여기, 우리는 다양 한 세포 모델에서 신호 경로 변경을 식별 하기 위해 항 체 배열에 대 한 프로토콜을 제시. 마약/산소/초 violet 빛/방사선, 또는 overexpression/downregulation/녹아웃, 한 이러한 변경 사항을 다양 한 질병 모델에 대 한 중요 하 고 치료 효과가 있을 것입니다 또는 약물의 메커니즘을 확인할 수 있습니다. 여부를 나타낼 수 있습니다. 저항입니다.
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이 논문에서
요약
초록
암 환자는 단백질 인 산화 네트워크의 탈 규제와 종종 tyrosine kinase 억제제와 함께 처리 됩니다. 85%에 접근 하는 응답 속도 일반적 이다입니다. 불행 하 게도, 환자 자주 될 치료에 다루기 힘든 그들의 신호 전달 경로 변경 하 여. Microarrays와 식 프로 파일링의 구현 전체 mRNA 수준 변화를 식별할 수 있습니다 및 단백질 단백질 수준에서 전반적인 변화를 확인할 수 있습니다 또는 단백질, 그러나 신호 변환의 활동을 확인할 수 있다 경로 포스트 번역 상 수정 단백질의 심문 하 여 설정할 수 있습니다. 그 결과, 약물 치료는 성공 여부 또는 저항 발생 여부를 식별 하는 기능 또는 신호 경로에 모든 변경 하는 능력은 중요 한 임상 도전 이다. 여기, 우리는 시스템 차원의 변경 다양 한 포스트 번역 상 수정 (예를 들어, 인 산화)에서 확인할 수 있는 도구로 서 항 체 배열의 자세한 설명을 제공 합니다. 항 체 어레이 사용의 장점 중 하나는 그들의 접근성 (배열 하지 않아도 proteomics에 전문가 또는 비용이 많이 드는 장비) 및 속도 포함 됩니다. 포스트 번역 상 수정 조합 대상 배열의 여부 기본 제한 사항입니다. 또한, 공평한 접근 (phosphoproteomics) 항 체 어레이 가장 널리 특징이 대상에 대 한 이상적인 소설 발견에 대 한 더 적합 한 수 있습니다.
서론
타겟된 티로신 키 니 아 제 억제제 (TKI)의 임상 구현 그 드라이브 종양 약 변화에 특정 단백질을 대상으로 효과적인 도구로 의사를 제공 하 여 암 치료를 변화 하고있다. 이러한 화합물을 억제 하거나 tyrosine kinases1,2에 의해 표적으로 하는 단백질의 인 산화를 차단 합니다. TKIs는 유전자를 신호 하는 다양 한 키에 유전 변경 드라이브 암 개시 [예를 들어, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR), proto-oncogene 티로신 단백질 키 니 아 제 Src (SRC), 진행 하기에 충분 하기 때문에 부분에서 개발 되었다 BCR-ABL, 그리고 인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)]3,4. 세포 주기5 와6 분자 신호 경로 TKIs의 영향 분자로 가이드 암 치료에는 타겟이 불분명 한에서 변환을 나타냅니다. TKIs 대 화학 요법의 주요 장점은 증가 응답 속도 건강 한 세포7독성의 낮은 위험. 결....
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프로토콜
1. 단백질 추출
- 10 m m 조직 문화 접시 (또는 플라스 크)에 5 x 106 세포 조직 문화 후드에서 플레이트. 자동 셀 카운터 또는 hemocytometer 도금 시 셀을 계산 합니다. 또는, 세포 수를 견적 한다.
- 10 m m (또는 플라스 크)에 성장 셀 린스 철저 하 게 10 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 배 (pH = 7.4). 세포의 용 해 버퍼를 추가 하기 전에 모든 PBS를 제거 되었는지 확인 합니다.
참고: 세포의 용 해 버퍼는 보통 키트와 함께 제공 됩니다. 그렇지 않은 경우에 다음 사용 radioimmunoprecipitation 분석 결과 버퍼 (RIPA) 또는 어떤 다른 세포 세포의 용 해 버퍼 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 칵테일을 포함 하. - 셀에 버퍼의 정확한 금액을 추가 하 고 세포의 용 해 버퍼에 셀 스 크레이 퍼와 세포를 근 근이 여 1 x 107 셀/mL의 세포 세포의 용 해 버퍼를 lyse. (예를 들어, HeLa 세포와 MiaPaCa-2, 10 cm 접시 당 600 µ L) 사용 합니다.
- (약 10 배) 위아래로 lysate 플라스틱 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에 그것을 전송. ....
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결과
TKI 저항 세포에서 신호 변환 통로에 효과 조사, 4 개의 샘플 분석 되었다. 한 컨트롤 샘플 (H3255r1) 및 3 TKI 저항 셀 라인 (H3255r2-4) (그림 2) 자리 항 체 서식 파일 (그림 3)에 관련 되었다. 모든 4 샘플은이 프로토콜을 사용 하 여 준비 되었다. 차동 활동 6 phosphoproteins 항 체 배열 (그림 4)의 분석의 데모에 대 한 선정 됐다. 열 지도 (그림 5)는 중요 한 신호 전달 단백질의 단백질 인 산화에 변화에 반 양적 판독을 제공합니다. 배열 결과의 유효성 검사는 서쪽에 게 더 럽 히기 등 직교 방법을 구현 하 여 완료할 수 있습니다.
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토론
많은 생물학 정보를 결합 하는 접근은 수행 하는 실험에서 세포 기계의 본질적으로 더 정확한 표현입니다. 인 항 체 배열의 출현의 어떤 단일 단백질의 수정 상태 보다 더 유익 될 수 있는 수정 패턴의 신속한 특성화 수 있습니다. 인 항 체 배열의 응용 프로그램에 대 한 일반적인 워크플로 수정 떠들고, 트레오닌, 또는 티로신을 기반으로 합니다. 이 예제에서는 변경 연관 된 폐암에 치료에 저항을 특성화에 집중 했다. 이 응용 프로그램에 대 한 주요 근거는 많은 인간 암18, 신호 변환에서 중심 역할을 담당 하는 단백질 인 산화 그리고이 메서드는 다른 시스템에 양도 될 것입니다. 암 인 산화의 dysregulation는 티로신 키 니 아 제, hyperactivation에 일반적으로 포함 한다 존재 하 고 따라서, phosphorylated 기판 (자동 phosphorylated 키 자체를 포함 하 여 종종) 보다 높은 수준에서 정상에 생리 적 설정 및, 따라서, 암 세포에 phosphopro.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 관대 한 재정 지원의 로렌스 J. 엘리슨의 Transformative 의학 연구소의 USC (데이비드 Agus을 선물)에 대 한 감사. 우리가 Beemer와 세대에 이어질 리사 Flashner의 지원과이 원고에의 게시 주셔서 감사 합니다. 우리는 그녀의 행정 지원에 대 한로 라 니 감사합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | 형광 이미저 | |
| 1.5 mL 튜브 | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | 추출을 위한 | Corning | 21-031-CV |
| 조직 배양 접시 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC 인슐린 주사기 U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 단백질 샘플의 바늘 처리를 위한 1 mL |
| 단백질 프로파일러 ARRAY | R& D | ARY003B | Human phospho MAPK 어레이 |
| 단백질 프로파일러 어레이 | R& D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | 단백질 정량화를 위한 흡광도 리더 | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | 형광 검출을 위한 Streptavidin 접합체 |
| LabGard ES Class II, Type A2 생물 안전성 캐비닛 | NuAire | NU-425-400 | 조직 배양 후드 |
| TC20 자동 세포 계수기 | Bio-Rad | 1450102 | 세포 계수기 |
| 중단 프로테아제 & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA 버퍼 | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH 오픈 소스 | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64비트) | 마이크로소프트 |
참고문헌
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E.
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재인쇄 및 허가
