세포 기반 분석 결과와 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 중화 하는 항 체의 검출

Immunogenicity 평가 안전 성과 효능 모니터링 ERTs 포함 모든 생물 학적 치료 제품에 대 한 프로그램의 중요 한 부분입니다. 환자는 약물 안전, 효능, 그리고 pharmacokinetic pharmacodynamic 프로필 직접 영향을 수 있는 면역 반응을 개발할 수 있습니다. NAbs, 라는이 ADA의 하위 집합 두 가지 방법으로 ERT 효능을 억제 수 있습니다: 대상된 셀 또는 ERT 촉매 활동을 억제 함으로써 ERT 통풍 관의 억제를 통해. 여기에 제시 된 방법 측정 NAbs ERT 통풍 관 세포로 방해 하는 설계 되었습니다. 안전과 치료 ERT의 효능을 완벽 하 게 모니터링 하려면 NAbs의 지속적인 모니터링 elucidating 임상 결과 또는 pharmacodynamic 효과¹어떤 잠재적인 상관 관계에서 결정적 이다.

NAbs 단백질 치료제에 대 한 평가 대 한 플랫폼 포함 셀 기반, 효소 활동 및 ligand 바인딩 분석¹. 다양 한 기준에 따라 최적의 분석 결과 플랫폼 선택: vivo에서 치료 제품, 분석 결과 플랫폼 감도, 선택도, 정밀도, 및 중요 한 것은,의 금지 행동을 모방 하는 능력의 행동의 메커니즘 NAbs . Ligand 바인딩 분석 실험은 특정 경우에 있을 수 있습니다 (예를 들어, 관련 셀 라인을 식별할 수 없는 경우 또는 세포 기반 분석 결과에 적절 한 감도 얻을 수 없는 경우). 그러나, 산업 문서 및 다른 업계에서 수용 된 백서에 대 한 2016 초안 FDA 지침, 셀 기반 NAb 분석 실험 때문에 그들은 더 나은 있습니다 것이 좋습니다 반영^1,2 생체 내에서약물의 생물 학적 메커니즘 ^{, 3}.

교류 cytometry 셀 기반 NAb 분석 결과 개발 하기 위한 중요 한 구성 요소는 적합 한 셀 하 포함 약 자극, 대리 긍정적인 제어 응답 중화는 ERT, fluorophore 활용 ERT 및 생물학적 테스트 종 NAb 매트릭스^4,,56. 셀 라인 선택 행동의 ERT 메커니즘에 의존 하 고 여러 셀 라인 분석 결과 개발³중 평가 한다. 여기 설명 하는 방법을 인간의 Jurkat T 세포 세포 표면에 항 체 단편 수용 체 (FcRs)을 무차별 대부분 항 체^{7,8의 Fc 지역의 부족 그들의 생 CI M6PR 식 선정 됐다} . 분석 결과 개발 하는 동안 유효성 검사 연구와 테스트, 테스트 문서¹치료 하지 개인에서 풀링된 혈 청 등 환자 샘플에 대 한 부정적인 통제 설정 중요 하다. 셀 라인 또한 약물 개발¹의 nonclinical, 임상, 및 사후 마케팅 단계에 걸쳐 연속성에 대 한 다른 종에서 관련 행렬을 용납 한다. 다른 구성 요소 분석 결과 긍정적인 통제의 선택 이다. ERT 셀 이해 분석 결과 대 한 긍정적인 컨트롤 바인딩 치료과 CI M6PR^9,1를 통해 이해를 무력화 하는 기능에 따라 선택 되었다. 희귀 질환 환자 인구²에서 특히 분석 결과 컨트롤로 사용 하기 위해 인체에서 유용한 또는 지속 가능한 양의 중화 antisera 얻기 위해 자주 어렵습니다. 대안 하이퍼 예방 접종 동물, 또는 선호도 정화 polyclonal 또는 단일 클로 널 항 체 분석 결과 관련 매트릭스¹에 아군에서 antisera를 포함 합니다. 종의 매트릭스를 사용 하 여, 매트릭스에 존재 하는 항 체 이외의 금지 요인 ERT 통풍 관 억제 수 있습니다 가능 하다. 분석 결과의 또 다른 중요 한 구성 요소가 이다 fluorophore 활용 ERT. ERT 활용에 대 한 fluorophore의 선택은 밝기, pH 안정성, 그리고 교류 cytometer에 다른 채널에 잠재적인 스펙트럼 중첩에 대 한 분석 결과 필요에 따라 각 ERT에 대 한 평가 되어야 한다.

여기서 설명 하는 분석 결과 ERT는 셀 통해 CI M6PR 들어가는 등 치료 단백질, NAb 측정에 대 한 예입니다. 여러 ERTs, lysosomal 저장 장애 (LSDs) 치료, elosulfase 알파 A Morquio 증후군, CLN2 고정 편 질병에 대 한 cerliponase 알파, Fabry 질병에 대 한 agalsidase 알파를 포함 하 여 세포 통풍 관 및 lysosomal 타겟팅이 통로 활용 하기 위한 고 Pompe 질병^10,11alglucosidase 알파. 이 방법의 목적은 마약 바인딩 및 국제화를 통해 CI M6PR 방해 NAbs의 상대적 수준을 측정 하는 것입니다. 이 계층 검사, 확인, 및 titer에서 수행 단계³. 샘플 먼저 NAb 양성 위한 상영 되며 다음 확인 단계에서 긍정적인 확인. 마지막으로, 샘플 화면 하 고 긍정적인 확인을 항 체 titer¹생성 하 순차적으로 희석 수 있습니다. 이 셀 기반 흐름 cytometry 약물 이해 분석 결과는 측정 하는 약물의 약리 프로 파일에 영향을 미칠 수 있는 약물 관련 NAbs의 민감하고 mechanistically 관련 생체 외에서 방법을 제공 합니다. 우리는 이전 메서드를 유효성을 검사 하 고 약 elosulfase 알파⁸이 플랫폼을 사용 하 여 임상 샘플 테스트. 여기는 다른 치료 단백질 또는 ERTs에 적용할 수 있습니다 상세한 단계별 프로토콜에 설명 합니다.

인간의 행렬 승인 그들의 기관 검토 위원회 (IRB)에서 상용 소스 로부터 구입 했다 하지만 잠재적으로 감염 치료를 해야 합니다. 사용 하는 실험실 환경 안전¹²의 문화를 유지 확인 합니다.

1. 분석 결과 시작 하기 전에

1. ERT 활용 streptavidin 자석 구슬 제조 업체의 지침¹³에 따라 준비 합니다.
2. 품질 관리 샘플 (QCs) 준비: 종의 매트릭스 (예를 들어, 풀링된 CSF 또는 혈 청)에 긍정적인 제어 항 체 (PC) (예를 들어,는 NAb) 스파이크.
   참고: FDA 및 EMA 지도 분석 결과 검증 및^1,14테스트 루틴에 대 한 높은 그리고 낮은 QC 준비 권장 합니다.
   1. 예를 들어 10 µ g/mL에서 QC를, 1000 µ L의 전체 볼륨에 대 한 (예를 들어, CSF) 관련 매트릭스의 990 µ L에 1 mg/mL 재고 긍정적인 통제의 10 µ L를 추가 합니다.
   2. Aliquot 볼륨 단일에 대 한 적합 한 QC 샘플 (예를 들어, 50 µ L) 사용 하 고 aliquots-60-80 ° C¹에서 고정.
   3. 약 수를 잘라 포인트-제어 (CC), 종의 매트릭스는 단일 테스트 문서 (예를 들어, 풀링된 CSF 또는 혈 청) 치료 하지 않을 (예를 들어, 50 µ L) 사용 하 고 aliquots-60-80 ° C¹에서 고정.
3. 활용 반응에 fluorophore와 ERT 제조업체의 프로토콜¹⁵에 따라 단백질 라벨 키트를 사용 하 여 수행 합니다. Aliquot 볼륨 단일 적합에 샘플 사용 (예를 들어, 50 µ L)와 동결-60-80 ° c에 aliquots

2. 주 1: 셀 도금 및 샘플 준비

1. 셀 접시 준비
   1. 조직 문화 후드를 사용 하 고 다음 단계에 대 한 무 균 환경을 유지. 70% 에탄올과 후드에 배치 됩니다 깨끗 한 환경^16,,1718를 유지 하는 각 개체를 스프레이.
   2. 37 ° C¹⁹에서 물 또는 목욕에서 따뜻하게 셀 성장 매체 (예를 들어, 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스와 RPMI-1640).
   3. 수 인간 T 림프 톨 Jurkat 세포 및 플레이트 100 µ L 당 96 잘 라운드-하단에 10⁵ 셀/mL x 7.5에서 잘 문화 접시 접시 로더를 갖춘 교류 cytometer에서 사용 하기 위해 적절 한 세포.
      1. 예를 들어 셀^20,21을 계산 하는 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터 사용 합니다.
      2. 셀 적어도 70%를 갖도록 생존 실험을 진행 하기 전에 (예를 들어, trypan 푸른 얼룩과 생존 능력 평가)¹⁷.
   4. 14-20 h에 대 한 하룻밤 5% CO₂ 와 95% 습도 37 ° C 배양 기에서 세포를 품 어.
2. 샘플 준비 검사
   1. 주제를 희석 또는 혈 청 자유로운 매체 (예를 들어, RPMI-1640)를 사용 하 여 컨트롤 샘플 분석 결과. 여기 예제에서는 메서드에서 RPMI-1640 년에 샘플 1:2.5 혈 청 자유로운 매체의 90 µ L을 샘플의 60 µ L을 추가 하 여 희석. (예를 들어, 8 스트립 튜브). 3.1 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 하는 분석 결과 절차 단계로 진행 합니다.
      참고: 1:2.5의 희석 실험적으로 결정 했다 고 여기 제시 하는 방법에 대 한 최적입니다. 개발 된 각 방법에 대 한 최적의 샘플 희석을 결정 되어야 합니다.
3. 확실 한 비드와 샘플 준비
   1. 확실 한 샘플에 필요한 ERT 활용 된 구슬의 수를 계산 합니다.
      1. 예를 들어, 10 샘플 사용 샘플 + 30% 추가 세척 단계 동안 손실에 대 한 보상 ERT 활용 된 구슬의 10 샘플 x 100 µ L = 1300 µ L ERT 활용 된 구슬의.
   2. 소용돌이 구슬 철저 하 게. 세척에 대 한 15 mL 원뿔 튜브를 구슬의 계산 된 번호를 추가 합니다.
   3. ERT 활용 자석 구슬 커플링 버퍼 또는 (예를 들어, 0.1% 폴 20에 식 염 수 인산 염 버퍼와) 제조 업체에 의해 제안 된 1300 µ L을 추가 하 여 씻어¹³아래 단계를 수행.
   4. 소용돌이 관 철저 하 게. 2 분 동안 자기 튜브 랙에서 튜브를 놓습니다. 방해 없이 구슬, 신중 하 게 발음 하 고는 상쾌한 삭제.
      참고: 솔루션 구슬 자석에 때를 진한 갈색에서 돌 것 이다.
   5. 버퍼를 커플링의 1300 µ L와 구슬 resuspend 총 4 개의 세척 세척 단계를 반복 합니다.
   6. 최종 세척 후 버퍼 (이전 단계 2.3.1.1에서에서 계산) 커플링의 1300 µ L에 비즈를 일시 중단 합니다. 96-글쎄, 흰색, 라운드-하단에 잘, (예를 들어, 하나의 샘플 또는 QC 당 잘 확인, fluorophore 표시 ERT와 알을 품을 때 중복으로 분할 샘플 지) 판 지도 따라 구속력이 폴 리 프로필 렌 플레이트 100 µ L를 추가 합니다.
   7. 96-잘 측면 skirted 자석에 접시를 놓고 펠 릿을 형성 하기 위하여 비즈를 허용 합니다. 신중 하 게 맑은 상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기.
      참고: 솔루션이 바뀝니다 어둠에서 갈색에 측면 skirted 자석에 약 1-2 분 후 취소. 얻은 구슬 구슬 "건조" 라고 합니다.
   8. 샘플 긍정적인 상영 확인 되는 경우 추가 100 µ L와 ERT 활용 된 구슬 없이 각 샘플의 적절 한/할당으로 잘 합니다. 접시는 플라스틱 필름으로 밀봉 하 고 실 온 (RT)에서 약 800 rpm에 회전 통에 적어도 60 분 동안 그것을 동요.
      참고: 이전에 준비 하 고 긍정적이 고 부정적인 냉동 QCs와 CC 포함 되어야 합니다 모든 접시에.
   9. 부 화 후 96 잘 측면 skirted 자석에 확실 한 접시 놓고 펠 릿을 형성 하기 위하여 비즈를 허용 합니다.
4. Titer 희석 시리즈 준비
   1. Titer 시리즈를 준비 하려면 연속적으로 풀링된 매트릭스 포인트¹을 잘라 미리 정해진된 titer를 시간의 충분 한 수에에서 샘플 희석.
   2. 예를 들어 30 µ L의 샘플 8 희석 (예를 들어, 8 스트립 튜브)의 총에 대 한 1:3 희석 시리즈에서 풀링된 매트릭스의 60 µ L 혼합. 3.1 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 하는 분석 결과 절차 단계로 진행 합니다.

3. 주 1: 분석 결과 절차

1. 혈 청 무료 매체 (예를 들어, 잘, 또는 약 6 mL/접시 당 60 µ L)에 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 합니다.
   1. 예를 들어, 1 µ g/mL의 10 mL를 준비 fluorophore 표시 ERT, 재고 1 mg/mL의 10 µ L을 추가 fluorophore 표시 ERT 9.99 ml 혈 청 자유로운 매체 (예를 들어, RPMI-1640)의.
2. 새로운 외피 격판덮개 (예를 들어, 96-잘, 백색, 라운드-하단, 구속력이 없는 폴 리 프로필 렌 플레이트), 추가 준비 샘플에서 단계 2.2, 2.3 또는 2.4 및 중복 스 (예를 들어, 각각의 전송 60 µ L 1:1 혼합물에 fluorophore 표시 ERT 샘플을 준비 하 고 잘 당 fluorophore 표시 ERT의 60 µ L 추가).
   참고: 예를 들어 실험 판 지도 그림 1에 제공 됩니다.

그림 1: 실험 접시 레이아웃의 예. 샘플 및 fluorophore 표시 ERT는 2-8 ° c.에 하룻밤 incubated 했다 높은-품질 관리 (HQC), 낮은-품질 관리 (LQC), 및 부정적인 품질 관리 (NQC) 같은 컨트롤 상영 되었고 접시 균일성을 평가 하기 위해 접시의 반대쪽 모서리에 확인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. 멀티 채널 피 펫을 몇 번 위아래로 pipetting으로 샘플과 fluorophore 표시 된 ERT를 믹스. 격판덮개는 호 일에 포장 하 고 품 어 그들 하룻밤 2-8 ° C에 14-20 h에 대 한.

4. 주 2: 셀에 준비 된 샘플 추가

1. 2-8 ° C에 외피에서 샘플 인큐베이션 plate(s)를 제거 하 고 10-15 분 동안 37 ° C에서 구슬 목욕에 그들을 배치 하 여 접시를 따뜻하게.
2. CO₂ 배양 기에서 셀을 제거 합니다. 셀 표시 우물^17,19에서 건강 하 고 고르게 분산을 보장 하는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 도금된 셀의 시각적 확인을 수행 합니다.
3. 실험 접시 지도 따르면 셀 플레이트에 이전 혼합된 샘플의 fluorophore 표시 ERT 100 µ L를 추가 합니다.
4. 추가 샘플 셀 플레이트 37 ° c.에 CO₂ 배양 기에 다시 배치 3 h 및 ± 격판덮개를 품 어 15 분.
   참고:이 시간으로 신호 대 잡음 응답 분석 결과에 대 한 최적의 실험실에서 설립 되었다.
5. 14-18 ° c.에 탁상 원심 분리기에서 320 x g 6 분에 대 한 세포 격판덮개 원심 격판덮개 우물의 바닥에 셀 펠 릿의 존재를 확인 합니다.
6. 30-45 ° 각도에서 접시를 개최. 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 각 우물에서 조심 스럽게 제거 합니다. 각 잘 resuspend 셀을 셀 펠 릿에 1 x DPBS의 200 µ L를 추가 합니다.
7. 셀 세척 총 3 세척에 대 한 단계를 반복 합니다. 얼룩이 지는 세포 생존 능력에 대 한 5 단계로 바로 진행 합니다.

5. 주 2: 세포 생존 얼룩

1. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 각 잘, fluorophore 표시 ERT의 다른 방출 파장을 선택 하 고 제조 업체의 지침²²에 따라 준비를 라이브/죽은 얼룩 x 1의 작업 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.
2. 어둠 속에서 RT에서 15 분 동안 접시를 품 어. 14-18 ° c.에 탁상 원심 분리기에서 320 x g 6 분에 대 한 격판덮개 원심
3. 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 각 우물에서 조심 스럽게 제거 합니다. 씻어 셀 1 x 1 x DPBS.

6. 주 2: 1 %Paraformaldehyde 셀 고정

1. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 각 잘으로 100 µ L 냉장된 (2-8 ° C)에서 1 %paraformaldehyde (PFA)의 분배.
2. 접시와 부드럽게 혼합 펄스 소용돌이 인감. 접시는 호 일에 포장 하 고 고정을 위한 수 있도록 적어도 10 분 동안 2-8 ° C에서 그것을 배치.
   참고: 접시 인감에 splashing 피하기 위해 주의 해야 합니다.
3. 분석 하기 전에 여기저기 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 잘으로 1 x DPBS의 50 µ L를 추가 합니다.

7. Cytometry

1. 플레이트 로더 교류 cytometer에 접시를 놓고 그들을 실행 합니다.
2. 습득 하 고 교류 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 측정 된 평균 형광 강도 (MFI) 기록 ( 재료의 표참조).
   참고: 로더 설정에 대 한 예를 들어 그림 2 를 참조 하십시오. 샘플 흐름 속도 샘플 볼륨, 볼륨, 혼합 속도, 및 혼합 수 혼합이 분석 결과 대 한 최적화 되어 있다. 이러한 기준 교류 cytometry 수집 소프트웨어²³에 따라 각 기준에 대 한 숫자 옆 "화살표를" 또는 "아래로" 버튼을 사용 하 여 조정할 수 있다.

그림 2: 흐름 cytometer 로더 설정의 예. 로더 설정은 개발 된 각 분석 결과 대 한 최적화 되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. cytometer 분석/빌 게이츠/플롯에 그림 3과 같이 만듭니다.
   참고: 게이트 생성 및 응용 프로그램 각 흐름 cytometry 소프트웨어²³에 대 한 달라질 수 있습니다.

그림 3: 전략 게이팅 cytometry 흐름. Jurkat 세포 총 이벤트에서 분리 되었고 측면 살포 (SSC) 채널 대 앞으로 분산형 (FSC) 플로팅 게이트 대상 인구 주위를 그리기에 의해 수집 된. Singlets (단일 셀) 남자에서 분리 되었다 또는 더 큰 셀 FSC 영역을 사용 하 여 집계 (FSC-A) 및 FSC 높이 (FSC-H) 채널. 라이브 세포 내의 세포 생존 얼룩에 대 한 부정적인 게이팅에 의해 선정 됐다. 메디아 형광 강도 (MFI) 단일, 라이브 Jurkat 셀에 측정 되었다 하 고 히스토그램으로 그려집니다. 약물 흡수와 셀의 MFI 값 (예를 들어, HQC) 차단 및 제어와 셀의 통풍 관의 금액 표시는 (빨강, 파랑, 각각). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 분석에서 죽은 세포를 제외 하 고 대략 10000 이벤트²³을 기록 합니다.

8. 데이터 분석

1. (원시 MFI) 데이터 분석 소프트웨어를 내보낼 ( 재료의 표참조).
   참고: 필요한 분석에 따라 다음 데이터 분석 수 있습니다 수행 분석 소프트웨어를 사용 하 여.
2. MFI (QCs 및 샘플) 중복 우물의 평균 및 평균에서 중복의 확산 가변성 평가 하 변형 (%CV)의 계수를 계산 합니다.
   
   
   
3. 샘플 및 QCs는 분석 결과에 상영 된 계산에 대 한 비율의 의미 MFI 상대적 금지 (%SI) 신호는 QCs 풀링된 매트릭스 CC에 대 한.
   
4. 필요한 경우 확인 QCs 및 해당 화면 값을 기준으로 샘플에 대 한 복구 비 (Rr)를 계산 합니다.
   

방법의 첫 날, Jurkat 세포의 냉동된 약 수는 해 동 도금, 그리고 테스트 샘플을 준비 했다. 그림 1 예제 판 지도를 보여준다. 두 번째 날, 샘플 Jurkat 세포와 혼합 하 고 약 3 시간 15 분 동안 37 ° C에서 incubated 했다. 셀 다음 세척, PFA, 고정 되었고 교류 cytometer에서 분석. 그림 2 예제 교류 cytometer 설정을 보여 줍니다.

전략 게이팅 cytometry 라이브 단일 Jurkat 세포24 (그림 3)에 fluorophore 활용 된 약물의 양을 측정 하도록 설계 되었습니다. 셀 게이트 세포질 파편을 제외 하 여 파편에서 분리 되었다 [일반적으로, 낮은 앞으로 분산형 (FSC)] 및 죽은 세포 [일반적으로, 높은 쪽 (SSC) 분산형], 분석25라이브 셀만을 떠나. 단일 셀 다음 게이트 높은 FSC 지역과 낮은 FSC 높이26제외 하 여 셀 클러스터에서 분리 되었다. 세포 생존 능력 얼룩 없이 그대로 막 죽 었 거 나 건강에 해로운 셀 표시로 치료 했다 고 추가 게이트 죽은 세포22제외를 만들었습니다. 라이브 단일 셀의 MFI fluorophore 활용 ERT 통풍 관의 분석을 위해 사용 되었다. 시험 결과 심사 하는 잠재력의 예를 들어, 대리 항 약물 항 체 긍정적인 컨트롤 [예를 들어, 높은-품질 관리 (HQC)]의 높은 금액으로 아군 매트릭스 fluorophore 활용 ERT 글귀, 결과의 낮은 MFI에 저해 약 300 (그림 3)입니다. 반면, 긍정적인 제어 항 체의 부재에서 매트릭스와 incubated 셀 높은 MFI 있어야 (MFI 그림3에서 37,830 =), fluorophore 활용 ERT의 통풍 관을 보여주는.

예를 들어 여기에 대 한 긍정적인 제어 항 체 선정 되었다 중화 (즉, CI M6PR 통해 ERT 글귀) 약물의 행동의 메커니즘에 따라. Fluorophores의 패널은 또한 테스트 하 고 최적의 분석 결과 감도 및 동적 범위1에 대 한 비교. 사이 퍼 5e는 약27의 lysosomal 대상의 추가 조치로 일부 ERTs에 관련성이 있을 수도 있습니다 산 성 pH에서의 증가 형광으로 시험 되었다. 녹색 형광 성 염료 (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 488), 그리고 빨강 형광 염료 (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 647) 또한 시험 되었다. 어떻게 다른 fluorophores의 예로 수행할 수 그림 4a 와 4b에 제시. 예제에서는 알 렉 사 Fluor 647 ERT (예를 들어, 낮은 PC 농도에서 높은 %SI) 우수한 감도와 넓은 동적 범위 (~ 3 크기 순서) 최상의 성능을 했다.

그림 4: 다른 fluorophore-ERT 어원이 같은 말에서 결과 예. (A) 분석 결과 개발 하는 동안 긍정적인 제어 (PC) 희석 곡선 평가 되어야 한다 다른 fluorophore 활용 ERTs를 사용 하 여. 예, 여기 두 fluorophore 활용 ERTs (알 렉 사 Fluor 488와 사이 퍼 5e) 6.25 µ g/mL에서와 밝은 fluorophore 활용 ERT (알 렉 사 Fluor 647) 1.56 µ g/mL에서 긍정적인 제어 NAbs의 농도 증가 하는 면 전에 서 시험 되었다. (B)이이 패널 표시 패널 A 에서 곡선 그래프로, MFI를 사용 하 여 알 렉 사 Fluor 647 활용 된 ERT를 사용 하 여 동적 범위에 상당한 증가 보여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

설명 하는 방법을 검색, 확인, 및 보간 NAb titer3의 준 양적 수준에 대 한 계층형된 접근 이다. 분석 결과 분석 결과 감도, 정밀도, 선택도, 특이성, 약물 내성, 견고성를 포함 하는 매개 변수 유효성 검사에 대 한 준비 이며 컷된 포인트에 따라 평가 되어야 한다 설정 설립 guidances1,3 .

샘플 심사 삭감 포인트 (SCP) 보다 큰 %SI 값 가져온 때 잠재적으로이 분석 결과에서 긍정적인 간주 됐다. SCP는 대표적인 인구에서 마약 순진한 샘플 테스트 신호 강도 (SI)3의 상대적 감소를 측정 하 여 통계적으로 결정 했다. 지도 (FDA)의 예를 들어 권장 SCP는 일반적으로 분산 된 데이터 세트의 95번째 백분위 수에 설정 되 고 SCP 계산 방법 되었습니다 다른 곳에서 상세히 설명1. 모든 샘플 분석 결과 신호 (측정 시 % 증가) SCP 이상 감소 하는 잠재적으로 긍정적인 결정 했다 및 SCP 보다 높은 결과 (없이 변경 또는 SI % 감소) 부정적인 것으로 간주 됩니다.

긍정적인 (SCP 위의 %SI) 상영 샘플은 ERT NAbs의 특이성을 결정 하는 확실 한 분석 결과에서 테스트 되었습니다. 확실 한 분석 결과 ERT 활용 자석 구슬 약물 특정 항 체 또는 억제 요인 제거와 미리 배양 하 여 수행 되었다. RR (MFI 상영을 확정 MFI의 비율) NAbs의 수 샘플에서 제거 결정을 평가 했다. RR 양성 [즉, 확실 한 컷된 포인트 (CCP)]의 계산 된 임계값 보다 높은 anti-drug NAbs의 존재를 표시. 심사 분석 결과에서 확실 한 분석 결과에서 대표적인 인구에서 치료 순진한 샘플을 평가 하 여 먼저 CCP은 설립 해야한다. CCP는 통계적으로 결정된 1% 긍정 비율에 근거 했다 고 했다 임계값 지정 긍정적으로 확인된 샘플 (그림 5)3.

샘플을 상영 하 고 긍정적인 확인 순차적으로 희석 되었고 상대적 수준 또는 각 샘플에서 NAbs의 titer 결정 titer 분석 결과에서 테스트. 샘플 테스트 긍정적인 그것 [예를 들어, 포인트 (TCP)를 잘라 titer]에 지정 된 임계값을 넘어 가장 높은 희석은 샘플 titer (그림 5)1,3.

그림 5: 예제 샘플 테스트 결과. 이러한 패널 예를 보여 테스트 샘플의 포지티브 또는 네거티브 심사 위 또는 아래 17.51%의 SCP로 시. 긍정적인 샘플 다음 약물 활용 자석 구슬 고갈 분석 결과에서 테스트 이전 샘플에서 약물 특정 항 체를 사용 하 여 확실 한 분석 결과에서 테스트 되었습니다. 복구 비율 (RR) 확실 한 컷된 포인트 보다 큰 샘플 (즉, RR = 1.315) 긍정적인 확인할 수로 간주 됐다. 샘플 확인 긍정적인 신호 건너 titer 포인트 titer (희석 비율) 샘플 결과 titer를 같게 잘라 포인트 설정 (TCP)를 잘라 때까지 희석 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

분석 결과 반복성 및 다양성 더 이상의 애 널 리스트와 몇 일 동안 시험 되었다. QCs는 처음 하나의 일괄 처리에서 준비 하 고 서브-aliquoted 1 x 사용 했다. 3 d 과정 두 애 널 리스트 분석 결과의 전체 자릿수를 보여 QCs의 여러 분석 결과 수행 합니다. 남북 및 내부 분석 정밀도 QCs의 CV % 표시 되는 예제 데이터에서 % 이력서 < 20% (그림 6)1의 FDA 지침의 권고는 있습니다.

그림 6: QC 정밀 데이터 두 애 널 리스트와 함께 3 일 동안 생성의 예. 정밀 데이터는 분산 분석 (ANOVA) DeSilva 외 에 표시 하는 수식을 사용 하 여 계산 된 28. (실행) 내 내부 배치 및 (실행) 사이 간 배치 통계 %cv.로 보고 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

저자는 직원 및 BioMarin 제약 주식회사의 주주