단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

요약

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

초록

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 단일 셀 검색 하 고 개별 RNA 분자를 계산 하는 능력 때문에 유전자 발현을 연구 하는 강력한 기술입니다. 깊은 시퀀싱 기반 방법 보완, smFISH 사본에 셀 변화와 특정된 RNA의 subcellular 지 방화에 대 한 정보를 제공합니다. 최근, 우리 사용 smFISH 신진 효 모 감수 분열 동안 NDC80 유전자의 표현 연구, 어느 두 기록에서 isoforms 존재 하 고 짧은 사본 isoform는 긴 isoform와 공유의 전체 시퀀스. 각 사본 isoform를 자신 있게 식별 하려면 우리는 알려진된 smFISH 프로토콜을 최적화 하 고 높은 일관성과 신진 동안 샘플에 대 한 smFISH 데이터의 품질을 얻은 감수 분열 효 모. 여기, 우리는이 최적화 된 프로토콜, 우리 smFISH 데이터의 고품질 얻을 여부 및 다른 효 모 종자와 성장 조건에서이 프로토콜을 구현 하기 위한 몇 가지 팁을 확인 하는 데 사용할 조건을 설명 합니다.

서론

유전자 발현의 동적 규칙 물질 대사에 유기 체, 환경 스트레스, 감염, 그리고 변화에 응답의 개발 드라이브. RNA 풍부를 측정 하는 기술에 의존 하는 transcriptional 규칙에 집중 하는 연구. 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH), 불리 한 그러한 방법, 단일 셀^1,2개별 RNA 분자의 탐지를 위해 사용 됩니다. 이 메서드는 셀 유전자 발현의 측정 및 세포내 RNA 지역화의 결정을 수 있습니다.

가장 일반적으로 사용된 smFISH 기술, 개별 RNA 분자의 탐지 여러 짧은 DNA 프로브를 (종종 ~ 48 20-메 르 프로브) 대상 RNA 보완 하 고 같은 형광 염료를 활용 합니다. 약한 신호 귀착되는 단일 형광 프로브의 바인딩 하지만 모든 프로브의 앙상블에서 신호는 강력한. 이 기능은 크게 단일 프로브 오프 대상 바인딩 전시 수 있습니다, 비록 이러한 신호는 될 것으로 예상 매우 약한 대상 RNA 분자³의 비교 때문에 신호 대 잡음 비율을 향상 시킵니다. 오류 검출, 내 RNA 분자의 수는 계산 고 다양 한 성장 조건 및 다른 뮤턴트 들을 비교 될 수 있습니다.

첫 번째 개발, 이후 smFISH 맞게 조정 되었습니다 유전자 식⁴, 녹음 방송 신장^1,2,^5,6,⁷ 을 파열 transcriptional 접합 등의 다양 한 측면을 연구 하 ^{, 8 , 9}, 세포내 유전자 식^10,11,12, 그리고 RNA 지역화^13,,1415. 최근에, 우리는이 방법을 사용 하는 동일한 유전자의 두 사본 isoforms의 표정을 연구 하 짧은 사본 isoform (NDC80^ORF) 긴 isoform (NDC80^luti 와 공유의 전체 순서는 )¹⁶. 두 개의 mRNA isoforms를 고유 하 게 식별 하려면 사용 하는 두 개의 프로브 세트: 1 세트 NDC80^luti의 독특한 시퀀스에 특정 이며 다른 설정, 다른 형광 성 염료에 활용 된 두 개의 isoforms의 공통 영역에 바인딩합니다. NDC80^luti RNA로 식별 됩니다 colocalized 자리 두 형광 신호, 반면에 NDC80^ORF RNA만 일반적인 프로브 세트에서 신호를 포함 하는. 수 이후는 NDC80^ORF 성적 조사 교 잡의 높은 효율성과 높은 신호 대 잡음 비율은 자신 있게 smFISH 관광 명소를 식별 하 고 오류를 감소 하는 데 필요한 "빼기" 방법에 의해 계산 번 식입니다.

이 문서는 싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 smFISH를 수행 하기 위한 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜, 휴대폰 번호, 고정 시간, 소화, 소화 버퍼, 프로브 농도, 시간과 교 잡에서 버퍼 smFISH 실험을 위해 사용 했다 SK1 긴장의 배경 S. cerevisiae 겪고 식물에 대 한 최적화 된 성장 또는 감수 분열입니다. 그러나, 우리는 또한이 원고에 참고: (1) 이미지 수집, 및 (2) 다른 스트레인 배경 및 성장 조건에 대 한 추가적인 최적화 필요할 수 있는 프로토콜의 단계 후 smFISH 데이터의 품질을 확인 하는 메서드.

프로토콜

참고: 모든 버퍼와이 프로토콜에 사용 된 미디어는 표 1에 나열 됩니다. 시 약에 대 한 공급 업체 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.

일 1/1-2 일:

참고: 식물 문화에 대 한 OD₆₀₀ 0.4에 0.6 선호 매체에서의 세포를 성장 한다. Meiotic 문화에 대 한 셀 (일반적으로 1.85의 OD₆₀₀ 에 경작) 기본 메서드를 사용 하 여 감수 분열을 유도.

1. 샘플 고정 및 소화

1. 3% 포름알데히드에 셀의 ~3.5 OD₆₀₀ 의 총 수정.
   1. 식물 문화에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 37% 포름알데히드의 480 µ L를 문화의 5.52 mL를 추가 합니다.
   2. Meiotic 문화, 문화의 1840 µ L 2 mL microcentrifuge 튜브에 37% 포름알데히드의 160 µ L를 추가 합니다. 하 ~ 5 번 반전 혼합.
      주의: 포름알데히드는 독성이 있다. 처리 하 고 기관 규정에 따라 처분.
2. 20 분 동안 실내 온도에 롤러 드럼에 튜브를 놓습니다. Meiotic 샘플, 20 분 동안 실내 온도에 고정 후 하룻밤 4 ˚C에서 수정 계속, 회전.
   참고: 야간 고정 meiotic 샘플 획득 smFISH 데이터의 품질과 재현성을 증가 시킵니다. 고정 시간을 최적화 합니다.
3. 샘플을 수정 하는 동안 200mm Vanadyl Ribonucleoside 복합물 (VRC) 적어도 10 분 동안 65 ˚C에서 해 동.
4. 15 mL 튜브에 소화 마스터 믹스 준비: 버퍼 b 425 µ L 200 mm (65 ˚C 하 예 열); VRC 40 µ L 믹스 1 샘플 5 샘플에 대 한 버퍼 B의 2125 µ L 200 m (65 ˚C 하 예 열) VRC m의 200 µ L 믹스. 완전히 밝은 갈색 녹색 VRC 추가 후 표시 됩니다 마스터 믹스에 추가 하기 전에 VRC resuspend을 소용돌이 ~ 5 s.
   참고: 추가 VRC 소화 하는 동안 향상 됩니다 smFISH 결과의 일관성 잠재적으로 원유 추출에서 순화 zymolyase 혼합물에 의해 도입 된 nuclease 오염 억제. 이 단계에서 필요한 VRC 양의 최적화 되어야 합니다.
5. 식물 샘플에 대 일 분 ~ 1057 x g에서 튜브 원심. (후에 야간 고정) meiotic 샘플, 1.5 분 Decant 21000 x g에서 원심 또는 포름알데히드 폐기물 상쾌한 발음.
   참고: 모든 원심 분리 단계는 상 온에서 수행 됩니다.
6. 아래로 pipetting 또는 튜브를 거꾸로 하 고 혼합 flicking 셀 1.5 mL 찬 버퍼 b에 resuspend. 물의 resuspension 후 2 mL 튜브에 식물 샘플을 전송.
7. 1.5 분에 대 한 21000 x g에서 원심 분리기는 액체의 대량 진공 포부에 의해 여 제거할 pipetting, ~ 100 µ L를 남겨두고.
8. 1.5 mL 찬 버퍼 b에 셀 resuspend
9. 1.5 분에 대 한 21000 x g에서 원심 분리기는 액체의 대량 진공 포부에 의해 여 제거할 pipetting, ~ 100 µ L를 남겨두고.
10. Resuspend 셀 1.5 분 Aspirate에 대 한 21000 x g에서 차가운 버퍼 B. 분리기의 1.5 mL에 완전히 진공 또는 pipetting 액체.
11. 소화 마스터 믹스, 그리고 짧게 resuspend를 소용돌이의 425 µ L 셀 resuspend 각 튜브를 100T 10 mg/mL zymolyase의 5 µ L를 추가 합니다.
    참고: 소용돌이 관에 추가 하기 전에 때마다 zymolyase Zymolyase 각 튜브를 개별적으로 추가할 마스터 믹스에 추가 하는 대신. 두 단계 zymolyase 신속 하 게 침전 물 때문에 튜브 중 소화 일관성을 유지 도움이.
12. 믹스와 2-3 동 s입니다. 롤러 드럼에 튜브를 놓고 30 ˚C 15-30 분에 소화 합니다. 식물 세포와 초기 meiotic 단계, 보통 ~ 15 분 걸립니다 그리고 meiotic 의향 및 meiotic 사단, 보통 ~ 30 분 걸립니다.
    참고: 15 분 후 현미경에 매 5 분을 확인 하 고 세포의 ~ 80% 비-투명 하 고 비 굴절 나타나면 소화를 중지. 가이 시점에서 세포는 매우 깨지기 쉬운. 셀을 부드럽게 처리 하 고 진공 포부 또는 vortexing를 사용 하지 마십시오.
13. 원심 ~ 376 x g 3 분 제거에서 튜브 액체 완전히 pipetting으로.
14. 부드럽게 버퍼 B의 1 mL로 세포를 1-2 번 아래로 pipetting으로 resuspend 혼합.
15. Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거 버퍼 B 액체에 튜브를 원심. 부드럽게 70% 에탄올 (RNase 무료 물과 함께 희석) 1 mL에 셀 resuspend.
16. 3.5-4 시간 동안 실 온에서 품 어.

2입니다. 교 잡

1. 실내 온도에 formamide를가지고 (50 mL 약 수에 대 한 걸리는 ~ 30 분 물 목욕에서).
   참고: 병 formamide의 산화 방지를 위해 상 온에 도달할 때까지 formamide 병을 열지 마십시오.
   주의: Formamide은 독성이 있습니다. 처리 하 고 기관 규정에 따라 처분.
2. 15 mL 원뿔 튜브에 10 %formamide 워시 버퍼를 준비 합니다.
3. Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거 500 µ L의 70% 에탄올에 튜브를 원심. 부드럽게 피펫으로 아래로 나머지 셀 resuspend를 다음 낮은 접착 튜브 셀을 전송.
   참고: 다음 세척 시 셀 손실 감소 크게 낮은 접착 튜브를 사용 하 여.
4. Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거에서 다시 튜브 모든 에탄올을 원심.
5. 추가 10 %formamide 워시 버퍼, 그리고 부드럽게 피펫으로의 1 mL를 위아래로 2-3 시간 하 셀 resuspend.
6. 하이브리드 솔루션을 준비 하는 동안 ~ 20 분 동안 실내 온도에 앉아 셀 수 있습니다. 1 샘플에 대 한 교 잡 버퍼 (임시 방)의 50 µ L, 200 mm (65 ˚C 하 예 열), VRC 5 µ L 및 각 프로브 (200 nM 최종)의 1 µ L를 혼합. 5 샘플에 대 한 교 잡 버퍼 (임시 방)의 250 µ L, 200 mm (65 ˚C 하 예 열), VRC 25 µ L 및 각 프로브 (200 nM 최종)의 5 µ L를 혼합.
   1. Formamide 산화를 방지 하기 위해 튜브를 열기 전에 실내 온도 (-20 ˚C에서 냉동) 교 잡 버퍼를 녹여.
   2. 200mm VRC, 프로브를 추가 하기 전에 5-10 s에 대 한 소용돌이 추가한 후에 설계 상업적으로, 구입 그리고 제조업체의 지침에 따라 재구성.
   3. 2 프로브 공동 incubated 있다면, 추가 1시 10분의 1 µ L 프로브 #1 주식으로 1시 10분의 1 µ L의 희석의 최종 희석 수 있도록 프로브 #2 주식의 희석 ~ 어느 프로브에 대 한 1: 500. 최상의 신호 대 잡음 비율 요구에 필요한 농도 최적화 (자세한 내용은 토론 참조).
7. 원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 유해 폐기물에 pipetting으로.
8. 각 튜브를 교 잡 솔루션의 적어도 50 µ L를 추가 합니다. 믹스에 튜브를 터치 합니다.
9. 어둠 속에서 적어도 16 시간 동안 롤러 드럼에 30 ˚C에서 품 어.

주 2/3 일

3. 세척 및 이미징

1. 실내 온도에 formamide를가지고.
2. 15 mL 원뿔 튜브에 10 %formamide 워시 버퍼 (FWB)를 준비 합니다.
3. 롤러 드럼에서 튜브를 제거 하 고 빛 으로부터 보호 하기 위해 호 일 커버 상자에 그들을 배치.
4. 원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 유해 폐기물에 pipetting으로.
5. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 10 %FWB 1 mL에 resuspend 번 2-3.
6. 30 분 (회전 하지) 호 적용 상자에서 30 ˚C에서 품 어.
7. 3 분 pipetting, 상쾌한 유해 폐기물을 제거에 대 한 샘플 ~ 376 x g에서 원심 고 ~ 50 µ L를 둡니다.
8. 한편, 15 mL 원뿔 튜브에 DAPI/FWB 준비: 1 샘플, 5 mg/ml DAPI 1 µ L 1000 µ L 10 %formamide 워시 버퍼의 혼합. 10 샘플, 5 mg/ml DAPI 10 µ L로 10 %formamide 워시 버퍼의 10 mL를 섞는다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 DAPI/FWB의 1 mL에 resuspend 번 2-3.
9. 30 분 (회전 하지) 호 적용 상자에서 30 ˚C에서 품 어.
10. 안티 표 백제 시 약 얼음에 녹여
11. 원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 완전히 pipetting으로. 필요한 경우, 모두는 상쾌한 제거 하려면 다시 원심.
12. 즉시 이미지는 샘플에 대 한 GLOX 버퍼 없이 효소의 50 µ L에 펠 릿을 resuspend. 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 3-4 회를 섞어.
    1. 모든 unimaged 샘플 호 적용 상자에서 4 ˚C에까지 계속 준비 이미지. 이미지를 준비, 2 분 ~ 376 x g에서 샘플 원심 고 pipetting으로 상쾌한을 완전히 제거 하는 방법. 아래와 같은 효소 GLOX에 resuspend.
13. 샘플에 대 한 즉시, 몇 군데 되 고 효소 GLOX 버퍼의 15-20 µ L을 추가 합니다. 부드럽게 피펫으로 위아래를 섞어입니다.
    참고: 볼륨 추가 셀 펠 릿의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 우리 효소 GLOX 버퍼의 15 µ L에 펠 릿을 resuspending 하는 것을 권장 하 고 현미경에 셀 밀도 확인 합니다. 세포는 너무 조밀한 (세포 서로 응집), 효소 추가 GLOX 버퍼를 추가 합니다. 셀 너무 스파스 있다면, 원심 샘플 하 고 버퍼의 ~ 5 µ L을 제거 합니다.
14. 피펫으로 5 µ L coverslip (18 m m x 18 m m, 제 1 호), 그리고 넣어 슬라이드에 coverslip에.
15. 넣어 슬라이드 위에 실험실 지우기는 coverslip 배치 됩니다. 부드럽게 슬라이드 (액체는 coverslip의 모든 4 개의 가장자리에서 빼야 보아야 한다)를 설정 하는 실험실 지우기에 누릅니다.
16. 알루미늄 호 일에 의해 포함 하는 상자에 현미경을 슬라이드를 전송 합니다.
17. 이미지 와이드 필드 형광 현미경을 사용 하 여 높은 확대 (60-100 X)와 높은 수 가늠 구멍.
    참고: smFISH 프로브에 의해 방출 되는 광자의 최대 수를 수집, confocal 현미경 권장 하지 않습니다, 그들은 크게 수집 빛의 양을 제한으로. 여기, 데이터 수집 했다 100 X, 1.4 나 목표를 갖춘 현미경에 CY5 필터를 사용 하 여 (EX632/22, EM679/34) 1.3에서 몇 군데 s, 100 %T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100 %T; 그리고 DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, 32%-50 %t. 밝은 필드 참조 이미지 또한 취득 한다. 0.1-0.2의 스텝 크기와 15-25 조각 취득 µ m에서 전적으로 전적으로 위, 보기의 필드의 초점 아래 있도록 그의 모든 RNA 명소는 차지 했다.

4. 이미지 분석

1. 물고기-양의¹⁷ , StarSearch², 등 게시 된 smFISH 분석 도구 또는 실험의 정확한 요구 사항에 따라 맞춤 프로그램, smFISH 데이터를 분석 합니다.
   참고: 좋은 분석 파이프라인 진정한 RNA 명소는 배경에서 분리 하 고 X, Y 및 Z (옵션) 좌표와 각 자리, 각 셀에 관광 명소의 수의 강도 등의 통계를 출력 하는 임계값을 확인 하려면 사용자를 허용 해야 합니다. 그리고 아마도 거짓 탐지를 필터링 하는 방법으로 매개 변수를 피팅.

결과

얼마나 잘 smFISH 프로토콜 일 (에서 개요 그림 1), 우리 타일 NDC80 유전자의 열려있는 독서 프레임 54 프로브 세트 설계 평가 (그림 2A, 상단). 5' 끝 가장에 위치한 프로브 프로브 1; 이라고 합니다. 다음 중 하나, 프로브 2; 그리고 세 번째, 프로브 3 등. 27 프로브 할당 홀수 번호 (프로브 1, 3, 5...) 모든 CAL Fluor 590 (CF590) 형광 염료;를 활용 그리고 27 프로브 할당 짝수 (프로브 2, 4, 6...), 준 670 (Q670) 형광 염료를 활용. 따라서, 이러한 대체 프로브 세트는 수시로 불린다 "홀수/심지어" 조사로. 교 잡 시 두 프로브 세트 같은 사본을 레이블을 합니다.

자리 검색, 우리는 smFISH 데이터 집합의 품질을 판단 몇 가지 측정 사용. 첫 번째 학위와 홀수/심지어 프로브에 대 한 colocalization의 품질 했다. 우리의 경우에, 모든 smFISH 관광 명소의 88 %colocalized (그림 2A 와 2B), 보다 큰 어떤 반음계 제공 하는 예상 값 내는 쌍 각 (그림 2C, 쌍), 다른 2 픽셀 이내 관광 명소 및 탐지의 95%와 두 개의 형광 채널 사이의 수 차 비교 함으로써, 짝이 없는 관광 명소의 10% 미만 했다 misidentifying 자리 쌍의 확률은 낮은 것을 보여주는 2 픽셀의 가장 가까운 이웃 거리 (그림 2C). 짝이 없는 관광 명소의 12%는 두 채널 사이의 균등 하 게 분할 되었다 (그림 2B, 비교와 Q670 전용 CF590 전용); 그리고 따라서, 우리는 다양 한 셀 당 45 성적 0 사이 식이 2.4 kb 유전자에 대 한 RNA 분자의 ~ 94% 정확 하 게 검색 된 각 형광 채널에 결론. SmFISH 프로토콜 최적이 아닌 경우에, 사람은 것 관찰할 (비-colocalized), 2 개의 형광 신호 중 하나만와 smFISH 명소의 큰 분수 (1) 및 (2) 매우 낮은 신호 대 잡음 비율 또는 신호 세포 모든.

SmFISH 신호 감지 셀 당 RNA 분자의 총 수에 관하여 치우친 경우 하는 것이 게. 인구, 각 셀에 특정 RNA의 총 수는 분포에서 일부 셀을 다른 사람 들 보다 더 많은 RNA 분자를 은닉 거짓말. 좋은 smFISH 프로토콜 견고 탐지 해야 RNA에 관계 없이 높은 숫자 또는 RNA 분자의 낮은 수는 각 셀에 존재 합니다. 이 테스트 하려면, 각 셀에 대 한 우리 colocalized 신호 smFISH 관광 명소의 분수와 두 개의 형광 신호 중 하나만으로 분수 계산. 셀 당 총 관광 명소의 동일한 수를 가진 셀을 그룹화 후의 평균 분수 계산 colocalized (결합) 또는 비 colocalized CF590 전용 (Q670 전용) 명소 주어진된 그룹의 총 수의 함수로이 평균을 그래프로 그리고 (그림 3) 셀당 명소. 관광 명소의 각 범주에 대 한 분수 셀 당 관광 명소의 총 수의 전체 범위에 걸쳐 유사 했다. 예를 들어, 총 30 관광 명소의 총 대 셀당 20 형광 명소 셀 비교, colocalized 반점의 평균 분수 유사 했다. 이 결과 우리의 프로토콜 (적어도 40 분자 세포 당)까지 셀에서 범위의 RNA 분자를 감지할 수 있는 제안 했다. 프로토콜 suboptimally 경우, 사람은 바이어스를 관찰할 수 있습니다. 예를 들어 두 가지 형광 신호 중 하나만와 명소의 일부분 세포 증가 당 관광 명소의 총 수로 증가할 수 있습니다.

우리는 다른 성장 조건에서 kinetochore 단백질을 인코딩하는 NDC80 유전자의 표현 시험이 최적화 된 프로토콜을 사용 하. 두 개의 mRNA isoforms를 표현 하는 NDC80 유전자: 긴 undecoded 사본 isoform NDC80^luti, 확장명이 ~ 400 기본 쌍 짧은 비교 5' 끝에 NDC80^ORF isoform, 하지만 둘 다 성적 공유 ( 그림 4A에서회로도 참조) NDC80 유전자의 코딩 영역입니다. 우리 두 프로브 설계: NDC80^luti;의 독특한 5' 영역에는 CF 590 집합 바인딩 Q 670 세트 NDC80^luti 의 공통 영역에 바인딩합니다 및 NDC80^ORF. NDC80^luti 성적표 반면 둘 다에서 신호 colocalized, 세트를 조사 하는 smFISH 반점으로 검색 된는 NDC80^ORF 증명서 그 Q 670 에서만에서 신호 했다. NDC80^luti의 독특한 세그먼트 크기 때문에 우리만 권장된 30 ~ 48 프로브 보다 적은이 지역에 따라 20 oligonucleotide 프로브 타일 수 있습니다. 따라서, 우리는 먼저이 프로브 세트 견고 하 게 우리의 최적화 된 프로토콜에서 RNA를 감지할 수 경우 확인 했습니다. 형광 두 채널에 대 한 우리 각 smFISH 자리에 대 한 감지 된 신호에 대 한 신호 대 잡음 비율 (SNR, 자리 강도 기준으로 자리를 둘러싼 픽셀의 분산으로 정의)를 그래프로 그리고 모든 관광 명소에 대 한 scatterplot 생성 전체 보기 ( 그림 4A 에서 예를 들어 이미지) 및 그림 4B에서에서 확인. 2 명의 명료한 인구 했다 모두는 Q 670에 대 한 명확 하 게 식별 하 고 CF 590 프로브 설정 (최적화, 그림 4B), 제안 (회색 영역) 안에서 진정한 smFISH 명소 배경 신호 로부터 분리 될 수 있었다. Note 최적이 조건에서 그러한 분리는 덜 분명 (최적이, 그림 4B).

우리 NDC80^luti 표현 공부를이 두 프로브 세트를 사용 하 고 NDC80^ORF식물 성장 및 감수 분열 동안. 식물 세포에서 Q 670 프로브 세트에서 강력한 신호 감지 되었습니다 하지만 CF 590에서 프로브 설정 하지 (그림 5A, 식물), 북부 blotting에 의해 관찰 동의 짧은 isoform 식물 성장^{16 동안 표현 했다} . 이 결과 또한 CF 590 프로브 세트는 특정, 우리의 최적화 된 smFISH 프로토콜에 낮은 배경 저조한 제안 했다. 반면, 두 프로브 세트에서 강력한 신호 meiotic 의향에서 감지 하 고 관광 명소의 대부분은 신호 (그림 5A, meiotic 의향) colocalized 했다. 북부 오 점 분석 (그림 5B), 함께이 관찰 확인 긴 isoform NDC80^luti 감수 분열에서 구체적으로 표현 했다. MRNAs의 이러한 두 종류는 둘 다 핵, 리보솜 데이터¹⁸프로 파일링과 일치에서 내보낸 되었습니다 제안 (외부 DAPI 지역) 세포질에서 발견 했다.

정확 하 게 우리의 데이터 세트에 본질적인 생물학적 변형에 대 한 계정에 충분 한 데이터 수집 된 경우를 확인 하려면 (1) 셀과 (2) 당 colocalized 관광 명소의 분수를 포함 하는 각 셀의 통계를 사용 하 여 부트스트랩 분석 수행 두 가지 형광 신호 (CF 590만 및 Q 670만)의 관광 명소의 소수 부분 이 분석에서 프로그램은 500 반복 437 정량된 셀에서 무작위로 한 셀을 선택. 다음, 평균 및 이러한 500 선택 된 셀과 관련 된 해당 통계의 분산 계산 했다. 이 과정은 임의로 교체; 없이 모든 셀에서 두 개의 셀을 선택에 대 한 다음 반복 되었다 그리고 무작위로 3 셀, 등을 선택 하는 다음. 하나까지 총 데이터 집합 크기의 절반에 도달 했다. 데이터 집합에 대 한 분산 plateaued 하자이의 대부분을 가리킨 후 평균에서 편차 언더샘플링의 유물 보다는 데이터 내장 40 셀 후 (그림 6, 삽입). 이 효과 때 우리는 각 반복 주기 (그림 6)에서 세포의 수의 기능으로 표본 평균이 나눈 표본 분산을 그래프로 더 분명 한 되었다. 표시 되는 데이터 분산에서 변경이 되었다 ~ 60 셀 후 diminishingly 작은. SmFISH 실험에서 계량 하는 셀의 수 셀 안정적인 평균 및 분산의 고원 달성 하는 데 필요한 최소 수를 초과 한다. 우리의 경우, 우리는 샘플 복제 당 당 이상 95 셀 정량. (> 400 셀)의 총 수를 잘 (~ 60 셀) 모집단 평균의 반영 하는 데 필요한 최소 수를 초과 했습니다.

주문 품 Matlab 프로그램¹⁶, 식물 세포 5의 중간값을 발견 했다 NDC80^ORF 셀 당 성적표 반면 meiotic 의향 셀에 중간 크게 떨어졌다 (2 꼬리 Wilcoxon 셀당 4 성적 증명서 순위 합계 테스트, p = 0.026) (그림 7). 셀 당 NDC80^luti 성적표의 메디아 수 21 성적표, 고 100% 표현 NDC80^luti 성적표. 우리 mRNA 분자의 수는 개별 수량 때문에 단계별, 상대 주파수 히스토그램으로 지정된 된 수의 증명서에 포함 된 셀의 일부분을 그래프로. 각 히스토그램의 큰 빈 같은 높이에 정규화 되었습니다.

그림 1: smFISH 프로토콜 Flow-chart. 셀 고정 됩니다 20 분 동안 실내 온도에 또는 4 ˚C에서 포름알데히드와 하룻밤, 식물 성장 예제 및 meiotic 샘플, 각각. 씻은 후 버퍼 B에 세 번, 셀은 셀의 ~ 70%-90%는 소화 될 때까지 zymolyase에 의해 소화 됩니다. 소화 샘플 다음 버퍼 b zymolyase, 제거를 한 번 씻어 있으며 이후 ~3.5 시간 동안 70%의 에탄올 (EtOH)에서 permeabilized. 교 잡에 대 한 준비, 샘플은 먼저 알을 품을 10 %formamide 워시 버퍼 (FWB) ~ 20 분에. 다음으로, 샘플 30 ˚C에서 어둠 속에서 야간 보육에 대 한 형광 프로브를 포함 하는 교 잡 솔루션의 ~ 50 µ L에서 resuspended는. 교 잡 후 샘플을 초과 프로브 씻어 30 분 동안 10 %FWB 알을 품을 하 고 10 %FWB 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA를 얼룩에 알을 품는. FWB/DAPI 부 화 직후 몇 군데 샘플, 샘플은 카 탈 라 제, Trolox, 및 포도 당 산화 효소 (GLOX + enz); 보충 GLOX 버퍼에 resuspended 반면, 다른 샘플 효소, 없이 GLOX 버퍼에 resuspended 및 4 ˚C에 저장 된 최대 3 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 홀수/심지어 프로브를 사용 하 여 smFISH 품질의 평가. (홀수/심지어 프로브 세트 A) 위: 회로도 50-4 oligonucleotide 조사 기와 NDC80 유전자 설계 되었습니다. 홀수 프로브 한 fluorophore (CF590, 자홍색으로 표시), 그리고 다른 fluorophore (Q670, 녹색으로 표시)와 짝수 프로브와 함께 표시 했다. 홀수/심지어 프로브 세트를 사용 하 여 인수 의향 meiotic 세포의 하단: 대표 smFISH 이미지. 샘플 6 시간 후에 셀 (UB8144) 중간에 포자 형성, 시간 때이 세포 meiotic 의향에 체포 됐다 전송 했다 촬영 했다. DNA는 DAPI (파란색으로 표시)와 스테인드. 이미지는 z 스택의 최대 강도 예측으로 표시 됩니다. 눈금 막대: 5 µ m. 짝 또는 홀 smFISH 관광 명소의 (B) 비율 홀수/심지어 프로브 세트를 사용 하 여 얻은. 428 meiotic 의향 셀의 총, 2 개의 독립적인 실험에서 풀링 분석 되었다. 이 그림은 그림 2에서 수정-그림 보충 4 첸 외. ¹⁶ (C) A 누적 밀도 함수 (CDF) 쌍된 명소의 각 쌍과 짝이 없는 자리에의 가장 가까운 이웃 사이의 거리 사이 거리의. 한 형광 채널에서 검색 된 각 자리에 대 한 "이웃 가장 가까운 k" 알고리즘 가까운 감지 자리 식별에 적용 된-그리고 그 자리에 거리-무료 채널에서. 지역화 된 이웃 가장 가까운 상호 결합 수로 간주 됐다 고 새 목록을 짝, CF590 전용, 및 Q670 전용 탐지 기록 생성 했다. 탐지의 각 범주에 대 한 거리의 CDF 히스토그램 Matlab, 올바르게 짝된 명소 실제로 이었다고 훨씬 더 가까운 거리에 다른 채널에서 자리는 해당 하지 않고 그 보다 확인에 구성 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 짝된 짝이 없는 관광 명소, 총 RNA의 기능으로 서의 분수 셀 당 번호. 검색과 smFISH 관광 명소의 다른 식 수준에 치우친 경우를 테스트 하려면 개별 셀 총 RNA 식으로 분류 되었다. 짝, CF590 전용 및 Q670 전용 검색의 평균 분수 셀의 각 그룹에 대 한 계산 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: NDC80^luti 위한 프로브를 사용 하 여 생성 하는 smFISH 데이터의 품질 평가 NDC80^ORF mRNAs. (녹색에서 표시) Q 670 프로브 NDC80^luti 사이 공유 하는 공통 영역에 교배와 NDC80^ORF mRNAs, CF 590 프로브 (자홍색으로 표시) NDC80^luti 의 독특한 5' 영역에 교배 하는 반면 . (A) 대표 smFISH 이미지 NDC80^luti 의 및 NDC80^ORF meiotic 의향에 인수 아래 차선 조건 대 최적화. UB8144 변종 (조건 최적화) 및 UB1337 (차선 조건) 감수 분열을 유도 하 고 meiotic 의향 동안 고정 했다. 이러한 두 가지 변종 항구 유도 감수 분열, 다른 동기화 시스템만 시스템의 사용 smFISH 품질 (데이터 표시 되지 않음)에 영향을 주지 않습니다. 최적이 조건에서 세포 VRC 보충, 그리고 VRC의 낮은 농도에 때 교배 하지 않고 zymolyase와 소화 20 분 (아니 하룻밤 고정), 실내 온도에 고정 했다. 이미지는 z 스택의 최대 강도 예측으로 표시 됩니다. DNA는 DAPI (파란색으로 표시)와 스테인드. 눈금 막대: 5 µ m. 신호 대 잡음 비율 (SNR)와 보기의 필드에서 발견 자리 각 smFISH의 신호를 표시 하는 (B) Scatterplots 제시 그림 4A, 최적화 또는 차선 조건 뿐만 아니라 어느 형광 채널에 대 한. 최적화 된 상태에서 smFISH 관광 명소의 두 인구 참석 했다. 진정한 smFISH 명소 배경 신호 로부터 분리 하는 회색 지역 안에 위치 했다. 최적이 조건에서 개별 mRNAs, 눈으로 구별 하기 어려운 되었고 자리 검색 소프트웨어를 실행 한 후 진정한 관광 명소와 배경의 구분 덜 분명 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: 표현의 NDC80^luti 그리고 NDC80^ORF 성적 일시적으로 제어 됩니다. (A) 대표 smFISH 이미지 NDC80^luti 그리고 NDC80^ORF 식물 성장 및 감수 분열 동안. 식물 샘플 셀 (UB8144) 영양소 풍부한 매체에 기 하 급수적으로 성장 하는 때 찍은 사진. Meiotic 의향 샘플 셀 (UB8144) 때이 세포 meiotic 의향에 체포 됐다 시간 중간에 포자 형성, 전송 후 6 시간을 촬영 했다. (녹색에서 표시) Q 670 프로브 NDC80^luti 사이 공유 하는 공통 영역에 교배와 NDC80^ORF mRNAs, 반면 (자홍색으로 표시) CF 590 프로브는 독특한 5'의 영역으로 NDC80^{교배 luti} . DNA는 DAPI (파란색으로 표시)와 스테인드. 각 셀의 Zip1 GFP 신호, meiotic 의향에 대 한 표식에 의해 상연 되었다. 우리의 smFISH 프로토콜 추가 수정 없이 강한 GFP 신호를 유지합니다. 식물 성장: Zip1 GFP 부정. Meiotic 의향: Zip1 GFP 긍정. 이미지는 z 스택의 최대 강도 예측으로 표시 됩니다. 눈금 막대: 5 µ m. 이 그림에서 그림 2C 첸 그 외 의 수정 ¹⁶. (B) NDC80^ORF, NDC80^luti, 그리고 감수 분열 (UB4074) 동안 Ndc80 단백질 (Ndc80p) 수준. NDC80^luti 그리고 NDC80^ORF 수준 북부 오 점에 의해 결정 되었다 및 Ndc80p 수준 표시 시간 지점에서 안티 V5 immunoblot에 의해 결정 되었다. Hxk1p, 로드 immunoblot에 대 한 제어 로 UB8144, 스트레인이 스트레인 또한 항구는 pGAL NDT80 GAL4-ER 동기화 시스템^19,20. 셀 0 시간에서 포자 형성 매체 전송 되었고 공개한 pachytene 체포에서 β-estradiol 추가 6 시간 후. 반면 NDC80^luti 사본 S/meiotic 의향에 튼튼하게 감지는 NDC80^ORF 성적 meiotic 항목 (0 시간) 이전 및 meiotic 사단 (7-9 시간) 동안에 주로 존재 했다. 이 그림에서 그림 6J 첸 그 외 의 수정 ¹⁶ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

그림 6: 부트스트랩 meiotic 의향 샘플에 표시 된에 대 한 수행 분석 그림 5 . 모든 계량된 셀 풀링된 했다, 그리고 셀의 지정 된 수 (n) 무작위로 500 번 샘플링 된. 평균 및 95% 신뢰 구간 셀 당 짝와 짝이 없는 mRNA의 일부분에 대 한 계산 했다. 이러한 데이터 숫자 n (삽입 된)의 각 선택에 대 한 구성 했다. 분산에 고원 샘플 셀 (n)의 수의 기능으로 평균로 나눈 표본 분산을 그려서 시각 이었다. 총 수 셀 측정 (437)의 크게 초과 하는 숫자는 오류 plateaued (~ 60 셀), 추가 데이터 측정에 신뢰성을 향상 되지 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 7:에 표시 된 smFISH 데이터의 부 량 그림 5 , NDC80^luti 주어진된 수 있는 셀의 상대 주파수 히스토그램으로 그래프 및 NDC80^ORF 3 개의 독립적인 실험에서 풀링된 데이터를 사용 하 여 세포 당 사본. 파선 NDC80^luti 의 평균 수를 나타냅니다과 NDC80^ORF 세포 당 사본. 각 히스토그램 있어서 그 최대 빈 높이 같은 모든 히스토그램의 정규화 되었다. 637 셀의 총 수는 식물 성장 및 437 meiotic 의향에 대 한 분석 했다. NDC80^luti 에 대 한 양측 Wilcoxon 순위 합계 테스트 수행 및 NDC80^ORF, 각각, 식물 및 meiotic 의향 샘플을 비교. 이 수치는 첸 그 외 의 그림 2D 에서 수정 ¹⁶ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

버퍼 B (1 L 주식: 1.2 M sorbitol; 0.1 M 칼륨 인산 염 버퍼, pH 7.5)	1 x
Nuclease 무료 물	500 mL
솔 비 톨	218.6 g
KH2포4	2.18 g
K2HPO4	14.62 g
Nuclease 무료 물	1 L 최종 볼륨을
* 필터 살 균 후 50 mL aliquots 4 ˚C에서 저장
Zymolyase 100T (10mg/mL)
*-20 ˚C aliquots에 저장
10 mg zymolyase 분말 1 mL MilliQ 물에 분해
E. 대장균 tRNA (10mg/mL)
*-20 ˚C aliquots에 저장
10 mg tRNA 분말 1 mL MilliQ 물에 분해
70% 에탄올 (50 mL)	1 (mL) x
순수 에탄올	35
Nuclease 무료 물	15
* 상 온에서 저장
교 잡 버퍼 (10 mL)	1 (mL) x

토론

여기에 제시 된 프로토콜 다른 게시 된 smFISH 프로토콜^2,3,21,,2223에서 파생 되 고 효 모 스트레인 배경 SK1 최적화입니다. 최적화 된 매개 변수 셀 번호, 고정 기간, 원심 분리 속도 기간, 소화 기간, 소화 버퍼, 프로브 농도 및 교 잡 버퍼 포함. 교 잡 온도 기간 같은 다른 매개 변수 최적화 하지 했다. 이 섹션에서 우리는이 프로토콜 어떤 효 모 스트레인 배경 및 관심사의 성장 조건에 적응 하는 데 도움이 될 몇 가지 메모를 공유.

싹 트는 효 모의 세포 벽은 프로브 삽입을 방지 하는 세포 벽 때문에 싹 트는 효 모에 높은-품질 smFISH 이미지를 획득 하는 것에 대 한 하나의 주요 도전 이다. Zymolyase에 의해 세포 벽의 불완전 한 소화는 프로브와 신호에 높은 셀 다양성의 비효율적인 교 잡 이끌어 낸다. 그러나, 이상의 소화 수 셀 너무 연약 할 중요 한 선도 세척 단계 동안 손실 셀 및 셀 이미징에 대 한 슬라이드 준비 중 붕괴. 따라서, 소화 기간 최적화 매우 중요입니다. 서로 다른 양의 시간에 대 한 동일한 샘플을 소화 하 여 파일럿 smFISH 실험을 실시 하는 것이 좋습니다. 우리의 경우, 우리 최고의 smFISH 데이터를 얻은 하는 셀의 ~ 80%가 비 굴절 될 때 우리가 소화 중지. 일반적으로, 동일한 성장 조건에 대 한 다른 유전자 돌연변이 체 긴장 비슷한 타이밍으로 소화 될 수 있습니다. 그러나, 소화 기간 다른 성장 조건 및 싹 트는 효 모에 감수 분열의 다른 단계 사이에서 비교 될 때 다릅니다. 타이밍 결정 되 면 smFISH의 품질이 재현 합니다. 참고 결함 세포 벽 합성 또는 구성 돌연변이 체 긴장에 대 한 소화 zymolyase의 다른 배치의 사용 미만 15 분 내에 완료 될 수 있습니다 또한 약간 소화 타이밍을 변경할 수 있습니다.

최적의 프로브 농도 높은 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 필요 합니다. 우리가 설계 하 고 상업적으로 우리의 smFISH 프로브를 구입. 좋은 프로브 (종종 20-메) GC 35%에서 45%, 프로브, 그리고 낮은 분 사이 2 기본적인 쌍의 최소 간격 사이의 비율을 가져야 한다. 우리 프로브, 목록을 생성 하는 제조 업체에서 웹 기반 조사 디자이너를 사용 하 고 충분 한 프로브에서 선택할 수 있다면, 우리는 알고리즘을 사용 폭발 Saccharomyces 게놈 데이터베이스에서 이상의 17 자료 쌍 겹쳐 프로브를 제거 하 과 다른 게놈 영역입니다. 우리는 더 많은 photostable 형광 염료 (CAL Fluor 590) 때문에이 세트에서 (20 프로브) 위의 기준을 모두 만족 하는 프로브 수 보다 낮은 NDC80^luti (CF 590)의 독특한 영역에 anneals 프로브 세트에 대 한 선택은 (~ 25 프로브) 제조업체에서 권장 하는 최소 수입니다. 제조업체의 지침에 따라 프로브 솔루션, 재구성 후 우리가 만든 1시 10분 희석 재고 솔루션의 희석된 솔루션-20 ˚C에서 5 µ L aliquots에 저장. 각 약 수 한 번만 사용 되었다. 최적화, 하나 직렬 해야 희석 1:10에서 희석 솔루션 및 테스트 어느 농도 수익률 최상의 신호 대 잡음 비율. 1: 250, 1: 500, 1:1000, 및 원래 주식에서 1: 2000의 희석 시리즈를 만드는 것이 좋습니다. 우리의 경우, 1: 500 희석 요인 CF 590 및 Q 670 프로브 세트에 대 한 최상의 신호 대 잡음 비율 귀착되는.

최적의 고정 시간 성공적인 smFISH 신진 효 모에 대 한 중요 한 이기도합니다. 우리는 하룻밤 고정 4 ˚C에서 발견 보다는 크게 meiotic 샘플에 대 한 smFISH 결과의 품질과 일관성을 개선 20 분 동안 실내 온도에 고정. 우리는 테스트 하지 않지만 고정 식물 샘플 영향을 줄 수 어떻게 하룻밤, 실 온에서 고정이 성장 조건을 잘 일했다. 따라서, 새로운 긴장 또는 성장 조건에 대 한 smFISH 프로토콜을 최적화 하려면 좋습니다 실내 온도에 짧은 고정 시간으로 시작 하 고 증가 하는 고정 시간 신호의 높은 다양성 발생 하는 경우.

다른 게시 프로토콜^3,,2223와 비교해, 우리의 프로토콜 소화와 교 잡 동안 VRC의 높은 농도 중 VRC RNase 억제제를 사용 합니다. 이 두 단계에의 VRC 추가 향상 smFISH 결과의 일관성 가능성이 더 나은 nuclease 활동, zymolyase 믹스 (효소 원유 추출 물에서 정화와 RNase 포함 될 수 있습니다에 의해 도입 될 수 있습니다에 대 한 RNA 분자를 보존 오염 물질)입니다. 따라서, 우리의 프로토콜 또는 VRC의 최적화를 위한 더 높은 농도에 나와 VRC의 금액을 사용 하는 것이 좋습니다.

셀의 상당 부분 버퍼 B에 formamide 워시 버퍼 세척 단계 동안 손실 될 수 있습니다. 셀 손실을 줄이기 위해, 하나는 원심 분리 속도 증가할 수 있었다. 우리의 경우, 버퍼 B 동안 우리의 샘플 작은를 고속 (21000 x g)를 사용 하 여 씻어 크게 감소 셀 손실. 그러나, 셀 될 zymolyase 소화 후 매우 깨지기 쉬운 그래서 원심 분리 속도 변경 권장 되지 않습니다. 대신, 셀 formamide 워시 버퍼에서 세척 하는 동안 작은 도움이 크게 미국 과학에서 낮은 접착 튜브 사용 하 여 하는 것이 좋습니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜 지속적으로 효율적인 이미징 충분히 밀도 세포의 단층을 생성할 수 있습니다. 일반적으로, 7 시야를 산출 해야 한다 > 130 셀 정량화에 적합.

마지막으로, 그것은 대 한 최적의 이미지 분석에서 필요한 출력을 결정 하는 것이 중요입니다. SmFISH 관광 명소를 검색, 게시 된 분석 프로그램 일반적으로 배경 신호를 제거 하려면 가우스 알갱이 사용 하 여 원시 이미지를 필터링 하 고 이미지^2,17의 각 집합에 대해 사용 하 여 신호 대 잡음 비율을 결정 하기 위해 사용자에 게 요청. 불행히도, 거기 현재는 적절 한 매개 변수 결정 됩니다, 단일 표준 이며 그래서 이러한 다른 설정의 몇 가지 경험적 테스트 하는 것은 필요. 각이 단계에 필요한 매개 변수를 설정 하려면 하나는 반복적으로 다른 매개 변수 집합을 입력 하 고 얼마나 잘 각 세트에서 얻은 결과 일치 하는지 몇 가지 대표적인 셀에서 수동 계산에서 확인 해야 합니다. 매개 변수 한 집합이 발견 되 면 그것은 다른 성장 조건과 유전적 배경에 불구 하 고 얻은 이미지의 대부분을 위해 사용할 수 있습니다.

또한, 하나는 smFISH 이미지의 최대 강도 투영 정량화²²전에 수행할 수 있는 경우 테스트할 수 있습니다. 이 단계 자리 탐지 알고리즘을 단순화 하 고 크게 영상 시간, 비록 그들의 subcellular 지 방화 등 개별 관광 명소에 대 한 일부 잠재적으로 유용한 정보 비용 감소. 우리의 경우, NDC80 유전자에 의해 생산 하는 mRNA 분자의 수가 이었다 충분히 낮은 반점 (드문 일 신진 성적 증명서^3,7효 모에 대 한)이이 처리 후 잘 분리 되었다. Colocalization 분석 중요 한 경우에 분석 파이프라인 각 smFISH 자리 colocalization를 평가 하기 위해 각 채널에서의 위치를 결정 해야 합니다. 특정 질문에 따라 질문 하 고, 각 명소의 강도 등 다른 정보 또한 추가 분석을 위해 파이프라인에서 압축을 풀 게 할 수 있습니다. 프로토콜에 단계는 키를 최적화와 이미지 분석 파이프라인 관심 질문 공부를 smFISH 데이터의 높은 품질을 얻기에서 결정적 이다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BSA, RNase-free (50 mg/mL)	Ambion	AM2616	-20°C에서 보관.
Catalase	Sigma	C3515	4 °에 저장; C는 단기입니다. 사용하기 전에 소용돌이.
DAPI	시그마	D9564	-20 °에 저장; C는 물에서 재구성 후. 빛으로부터 보호하십시오.
50% 덱스트렌 설페이트	Milli Pore	S4030	실온에서 보관하십시오. 매우 점성이 있는 액체. 인내심을 가지고 다루십시오.
E. coli tRNA	Sigma	R4251	-20 °에 저장; C는 물에서 재구성 후 부분 표본에서 발생합니다.
에탄올 (100 %, 200 proof)	다양한		가연성.
37% 포름알데히드	Fisher	F79-500	실온에서 보관하십시오. 유독. 주의해서 사용하고 폐기하십시오.
포름 아미드	Ambion	AM9342	4 °C에서 보관하십시오. 산화를 방지하기 위해 온도가 실온과 평형 한 후 개봉하십시오. 유독. 주의해서 사용하고 폐기하십시오.
포도당	다양한		상점 4 ° C 뉴클레아제가 없는 물에 용해된 후.
포도당 산화 효소	Sigma	G2133	-20 °에서 저장; 50 mM NaOAc, pH 5에서 재구성 후 부분 표본의 C.
뉴클레아제가 없는 물	Ambion	AM9932	실온에서 보관하십시오.
인산칼륨 (monobasic 및 dibasic)	다양한		실온에서 보관하십시오.
프로브 라이브러리, TE로 희석, pH 8.0	Biosearch Technologies		Store -20 ° 부분 표본의 C (5 µ L) TE pH 8.0에서 재구성한 후 제조업체의 지침에 따릅니다. 빛으로부터 보호하십시오.
소르비톨	다양한		실온에서 보관하십시오.
20X SSC	Ambion	AM9763	실온에서 보관하십시오.
TE, pH 8.0	Ambion	AM9849	실온에서 보관하십시오.
1 M Tris, pH 8.0	Ambion	AM9856	실온에서 보관하십시오.
Trolox	Sigma	238813	-20 °의 매장; 부분 표본의 C.
200 mM 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체 (VRC)	NEB	S1402S	-20 °에 저장; C는 재구성 후 부분 표본에서 제조업체의 지침에 따릅니다.
Zymolyase 100T	MP Biomedicals	08320932	-20 °에 보관; C는 물에서 재구성 후 부분 표본에서 발생합니다.
저접착 튜브	USA Scientific	1415-2600	실온에서 보관하십시오.