2000 µ g/mL), 공백, 그리고 3 중에 희석된 샘플. 실 온에서 1 h 동안 둡니다 다음 세척 접시 5 번.
   1. 각 잘 (1 %BSA, pH 8.0와 1xTBS에서 10 ng/mL)에 HRP 탐지 항 체의 100 µ L을 추가 하 고 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
   2. 세척 접시 5 번 하 고 각 우물에 효소 기판 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 15 분에 대 한 개발 및 0.18 M 황산의 100 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 어둠 속에서 접시를 두고 (H₂이렇게₄).
      주의: H₂₄ 부식성 이므로.
8. 450의 흡 광도에서 접시를 읽어서 각 샘플의 알 부 민 농도 결정 nm. 표준 곡선을 사용 하 여 각 샘플에 있는 알 부 민을 계량. 기술 반복 CV 값 5% 보다 큰 경우, 그 샘플에 대 한 분석 결과 반복 합니다.
9. 또는 전기 이동 법을 사용 하 여 오 줌 알 부 민 농도 평가 합니다. 15 µ L의 소변에 단백질 샘플 로딩 버퍼 x 4의 5 µ L를 추가 합니다. 샘플 10 분 동안 95 ° C에가 열 하 고 4-12% 트리 스 캐스트 젤으로 로드 합니다.
   1. 100 V와 제조 업체의 프로토콜 당 Coomassie 파란에서 얼룩 하룻밤에 젤을 실행 합니다.
   2. 젤 이미징, 후 densitometry 사용 하 여 컨트롤에 상대적인 배 변경 알 부 민 농도 평가.
      참고: 아무 밴드는 예상 하는 경우 알 부 민에 대 한 경우, 소변의 단백질 농도 평가 하 고 젤에 추가 하는 소변의 볼륨을 조정 합니다.
10. DH₂O 1:1, 1:5, 1시 10분에서에서 원시 소변 샘플을 희석.
    참고: 최종 볼륨 이어야 한다 > 70 µ L. 각 샘플의 오른쪽 희석을 결정 하는 최적화.
11. 요 크 농도 키트 지침 당 화학 분석 결과 사용 하 여 계량. 간단히, 3 중에서 96 잘 접시에 크 표준, 공백, 또는 희석 소변의 20 µ L 로드.
12. 490의 흡 광도에서 접시를 읽어서 각 샘플의 크 농도 결정 nm 전과 산 성 솔루션을 추가 후 (주의 부식성; 피부에 접촉 하지 않도록).
    참고: 흡 광도 값 사이의 차이 각 샘플에 있는 크 농도에 직접 비례. 표준 곡선에서 기준 세대입니다. 기술 반복 CV 값 5% 보다 큰 경우, 그 샘플에 대 한 분석 결과 반복 합니다.
13. UACR (µ g/mg)을 생성 합니다. 데이터를 그래픽 표현에 대 한 각 마우스의 기준 값을 정상화.

2. 조직 및 혈액 컬렉션

참고: 사 조직과 신장 신장 질병의 구조, 단백질, 및 mRNA 식 마커를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 혈액 마커 크는 glomeruli의 여과 용량에 있는 감소를 나타내는, 신 장병에 최대 통제 될 수 있는 등 신장 기능을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

1. 다음과 같은 솔루션을 준비: 0.1 M 나트륨 cacodylate (pH 7.3), 4 %paraformaldehyde 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), 포유류 벨의 솔루션 (115 m m 염화 나트륨 (NaCl), 10 m m 나트륨 아세테이트 (채널₃COONa), 1.2 x 1에서에 신선한 2.5%도 m m 인산 나트륨 (Na₂HPO₄), 25 m M 탄산 (NaHCO₃), 1.2 m m 황산 마그네슘 (MgSO₄), 1 m m 칼슘 염화 물 (CaCl₂), 5.5 m m D (+) 포도 당, pH 7.4) 1 %BSA 1 x PBS.
   주의: 2.5%도: 독성, 감광, 자극; 연기 캐비닛에 사용 합니다. 0.1 M 나트륨 cacodylate: 독성, 연기 캐비닛에 사용. 4 %PFA: 정착 액, 연기 캐비닛에 사용
2. 다음 재료 준비: isoflurane, 작은 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)-혈액 튜브, 23-25 G 바늘, 5 mL EDTA 코팅 주사기, 10 mL 유리 튜브, 10 mL 플라스틱 튜브, 0.5 mL 플라스틱 튜브, 일회용 티슈 형, 드라이 아이스, 액체 N _{코팅 2}, 마우스 수술 도구, 그리고 최적의 절단 매체 (10 월).
3. 깊은 마 취 비 isoflurane 챔버, 또는 터미널 마 취 등 마 취 에이전트 (pentobarbital, 50 mg/kg의 해당 경로 사용 하 여 발 패드에 바늘 찌 르 기에 반응 하는 마우스를 통해 확인 되는 마우스 복 [IP]; avertin, 240 mg/kg IP), 또는 이산화탄소 (CO₂) 노출 (75% CO₂/25% O₂).
4. 좌 심 실에 심장 빵 꾸를 통해 마우스를 추려 고 가능한 많은 혈액을 수집 합니다. 최대 4 h EDTA 코팅 혈액 튜브에 전송. 선호 하는 경우 경 정 맥 파열를 하지 않도록 주의 쥐 경부 전위 통해 잡아가고 있습니다.
5. 복 부와 얼음 감기 1 x PBS에 세척을 통해 신장 밖으로 해 부.
6. 대뇌 피 질의 glomeruli 검사, 신장 피 질에의 한 극을 제거 하 고 1 m m³ 조각으로 잘라. 깊은 juxta 골 수 glomeruli 검사 하려면 조직에서 모 수와 동일한 기술을 반복 합니다. 유리 안에 유리병에 2.5%도 솔루션의 5 mL에 놓습니다. 4 ° c.에 게
   주의: 2.5%도 솔루션: 독성, 감광, 자극; 연기 캐비닛에 사용
   참고: 최상의 결과 위해 1 개월 이내에 처리 합니다.
7. 조직학, 24 h. 70%의 5 mL에 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 5 mL에 신장 외피 및 juxta 골 수 glomeruli 있을 것입니다, 있도록 수정의 상단 세번째 제거 EtOH 파라핀에 포함 하기 전에 24 시간 동안.
   주의: 4 %PFA: 정착 액, 연기 캐비닛에 사용
8. 면역 형광 검사, 신장 피 질과 골 수 glomeruli 조직 형 및 10 월에 외 투에 존재 될 제 3 장소에 동결 하 고-80 ° c.에 저장 드라이 아이스
9. 단백질 및 RNA, 신장 피 질 0.5 mL 플라스틱 튜브와 스냅의 장소 3 x 2 mm³ 조각 액체 N₂에 고정합니다. -80 ° c.에 게 RNA에 대 한 장기 조직의 스토리지, 조직 RNA 안정화 솔루션의 5 볼륨에 배치 하 고-80 ° c.에 저장
10. Glomeruli의 격리, 나머지 신장 조직을 슬라이스와 얼음에 1 %BSA 포유류 벨의 솔루션의 5 mL에. 즉시 glomeruli 체를 준비 합니다.

3. 플라즈마 크

참고: 플라즈마 크는 glomeruli의 여과 용량에 있는 감소를 나타내는, 신 장병에 최대 통제 될 수 있습니다. 프로토콜 여기 설명 하지는 않지만, 혈액 우 레 아 질소 (롤빵) 수준 또한 평가 될 수 있습니다.

1. 4 ° c.에 15 분 동안 500 x g에서 혈액 샘플을 원심
2. 짧은 기간에-20 ° C에이 시점에서 저장 될 수 있는 플라즈마를 수집 합니다.
3. 플라즈마 크 농도 프로토콜 1.11에에서 요 크에 대 한 위의 지침 당 화학 크 분석 결과 사용 하 여 계량.
4. 490의 흡 광도에서 접시를 읽어서 각 샘플의 크 농도 결정 전과 산 성 솔루션을 추가 후 nm.
   참고: 이러한 흡 광도 값 사이의 차이 각 샘플에 있는 크 농도에 직접 비례. 표준 곡선에서 기준 세대입니다. 기술 반복 CV 값 5% 보다 큰 경우, 그 샘플에 대 한 분석 결과 반복 합니다.

4입니다. Glomeruli 격리

참고: Glomeruli 개별 glomeruli 비보 전,의 침투성 뿐만 아니라 특정 단백질의 표현과 사 병의 mRNA 마커를 평가 하기 위해 고립 될 수 있다.

1. 신장 조직 1 %BSA 포유류 벨의 솔루션에 배치 하 고 glomeruli 기법¹³체질 표준을 사용 하 여 해 부. 간단히, 스택 70 µ m (아래), 100 µ m, 125 µ m, 175 µ m, 250 µ m, 고 유리 비 커에 425 µ m (최고) 체.
2. 매 시 신장, 425 µ m로 주사기 플런저를 사용 하 여 체 1 %BSA 얼음 차가운 포유류 벨의 솔루션을 사용 하 여이 겨. 신장의 비트를 통해 올려집니다, 상위 체를 제거 하 고 같은 일을 진행. 만 100까지 반복 µ m 및 70 µ m 체 남아 있다.
3. 전송 100 µ m 및 70 µ m에 의해 유지 하는 사 베스트 10 mL의 얼음에 1 %BSA 신선한 포유류 벨의 솔루션을 체.
   참고: glomeruli mL 벨의 솔루션 당 수가 몇 경우는 glomeruli 마지막 두 체에서 수집 하는 데 사용 하는 벨의 솔루션의 볼륨을 줄일 수 있습니다.
4. 두 개의 별도 튜브 (각 2.5 mL) glomeruli 및 4 ° c.에서 10 분 1000 x g에서 원심 분리기를 포함 하는 솔루션의 5 mL을 제거 상쾌한을 제거 하 고 스냅 단백질 및 RNA 추출 나중에-80 ° C에서 저장 하기 전에 액체 N₂ glomeruli 동결.
5. 장소 glomeruli 사 L_pA의 측정에 대 한 37 ° C에서 물 욕조에 포함 된 나머지 솔루션 / V_나비보 전. 신장 제거 3 h 이내 완료 합니다.

5. 사 물 침투성 (L_pA / V_나)

참고: 사 L_pA / V_나 분석 결과 ex vivo 측정이 가능 개별 glomeruli의 침투성의 빠른 재현 하는 방식으로. 증가는 사 L_pA / V_나 는 신장 질병의 암시는 GFB의 나타냅니다.

1. 설정 사 L_pA / V_나 장비 연어 외¹⁰에 설명 된 대로. 설정의 자세한 다이어그램 그림 1 을 참조 하십시오.
2. 다음과 같은 솔루션을 준비: 1 %BSA (pH 7.4)와 포유류 벨의 솔루션 및 8 %BSA (pH 7.4)와 포유류 벨의 솔루션. 37 ° c 둘 다 따뜻한
3. Micropipettes 유리 모 세관 튜브에서 당겨 (광학 밀도: 1.2 m m). 5-8 µ m 조리개 팁 현미경 micropipette 절단 하 여 생성 합니다.
4. 사 L_pA를 사용 하 여 / V_나 보 먼의 캡슐 및 흡입을 사용 하 여 micropipette에 관 파편은 그대로 개별 glomeruli 잡으려고 장비. Oncometric 분석 결과의 자세한 요약 연어 외¹⁰에서 발견 된다. 간단히는 glomerulus 잡은 흡입 micropipette에 일단 현미경 glomerulus의 비디오 녹화를 시작 합니다.
5. 첫째, 30 대 1 %BSA 벨 솔루션에서 glomerulus equilibrate s 10에 대 한 집중된 8 %BSA 벨의 솔루션에는 perifusate를 전환 하기 전에 s. 그리고 다시 1 %BSA 벨의 솔루션에는 perifusate 전환 녹음을 중지 합니다.
6. glomerulus를 멀리 세척 하 고 10-15 glomeruli 마우스 당에 대 한 과정을 반복. Perifusate 유량은 동일을 하지 빠른 확인 (10 mL/min)을 사 구조를 왜곡.
7. (V_i) 사 볼륨 정규화 사 물 침투성 (L_pA)를 계산 하기 위해 사 수축의 초기 속도 측정 합니다. 연어 외¹⁰분석에 대 한 자세한 정보를 찾을 수 있습니다.

6. 정기 산 Schiff (PA) 얼룩

참고: 사 모 세관 루프의 지하실 막과 관 상피 파스 얼룩 강조 표시 됩니다. 사 셀, mesangial 매트릭스 및 잠재력 확장, 및 잠재적인 변경 (즉, 두껍게 및 부정) GBM의의 상세한 시각화 수 있습니다.

1. 폴 리-L-리 신 코팅된 슬라이드에 5 µ m 두께 톰을 사용 하 여 파라핀 포함, PFA 고정 신장 피 질 섹션. 1 헤 확인에 대 한 37 ° C에서 건조 섹션 포함 되지 않습니다 어떤 주름 또는 구멍, 현미경 형태학을 왜곡할 수 있다.
2. 크 실 렌에서 배양 하 여 슬라이드를 deparaffinize (주의 자극; 연기 캐비닛에 사용) 3 분, 100% EtOH 3 분 각, 그리고 95%, 70% 및 50% 다음 한 번에 두 번 EtOH 3 분 각, 실 온에서 모두. 다시 슬라이드 dH₂오 수 화
3. 품 어 주기 산 성 솔루션에 슬라이드 (주의 자극; 연기 캐비닛에 사용) (1 g/dL) 5 분, 그리고 다음 린스 dH₂오의 여러 변화에 슬라이드 사용 하 여 컨테이너 100 mL dH₂O 실내 온도에.
   주의: 주기 산 솔루션: 자극; 연기 캐비닛에 사용
4. Schiff의 시 약에 슬라이드를 품 어 (Parasoaniline HCl 6 g/L, 나트륨 metabisulfite 4% HCl 0.25 mol/L에) 실 온에서 15 분. 슬라이드 실행 5 분 동안 수돗물에 씻어.
5. 3 Hematoxylin와 counterstain 실행 하는 15 분 동안 수돗물에 슬라이드를 철저 하 게 rinsing 전에 s.
   참고: 일부 최적화 되며 얼룩에 대 한 최적의 시간을 결정 하는 필요할 수 있습니다.
6. 6.2 단계에서 deparaffinization 프로토콜의 역을 사용 하 여 슬라이드를 탈수. 크 실 렌으로 마무리.
7. 공기 건조 슬라이드 그리고 크 실 렌 기반 설치 미디어와 함께 탑재.
8. 사 구조를 평가 하기 위해 400 X 확대 가벼운 현미경에 이미지. 다음 평가: 두껍게 하 고는 GBM의 부정 모 세관 루프, 거리 조직, 경화 증, 세포 확산의 축소 (내 피, podocyte, 및 mesangial, 또는 선 동적인 세포 침투 술).
   참고: 사 이상 종합 평가, 대 한 신장에 다른 병 변 평가, tubules는 같은 이어야 한다.

7. 전송 전자 현미경 (TEM)

참고: 가장 GBM, podocyte 발 프로세스, 가벼운 현미경 검사 법으로 표시 되지 않습니다 내 피 fenestrations 등 신장에 매우 구조적 이상이 시험을 수 있습니다. 이 어디 신장 손상 안 그래서 발음 (즉, 단백뇨 및 주요 구조 이상) 모델에서 중요 하다.

1. 2.5 %gluteraldehdye-고정된의 절단된 신장 고 후 1% 오스뮴 tetroxide 1 h. 워시 50 mL의 0.1 m M cacodylate 버퍼 (pH 7.3) 그리고 dH₂O의 50 mL (3 x 15 분 변경) 수정.
   주의: 2.5%도: 독성, 감광, 자극; 연기 캐비닛에 사용 합니다. 0.1 M 나트륨 cacodylate: 독성, 연기 캐비닛에 사용
2. EtOH와 디하이드레이션 및 Araldite 수 지에 포함.
3. 50-100 nm 두께에서 섹션을 잘라내어 3% (수성) uranyl 아세테이트와 레이놀즈 리드 시트르산 솔루션 얼룩.
4. 940 X에서 glomerulus의 여러 지역에 디지털 현미경, 1250 X, 그리고 6200 X 반드시 podocytes, GEnCs, GBM, 및 mesangium 확인 될 수 있다.
5. ImageJ를 사용 하 여 멀게 glomeruli 분석. 통치자와 같은 알려진된 거리의 두 점 사이의 선을 그려 각 6200 X 현미경 사진에 대 한 규모를 설정 합니다. 분석, 이동한 다음 설정 규모, 선의 길이 픽셀 단위로 표시 됩니다. 알려진된 거리에 측정 단위를 입력 합니다. 각 매개 변수 측정에 대 한 아래에 나열 된 프로토콜을 사용 합니다.
   참고:이 분석 마우스 당 약 1 일 필요합니다. 3 쥐에서 3 glomeruli에서 평균 측정을 사용 하 여 적절 한 통계적 인 힘에 대 한 있습니다.
   1. GBM를 위한 6200 X 현미경 사진에 고정된 디지털 그리드 (10 x 10)를 삽입 하 고 그리드 라인은 GBM을 교차 하는 지점에 GBM의 두께 측정 합니다. 직선 도구를 사용 하 여 내 피 세포 막에 수직인 탄젠트에 기저 podocyte 발 과정 세포 막에는 기저 내 피 세포 막에서 측정 합니다. 10 개별 측정에서 각 glomerulus에 대 한 평균 측정을 결정 합니다.
   2. 내 피 창문 내기 수 6200 X 현미경 사진에 GBM의 길이 측정 하 고 GBM의 단위 길이 당 내 피 fenestrations의 수를 계산 합니다. 받아 glomerulus 당 최소 4 현미경에서 평균.
   3. podocyte에 대 한 프로세스 폭 발, 6200 X 현미경 사진에 고정된 디지털 그리드 (10 x 10)를 삽입 합니다. 그리드 라인을 교차 하는 podocyte 발 프로세스의 너비를 측정 합니다. 발 프로세스 GBM;을 만나는 그것의 가장 넓은 부분에 폭을 측정 라인은 podocyte 기저 막의 접선에 수직인 확인 합니다. 10 개별 측정에서 각 glomerulus에 대 한 평균 측정을 결정 합니다.
   4. 슬릿 폭 podocyte, 6200 X 현미경 사진에 고정된 디지털 그리드 (10 x 10)를 삽입 합니다. 그리드 라인 크로스 podocyte 슬릿 격 막의 너비를 측정 합니다. 이것은 발 프로세스 podocyte 막 막에서에서 함께, 각 발 과정의 가장 넓은 부분에서 가장 가까운 지점 이다. 측정은 podocyte 기저 막의 접선에 수직인 확인 합니다. 10 개별 측정에서 각 glomerulus에 대 한 평균 측정을 결정 합니다.
   5. Podocyte의 수에 대 한 프로세스를 발, 6200 X 현미경 사진에 GBM의 길이 측정 하 고 GBM의 단위 길이 당 podocyte 발 프로세스의 수를 계산. 받아 glomerulus 당 최소 4 현미경에서 평균.
   6. 하위 podocyte 공간 범위에 대 한 닐 외에 자세한 방법을 참조 하십시오. ¹⁴.
6. 940 X 현미경을 사용 하 여, 눈으로 glomeruli 비정상적인 구조, 예금, 그리고 침투의 존재에 대 한 검사 합니다.

8입니다. 면역 형광이 Podocyte과 내 피에 대 한

참고: Immunostaining는 사 병에서 축소 수 내 피 모 세관 루프는 단백질 식 패턴의 시각화 수 있습니다.

1. OCT-형 단면 이전 2 시간 동안-20 ° C에서 냉동된 신장 포함 된 장소. 신장의 절단된 표면 신중 하 게 잘 방향의 조직 섹션 수 있도록 OCT 몰드의 하단에 배치 됩니다 확인 하십시오.
2. cryostat 사용 하 여, 폴 리-L-리 신에 5 µ m 두께에 섹션 조직 슬라이드 코팅.
   주: 아무 주름 또는 구멍 형태를 왜곡할 수 있다 조직 섹션에서 확인 하십시오.
3. 제거는 cryostat에서,에 따라 슬라이드 수정 4% PFA 10 분 세척에 대 한 슬라이드 dH₂o.의 100 mL 용기에서 3 x 5 분
   주의: 4 %PFA: 정착 액, 연기 캐비닛에 사용
4. 사용 하는 항 체의 양을 최소화 하기 위해 소수 펜 섹션 주위 그릴. 섹션을 건조 하지 마십시오.
5. 실 온에서 1 h에 대 한 솔루션 (3 %BSA 및 1 x PBS에 5% 정상 혈 청) 차단에 품 어.
6. 한 흡 인기와 차단 솔루션을 제거 하 고 기본 항 체 (Nephrin, podocin, 또는 PECAM-1) 희석 1: 250 (1 x PBS에 3 %BSA) 섹션을 품 어. 장소 슬라이드 4 ° C에서 습도 챔버에 하룻밤. 습 한 챔버를 사용할 수 없는 경우 가볍게 항 체-코팅 슬라이드 parafilm의 작은 스트립 장소. 섹션을 방해 하지로 다음 날을 분리할 때 주의 합니다.
7. 1 x PBS에 슬라이드 3 x 5 분을 씻어.
8. 어둠 속에서 실 온에서 2 h에 대 한 적절 한 형광 이차 항 체 희석 1:1000 (1x PBS에 3 %BSA)와 품 어.
9. 1 x PBS에 슬라이드 3 x 5 분을 씻어. DAPI 포함 된 미디어를 탑재 하는 형광으로 탑재 합니다.
10. 이미지 슬라이드는 glomeruli 볼 400 배 확대에 형광 현미경으로. 이것을 편견을 피하기 위해 눈을 멀게입니다 확인 하십시오.
11. 사 지역 및 착 색, 즉, 모 세관 루프의 수의 패턴으로 정규화 착 강도 분석 사용 ImageJ 멀게 방식에서 사 지역에 정규화.

9. 단백질 추출 및 서 부 럽

참고: 신장 질환에서 dysregulated 것으로 알려져 식 단백질을 평가 하기 위해 수 있습니다 부 럽. 예를 들어 podocin 및 nephrin 식 감소 podocyte 손실을 나타냅니다.

1. 신장 피 질과 체질된 glomeruli;에서 단백질을 추출 프로토콜은 각 동일 하 고 세포의 용 해 버퍼의 볼륨 조직 금액 조정 됩니다.
2. NP-40 세포를 추가 하기 전에 얼음에 녹여 신장/glomeruli 버퍼 (150 m m NaCl, 1 %NP-40, 50 mM Tris pH 8) 포함 하는 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제. 30에 대 한 샘플을 균질 s.
3. Vortexing 정기적으로 30 분 동안 얼음에 무 균된 샘플을 품 어.
4. 4 ° c.에 15 분 동안 10000 x g에서 샘플을 원심
5. 얼음에 신선한 튜브에 상쾌한을 제거 합니다.
   참고: 샘플 당 약 1 mg 단백질 복구를 기대 합니다.
6. 표준 4 x Laemmli 버퍼를 사용 하 여 단백질 변성 5 분 동안 95-100 ° C에 혼합물을 비등 하십시오.
7. 평가 사 세포 마커 단백질 (Nephrin, Podocin, PECAM-1, 등) 및 인 산화의 표현과 알려진/서양 (blotting를 사용 하 여 질병 모델의 신장/glomeruli에서 변경할 가상 단백질의 표현 표준 방법; 마흐무드와 양¹⁵)입니다.
   참고: 프로토콜 크기와 관심사의 단백질의 따라 달라 집니다.

10. RNA 추출 및 연쇄 반응 (PCR)

참고: mRNA 표정 분석 어떻게 유전자 유전자 발현 및 대체 접합 변화 등 신장 질환에 통제 되는지 결정 하기 위해 수 있습니다.

1. 신장 피 질이 여전히 고정 하는 동안 철저 하 게 유 봉과 박격포를 사용 하 여 페 놀 시 약 3 mL에 갈기. 사용 사 추출 물, 페 놀 시 약의 1 mL을 추가 하 고 30에 대 한 샘플을 균질 s.
   주의: TRIzol 시 약: 자극; 연기 캐비닛에 사용
2. RNA 추출 Chomczynski 및 Sacchi¹⁶에서 설명 하는 방법을 사용 하 여 수행 합니다.
   참고: 상업 RNA 추출 키트가이 메서드 대신 사용할 수 있습니다.
3. 사용할 수 있는 다양 한 방법 중 하나를 사용 하 여 얻은 RNA의 품질과 수량을 평가 합니다. RNA는이 시점에서 aliquoted 및-80 ° C에서 저장. 반복 하지 않도록 녹고 동결.
   참고:이 방법에 새로운 경우 분명 28S 고 18S ribosomal 밴드는 agarose 젤에 RNA를 실행 하 여 다음 단계로 진행 하기 전에 RNA의 품질을 확인 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 RNA의 2 ~ 5 µ g 사이 복구를 기대 합니다.
4. DNase 37 ° c.에 1 µ g RNA (RNase 무료 물으로 10 µ L 플러스 DNase의 1 µ L DNase 버퍼의 1 µ L 확인 볼륨)의 1 시간에 대 한 치료 10 분 동안 65 ° C에서 DNase 정지 솔루션의 1 µ L 반응을 중지 합니다.
5. 올리고 (dT)와 임의의 뇌관의 0.5 µ L를 추가 합니다. 10 분 동안 70 ° C에서 품 어.
6. 5 분 동안 얼음에 즉시 끄다.
7. 다음 추가 합니다. MMLV 역전사 효소 (400 U; DEPC H₂O RT-컨트롤 샘플에서에서 바꾸기), MMLV 버퍼 (1x), dNTP 믹스 (0.5 m m), 그리고 ribonuclease 억제제 (40 U); DEPC 물으로 50 µ L를 확인 합니다.
8. 1 시간 뒤에 효소를 비활성화 하려면 5 분 동안 95 ° C에서 37 ° C에서 반응 혼합 품 어.
   참고: cDNA의 높은 수익률을 생성 하기 위해 품 어 3 h 37 ° C에서.
9. 사용할 수 있는 다양 한 방법을 사용 하 여 cDNA의 품질과 수량을 평가 합니다.
10. 유전자의 mRNA 접합 표현과 패턴을 평가 하는 PCR를 사용 하 여 사 질병 모델에서 dysregulated 수 가설. 프로토콜은 관심사의 유전자에 따라 달라 집니다.

야생 타입 (WT), (VEGF-A 코), 밖으로 유도할 수 있는 podocyte 전용 VEGF A 노크와 VEGF-A 코 X Neph-VEGF165b 쥐 대사 케이지를 사용 하 여 소변 수집 (VEGF-A 코 쥐-인간의 VEGF A165b isoform에 podocytes에서 표현 하는 구성 방식)입니다. 측정 오 줌 알 부 민 크 비율의 주 0, 4, 10, 14에서 VEGF-A 코의 doxycycline 유도 후, 시 VEGF-A 코 쥐 10 주 WT littermate 컨트롤에 비해 진보적인 단백뇨를 개발. 그림 2A, 및 그림 2B에 각 마우스 값의 기준선에 정규화 된 절대 값을 볼 수 있습니다. 그러나,에서 단백뇨 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 생쥐 (그림 2)에서 관찰 되지 않는 그 VEGF A165b은 단백뇨5의 모델에서 보호입니다.

사 LpAV나 개별 glomeruli WT, VEGF-A 코, VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 신장에서 sieved에서 측정 했다. 어떻게는 glomerulus는 고 수축의 예로 그림 3A에서8 %BSA perifused 표시 하면 관찰. 이 수축 사 LpA를 결정 하는 데 사용은 / V나 각 glomerulus (그림 3B)에 대 한. VEGF A 코 쥐 했다는 크게 증가 사 LpA / V나 14 주에 WT 제어 glomeruli에 비해 VEGF 코 유도 포스트. 비록 낮은 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐, 증가 사 LpA / V나 14 주5에서 VEGF A165b-식으로 하지 못했습니다.

싶어 서 신장 피 질 부분의 VEGF-A 코의 유도 후 14 주 얼룩 VEGF-A 코 또는 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 생쥐 (그림 4A)에서 어떤 사 구조 이상 공개 하지 않았다. 그러나, 그들을 통해 사 울트라 구조 분석, 시 VEGF-A 코 쥐 했다 증가 GBM 폭을 개발, 내 피 fenestrae의 수를 감소, SPS 범위 감소 및 평균 podocyte 슬릿 폭을 증가 (그림 4C-4 층 ). 평균 podocyte 피트 폭 및 슬릿 변하지 않게 남아 있었다 (그림 3B 및 3 세대)의 수를 처리합니다. -표현의 VEGF-A 코 쥐에서 VEGF A165b는 GBM을 변화를 방해 하 고 슬릿 폭 (그림 4C 와 4 층). 그러나, A VEGF165b이 했다 변경 된 fenestrae 수와 SPS 범위 (그림 4D 및 4E)5에 영향을 주지 않습니다.

RT-PCR 체질된 glomeruli에서 추출한 RNA에 수행 이라고 밝혔다 인간의 VEGF A165b mRNA만 (그림 5A) VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐에. VEGF A165b ( -식에 의해 방지 되었다 VEGF-A 코 생쥐에서 감소 VEGFR-2의 사 단백질 표정 발견 체질된 glomeruli 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 통해 단백질의 수준을 평가 하 고에서 단백질을 추출 하는 경우 그림 5B 와 5 C)5.

그림 1입니다. 사 침투성 (LpA) 장비의 도식 설정. (A)는 glomerulus 적발 (B) 흡입을 사용 하 여 홀더 내 micropipette에 안정성에 대 한 마운트에 고정 됩니다. (C) 사각형 microslide입니다. (D) 4 X 비디오 카메라와 현미경의 목적. (E) 37 ° c 1 %BSA 솔루션 따뜻하게 ((F)) 8 %BSA 솔루션 37 ° c 예 열 (G) 원격 탭 베어링 두 포함 하는 perifusate 라인 빠른 perifusate 교류를 허용 합니다. (H) 다음은 glomerulus 목욕 microslide로 perifusate의 경로입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 요 알 부 민 크 비율입니다. (A) uACR 값 0, 4, 10, 및 14 주 WT, VEGF-A 코와 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 쥐에서 VEGF-A 코의 유도 후에. (B) 같은 uACR 값을 기준 값 (주 0) 각 개별 마우스의 정규화. uACR 주 10와 14 WT littermate 컨트롤에 비해 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐에 방해 했다 VEGF-A 코 쥐에 크게 증가 (* p < 0.05; 양방향 ANOVA, 쌍; 사이의 비교에 대 한 보정 n = 4-12 시간 포인트; 당 쥐 오차 막대: [SEM] 의미의 표준 오류). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3입니다. 사 물 침투성의 측정입니다. (A) 는 glomerulus 흡입; 통해 micropipette에 잡힌 perifusate 1 %BSA (Ai)에서 8 %BSA (좋아), 전환 그리고 사 수 축을 관찰. (B) 측정 전후에 8 %BSA 스위치를 사용 하 결정 사 LpA / V나. (C) 마우스 VEGF-A 코 개발 한 증가 사 LpA / V나 14 주에 포스트 VEGF-A WT 컨트롤에 비해 코의 유도. 이것은 크게 막을 수 없습니다 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐에 있는 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 4-9 마우스, 15-30 glomeruli; 오차 막대: sem의). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4입니다. 사 구조 분석입니다. (A) 파 신장 피 얼룩 WT, VEGF-A 코와 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 쥐 (Ai-iii)에서 glomeruli에 어떤 구조적 이상이 표시 하지 않았다. EM은 VEGF-A 코 glomeruli (Aiv-vi)에 매우 구조적 이상이 나타났다. (B) 평균 FPW 그룹 사이 변화 하지 않았다. (C)는 GBM 증가 VEGF-A 코 glomeruli는 VEGF A165b. fenestrae 수 VEGF-A 코 glomeruli, VEGF A165b. (E)는 SPS 보도 의해 불변에 남아 있었다 감소 되었다 (D) 에 의해 방지 되었다 이었다 VEGF-A 코 glomeruli, 또한 VEGF A165b. 슬릿 폭 평균 VEGF-A 코 glomeruli에 증가 되었다 (F) 불변에 남아 있었다에서 감소는 VEGF A165b. (G) 슬릿 수에 의해 방지 되었다 아니었다 변경 3 개 그룹 사이 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 3 마우스, 9 glomeruli; 오차 막대: sem의). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5. 마커의 mRNA와 단백질 표정. (A) RT-PCR 인간의 VEGF A165b mRNA 표현 했다 VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐에서 체질된 glomeruli 분명만 보였다. (B) 서 부 럽 표시는 VEGFR-2 단백질 표정 VEGF-A 코 glomeruli 아래로 통제 되는 VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b glomeruli에서 방지 되었다 (* p < 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 3-6 쥐; 오차 막대: sem의). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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