방법 논문

Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석

DOI:

10.3791/57780

⸱

2018년 6월 26일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기 우리 면역 phenotypic와 기능 (세포내 cytokine 유도)를 평가 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 설명 주변 전체 혈액 샘플, 대량 cytometry 통해 분석으로 변경.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytokines은 면역 질환의 병 인에서 중추적인 역할을 한다. 따라서, cytokine 레벨의 측정 self-tolerance 및 후속 면역의 붕괴에 지도 하는 정확한 메커니즘을 이해 하기 위해에서 여러 연구의 초점 되었습니다. 접근은 지금까지 단일 또는 몇 종류 (cytokines), 면역 체계의 특정 한 측면의 연구에 기초를 둔 하 고 복잡 한 자기 면역 질병의 세계적인 평가 제공 하지 않습니다. 환자 세라 기반 연구 자가 면역에 중요 한 통찰력 여유, 하는 동안 그들은 감지 dysregulated cytokines의 특정 세포 소스를 제공 하지 않습니다. Cytokine 생산 요인, 순환 하는 "본질적인" 환자 전용 플라즈마의 컨텍스트 내에서 여러 면역 세포 하위 집합에서 평가 하는 포괄적인 단일 셀 접근 방식은 여기에 설명 되어 있습니다. 이 방법은 환자 특정 면역 표현 형 (표면 마커)의 모니터링 가능 및 기능 (cytokines), 그것의 기본에서 "본질적인 병원 성" 질병 상태, 또는 치료제에비보 ( ex vivo)의 존재에.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자가 면역 질환의 병 적 상태와 사망률 3-8%의 인구에 영향을 미치는 주요 원인입니다. 미국에서는, 자가 면역 질환에서는 젊은이 중 년 여성 사이에서 죽음의 주요 원인 중 (세 < 65 세)1,2. 자가 면역 질환 임상 유형이 다른 프레 젠 테이 션 및 다양 한 기본 면역 프로세스 특징입니다. 이 성분의 스펙트럼은 류 마티스 관절염 (RA) 공동 참여 및 다 발성 경화 증 (MS)에 신경 질환 등 다른 질환에서 잘 표현 된다. 그러나,이의이 수준은 또한 반성 루 푸 스 (SLE) 등 단일 장애 내 궁 행: 다른 혈액 또는 공동 참여3에서 고통을 하는 동안 일부 환자 신장 병 리, 현재 수 있습니다.

자가 면역 질환에 기본 immunopathogenesis 자동 및 하이퍼-활성화의 여러 하위 집합 타고 난 및 적응형 면역 세포, 및 부수적인 dysregulated cytokine 생산을 포함 하는 임상이 거울. Cytokines은 면역 질환의 병 인에서 중추적인 역할을, 하는 동안 질병의 기계 장치에 그들의 특정 역할을 이해 했다 입증 도전. Cytokines는 pleiotropy 특징 이다 (한 cytokine 다른 세포 유형에 여러 효과 가질 수 있습니다), 중복 (여러 cytokines 동일한 효과 가질 수 있습니다), 이중성 (한 cytokine 다른 조건 하에서 프로 또는 안티 inflammatory 효과 가질 수 있습니다), 고 소성 (cytokines에서 그것의 "원래", 환경에 따라 서로 다른 역할에 주조 될 수 있다)4,,56. 따라서, 인구 수준 방법 다른 유형의 세포 응답 같은 "사이토카인 환경"을 구분할 수 없습니다. 마찬가지로, 연구 설계는 단일 셀 형식 (cytokine), 면역 체계의 특정 한 측면에 집중 하는 복잡 한 면역 질환에 관련 된 모든 요소에 대 한 글로벌 평가가 제공 하지 않습니다. 환자 세라 기반 연구 자가 면역에 중요 한 통찰력 여유, 하는 동안 그들은 감지 dysregulated cytokines의 특정 세포 소스를 제공 하지 않습니다.

최근에, 우리는 동시에 여러 개의 면역 세포 유형, 평가 하 고 환자 특정 "병원 성" 주변 혈액 플라스마 순환 요인의 주위에 그들의 다양 한 cytokine 물결을 감지 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 개발. 여기에 설명 된 워크플로 고립 된 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 반대로 그대로 주변 전체 혈액 샘플의 사용에 의해 특징입니다. 주변 기기 전체 혈액 나타냅니다 조직의 면역 중재 질환, 자가 면역 질환 (즉, 중 성구, 혈소판), 및 2) 플라즈마 1) 비-단 혈 자주 참여를 포함 하 여 공부를 가장 순수 관련 차량을 면역 활성화 역할 있다 핵 산, 면역성이 있는 복합물, 및 cytokines, 등의 요소를 순환. 캡처하는 "본질적인 병원 성" dysregulated cytokine 생산, 주변 혈액 샘플 그리고 37의 ° C (생리 적 체온) 단백질 수송에서 외피의 6 h 혈액 무승부 (T0, 시간 제로), 후 즉시 처리 됩니다 cytokine 생산 (축적, T6 T0) "내장" 질병 상태 (그림 1)을 나타내는 것을 검출 하기 위하여 어떤 exogenous 자극 조건 (T6, 시간 6 h), 없을 경우에 억제 물. Dysregulated 프로세스에 반영 하는 신호 경로, 질병에 관련 된 면역 반응에 관련 된 주변 혈액 샘플은 아래의 활성화를 공부 하는 외 인으로 (단백질 수송 억제제와 37 ℃에서 6 h 외피) 치료 cytokine 생산 핵 산에 대 한 응답을 나타내는 것을 감지 하 질병 병 인, SLE (T6 + R848, 1 µ g/mL R848와 h 시간 6)의 경우 수신자 같은 수용 체 (TLR) 촉진제 등을 반영 하는 조건 자극 (T6 대 T6 T0 대 비교 + R848, 그림 1)입니다. 공부 하 고 사용할 수 있는 치료제 비보 전,의 immunomodulatory 효과 특정 환자에 대 한 정확한 면역 dysregulated 프로세스에 관련 된으로, 말 초 혈액 샘플은 JAK 억제제에는 관련 치료와 함께 처리 됩니다. 농도 (여기, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, 시간 6 h 5 uM ruxolitinib), 약물 (T6 대 T6 T0 대 + 5R, 그림 1)에 대 한 응답에서 "내장" 질병 상태에서 변화를 감지 하. JAK 억제제 JAK 저 해제 라스 같은 자가 면역 질환의 치료에 성공 하려면 표시 되었습니다 때문에이 연구에 대 한 선정

동시에 여러 면역 세포의 하위 집합, SLE에서 주변 혈액 샘플에서에서 설명한 dysregulated 프로세스를 평가 하기 위해 환자와 건강 한 컨트롤 위에서 설명한 대로 되었고 대량 cytometry 분석. 대량 cytometry, 일컬어 Cytometry 시간-의-비행, 스펙트럼의 문제7,,89오버랩 없이 단일 세포 분석의 40 개 이상의 매개 변수를 제공 합니다. 이 기술은 항 체, 대신 fluorophores10에 바인딩된 태그로 녹는 금속 이온의 형태에서 희토류 금속 동위 원소를 활용 합니다. 전화 외 에 맥 카시 외. (즉, 튜닝 및 교정, 샘플 수집) 대량 cytometry 기술 플랫폼에 관한 추가 정보를 찾을 수 있습니다. 11 , 12 대량 cytometry의 높은 차원 단일 셀 세분성 (자료 테이블) 타고 난 및 적응형 면역 세포 하위 집합에 걸쳐 여러 cytokines의 동시 측정을 수 있습니다.

현재 기존의 임상 및 실험실 매개 변수는 종종 나 지속적인 질병 활동 또는 특정 immunomodulators13, 더 나은 기본 면역 윤곽을 그리 다 하는 필요를 반영에 대 한 응답을 탐지 하기 위한 구체적 플레어 드라이브를 변경 합니다. 항 체 또는 작은 분자 억제제 cytokines를 대상으로 또는 단백질 cytokine 생산의 규칙에 관련 된 신호를 사용 하는 치료 접근의 과다는 면역 질환에서 cytokine dysregulation의 보급을 감안할 때, 최근 나왔다. 기본 형식, 여기에 설명 된 주변 혈액 분석 접근 환자 전용 dysregulated 셀 하위 집합 및 그들의 비정상적인 cytokine 생산 조직 발현과 자가 면역 질환에 식별 하기 위해 플랫폼을 제공 합니다. 이 방법을 특정 dysregulated cytokines를 확인할 수 있습니다, 그리고 구체적인 치료 옵션 수 테스트 ex vivo immunomodulate에 그들의 능력을 평가 하기 위해 환자 특정 질병 치료 선택의 개인 설정에 대 한 허용 프로세스입니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명 된 모든 메서드는 여는 콜로라도 여러 기관 검토 위원회 (COMIRB)의 콜로라도의 대학 승인 되었습니다. 필터링 된 피 펫 팁, 명시 되지 않는 한 아래의 모든 설명된 절차 무 균 조직 문화 후드에서 수행 해야 하 고 모든 시 약 필터링.

1. 주변 전체 혈액 처리용 시 약의 준비

  1. 준비 ruxolitinib 재고 aliquots (10-15 μ/단일 사용에 대 한 유리병) 10 m m (-80 ° C에 게) 제조업체의 지침에 따라 DMSO에 동결 건조 된 시 약을 diluting 하 여. 0.2% (vol/vol) unstimulated 컨트롤을 포함 하 여 분석 하는 모든 실험에서 DMSO 농도 유지.
  2. R848 준비 (resiquimod) 재고 aliquots (10-15 μ/단일 사용에 대 한 유리병)로 살 균 물에서 동결 건조 된 시 약을 희석 하 여 1 μ g/μ에는 제조업체의 지시 당. -80 ° c.에 게
  3. 제조업체 지침에 따라 살 균 물에서 동결 건조 된 시 약을 diluting 하 여 lipopolysaccharide 1 μ g/μ에서 (LPS) 재고 aliquots (한 시간 전용 유리병 당 5 μ)을 준비 합니다. -80 ° c.에 게
  4. 셀 얼룩 미디어 (CSM) PBS, 0.5% BSA 0.02% 할머니3를 사용 하 여 준비 합니다.
  5. 취득 하 고 유지 준비 단백질 수송 억제제 (PTI) 칵테일 (자료 테이블).
  6. 해 동 하 고 메 마른 PBS (1mm)에 ruxolitinib 재고 유리병 (10mm) 1시 10분 희석. 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.
  7. 해 동 하 고 희석 R848 재고 유리병 (1 μ g / µ L) 살 균 PBS에서 1시 10분 (0.1 μ g / µ L). 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.
  8. 해 동 고는 LPS 재고 유리병 (1 μ g / µ L) 1: 100 살 균 PBS에 희석 (0.01 μ g / µ L). 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.
  9. 미리 살 균 RPMI (없음 L-글루타민) (적어도 10 분)에 대 한 표준 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.
  10. 1:5 필터링된 ddH2O (작업 농도)는 벤치탑 (살 균 될 필요 하지 않습니다)에 lyse/수정 버퍼를 희석.
    참고: 전체 혈액의 1 mL 20 mL lyse/수정 버퍼의 작업의 필요합니다.
    1. 전 혈 각 (적어도 100 mL)의 1 mL의 5 조건 lyse/수정 버퍼를 확인 합니다. Aliquot 20 mL 전 혈 (계속 필요할 때까지 37 ° C에서 lyse/수정 솔루션)의 밀리 리터 당 50 mL 원뿔 튜브에 lyse/수정 버퍼의 작업 농도의. 라벨을 lyse/수정 버퍼를 포함 하는 것은 다음과 같이 원뿔 관에 조건: T0 (시간 제로), T6 + 5R (시간 6 h 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (1 μ g/mL R848 가진 6 h 시간), T6 + LPS (0.1 μ g/mL LPS와 시간 6 h)에 게, T6 (6 h 시간).
  11. 레이블은 아래쪽 모자 살 균 폴리스 티 렌 튜브 1 mL microcentrifuge 튜브 단계 1.10에서 동일한 명명법 라운드.

2. 자극과 주변 전 혈 (그림 1)의 처리

  1. 하단 폴리스 티 렌 튜브 단계의 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) 선반에 라운드는 레이블이 배치 합니다.
    참고: 다음 단계를 모두 수행 됩니다 튜브의이 종류에서 달리 지정 하지 않는 한. 조직 문화 후드와 불 임을 유지 하기 위해 인큐베이터 간에 전송할 때 튜브를 모자.
  2. 각 튜브 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) 37 ° C RPMI (없음 L-글루타민)의 1 mL를 추가 합니다. 반전 혈액 컬렉션 튜브 여러 번, 전체 혈액의 1 mL 각 튜브를 더하고 RPMI 철저 하 게 혼합을 여러 번 위아래 플라스틱 (RPMI와 희석 6 h 잠복기 동안 혈액의 응집 방지).
  3. 추가 1시 10분의 10 μ T6 + 5R ruxolitinib. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스. 37 ° c 배양 기에서 튜브의 랙을 놓고 시작 시기는 부 화 (T = 0).
  4. T0 샘플을 다음과 같이 처리 합니다.
    1. T0 튜브의 전체 내용을 포함 하는 37 ° C 작업 농도 lyse/수정 버퍼의 20 mL 레이블이 원뿔 관으로 플라스틱. 최적화 하려면 세포 복구, 작업 농도 lyse/수정 버퍼 튜브를 헹 구 십시오. 원뿔 튜브를 거꾸로 하 여 혼합.
    2. 세포의 용 해 및 고정 수 있도록 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 고정, 다음 벤치탑에서 모든 후속 단계를 수행 합니다. 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심
    3. 상쾌한을 가만히 따르다. Resuspend 셀 헤어 펠 릿, 얼음 차가운 PBS의 1 mL에 다음 PBS에 채워 볼륨 15 mL 원뿔.
    4. 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심 상쾌한을 가만히 따르다. 펠 릿은 빨간색 경우 PBS 세척 (단계 2.4.3–2.4.4)를 반복 합니다. CSM는 펠 릿 헤어 다음 항 체 얼룩이 지기에 대 한 레이블된 microcentrifuge 튜브 (1.11 단계)에 전송의 1 mL에 셀 resuspend 자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 10 µ L의 샘플을 가져가 라.
      참고: 모든 셀이 시점에서 고정 되어, 이후 아니에요 생존 얼룩을 포함 하는 데 필요한.
    5. 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심 잔여 볼륨의 ~ 60 µ L에 펠 릿을 떠나 상쾌한 발음 다른 조건에서 샘플 처리 완료 때까지 얼음에이 펠 릿을 유지.
  5. T = 30 분, 조직 문화 후드에 튜브 랙 (2.3 단계)를 이동 하 고 다음을 수행.
    1. 0.1 μ g/μ의 10 μ 추가 T6 + R848 R848. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스.
    2. T6 + LPS를 0.01 μ g/μ LPS의 10 μ를 추가 합니다. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스.
    3. T6, T6 + 5R, 그리고 T6 + LPS (하지만 하지 T6 + R848)의 단백질 수송 억제제 (500 X 주식) 4 μ를 추가 하 고 T까지 인큐베이터에 샘플 반환 = 6 h. P1000 피 펫 마다 2 h와 철저 하 게 혼합.
      참고: R848 endoplasmic TLR 길 항 제 이며, 따라서 그 대상 수용 체에 대 한 액세스 수 있도록 단백질 수송 억제제 이외에 일시적인 지연 필요.
  6. T = 2 h, T6 + R848 단백질 수송 억제 물 칵테일 (500 X 주식)의 4 μ 추가 튜브. 모든 샘플 P1000 피 펫 혼합 및 T까지 인큐베이터에 선반을 반환 = 6 h.
  7. T에서 한 번 더 한 P1000 샘플 혼합 4 h =.
  8. T = 6 h 처리 T6, T6 + LPS, T6 + R848, 그리고 T6 + 5R 혈액 샘플 튜브에 설명 된 대로 단계 T0 샘플에 대 한 2.4.
  9. 미래의 날짜에 처리-80 ° C에서 잔여 CSM 볼륨에 셀 펠 릿을 저장 합니다. 또는, 바코드 및 저장 하지 않고 얼룩이 지는 항 체를 진행 합니다.

3. 바코드 Lysed/고정 혈액 세포의

  1. 얼음;에 천천히-80 ° C 저장에서 lysed/고정 셀 샘플을 녹여 20 샘플의 최대 고유 바코드와 함께 표시 될 수 있습니다 그리고이 시스템을 사용 하 여 풀링된. 10 X barcoding 페름 버퍼 PBS; 1시 10분으로 희석 샘플 당 ~ 3 mL에 대 한 충분 한 버퍼를 확인 합니다.
  2. 업체인 CSM와 1 X barcoding 페름 버퍼 하나 한 비 살 균 여 물통을 채우십시오. 얼음의 1 mL을 추가 갓 해 동 샘플, 차가운 CSM 피 펫, 철저 하 게 혼합 하 고 각각 미리 레이블이 지정 된 폴 리 프로필 렌 클러스터 관에 전송.
  3. 자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수는 10 μ 샘플을 가져가 라. 각 클러스터 튜브에서 샘플 당 106 셀 x 1.5-2 셀 카운트 정상화: 제거 하 고 2 x 106 셀 이상 초과 셀의 볼륨을 삭제.
  4. 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 셀 원심 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기와 멀티 채널 피 펫 1 X barcoding 페름 버퍼의 1 mL에 셀 resuspend 상쾌한에서 발음.
  5. 정렬 순서에 있는 선반에 클러스터 튜브 샘플의 바코드와 일치 하도록 바코드 키에 표시 된 대로. 피 펫 팁 (아무 혼합) 셀 손실을 줄이기 위해 셀 펠 릿을 건드리지 않고 멀티 채널 피 펫에 의해 클러스터 튜브에서 모든 샘플 바코드 페름 버퍼 X 800 μ 1을 추가 합니다. 랙 클러스터 튜브와 함께 따로 설정 합니다.
  6. -20 ° C와 실 온에서 해 동에서 20-플렉스 Pd Barcoding 키트 튜브 스트립을 제거 합니다. 1 X barcoding 페름 버퍼의 100 μ를 추가 하 고, 철저 하 게 혼합 클러스터 튜브에 해당 셀 샘플으로 resuspended 바코드 믹스의 120 μ를 전송.
  7. 개별적으로 바코드 샘플 사이의 교차 오염 없이 되도록 멀티 채널 피 펫에 의해 철저 하 게 혼합. 셀 라벨 바코드 수 있도록 실 온에서 30 분 동안 클러스터 튜브를 품 어.
  8. 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 원심. 상쾌한, 발음 다음 CSM의 1 mL에 resuspend.
  9. 원심 및 단계 3.8에서 다시 업체인 CSM에 resuspend.
    참고: 각 샘플은 이제 고유 바코드 표시 및 샘플 풀링 될 준비가.
  10. 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 단일 피 펫과 같은 팁을 사용 하 여, 전송 ~ 70-80에서 모든 셀 펠 릿 한 폴리스 티 렌 튜브에 μ 잔여 볼륨. 피 펫 팁;을 추출 하지 마십시오 단일 피 펫이 팁을 따로 설정 합니다.
  11. 멀티 채널 피 펫과 새로운 팁, 셀 복구를 최대화 하기 위해 각 원래 클러스터 튜브를 ~ 100 μ CSM을 추가 합니다. 팁을 따로 설정 된 단일 피펫으로 ~ 100 μ 잔여 볼륨에서 모든 셀 쥐 똥 같은 폴리스 티 렌 튜브에 전송할.
  12. 폴리스 티 렌 튜브 (~ 3 mL)을 가기에 CSM를 추가 합니다. 수와 기록 풀링된 바코드의 셀 번호 설정합니다. 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 같은 날에 바코드 샘플을 얼룩이 지기를 진행 합니다.
    참고: ~ 20-30% 셀 손실 barcoding 프로세스에서 기대 하는 정상입니다.

4. 바코드의 얼룩 Lysed/혈액 세포와 분석에 대 한 준비에 고정 대량 Cytometry 악기

참고: 각 1 X titer의 항 체 얼룩이 지기 (100 당 항 체의 1 μ μ 반응 얼룩), 일반적으로 3-4 x 106 세포를 얼룩이 질 수 있다. 따라서, 모든 바코드 샘플 1 개의 관으로 풀링되지 때 항 체의 양은 조절 해야 합니다. 30 x 106 셀, 고 각 1 X titer 20 바코드 샘플 금액 3-4x 106 세포를 얼룩이 질 수 있다, 바코드 샘플만 필요 합니다는 10 X titer를, 각 샘플을 개별적으로 얼룩이 반대로 요구 하는 것의 항 체 (1 X 20 X 금액 개별 튜브)입니다. 휴대폰 번호에 항 체의 농도 각 개별 항 체 칵테일 (여기 설명)에 대 한 신중 하 게 적정 수 한다.

  1. 표면 얼룩 및 cytokine 유도 대 한 항 체 (테이블의 재료)를 사용 하 여 셀을 얼룩.
    1. 확인 표면 얼룩 칵테일 추가 및 회계 pipetting 오류 수 금액을 계산 하 여 (즉, 각 샘플에 2 x 106 셀의 20 바코드 샘플 얼룩 titer 얼룩 X 10이 필요, 최종 볼륨 계산 보완할 pipetting 오류에 대 한 최종 솔루션 얼룩 10.5 X를 만들기).
    2. 추가 표면 얼룩 볼륨 바코드 셀 펠 릿을의 가치가 10 배. 같은 팁과 세포 손실을 줄이기 위해 혼합 하 고 표면 얼룩과 셀 펠 릿의 볼륨을 측정 합니다.
    3. 셀과 칵테일 얼룩의 볼륨에 따라 달라 집니다, 셀 샘플 (즉, 20 샘플, 20 = 1 mL X 50 μ의 집합을 실행 하는 경우) 수 당 50 μ의 최종 착 볼륨에 CSM를 추가 합니다. 4 ° c.에 30 분 동안 품 어 얼룩도 홍보 샘플 매 15 분 교 반 하십시오.
    4. 표면 얼룩 인큐베이션 기간 동안 파 마/워시 버퍼 (자료 테이블)에 의해 준비 diluting 1:10 필터링된 ddH2수술 준비 및 볼륨을 permeabilization, 2 mL에 5 mL. 4 ° C에 또는 얼음에 계속.
    5. 얼룩이 CSM, 튜브 표면에서 탑 그리고 5 분에 4 ° C에서 600 x g에서 원심 분리기는 상쾌한 발음. 4 ° C, 1시 10분의 2 mL에 바코드 샘플 resuspend 희석 파 마/워시 버퍼. 20-30 분 완전 세포를 permeabilize 4 ° C에서 품 어.
    6. 5 분 동안 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.
    7. 세포내 얼룩 비슷한 얼룩 단계 (표면 얼룩) 따릅니다. 그러나, 4 ° C, 1시 10분을 사용 하 여 셀에 얼룩이 지는 세포내에 걸쳐 permeabilizing 환경에서 계속 볼륨 얼룩 총 수 있도록 CSM 대신 희석 파 마/워시 버퍼.
    8. 세포내 항 체 칵테일 표면에 얼룩이 지 고 셀 펠 릿 (단계 4.1.2–4.1.17) permeabilized를 추가 합니다. 볼륨 셀 샘플 수 당 50 μ를 얼룩이 지는 총을 가져와. 4 ° c.에 60 분 동안 품 어 얼룩도 되도록 샘플 매 15 분 교 반 하십시오.
    9. 세포내 얼룩 동안 준비 intercalator 솔루션: 필터링 된 PBS + 필터링 된 16%의 100 μ의 900 μ PFA (1.6%의 최종 농도 PFA) + 0.2 μ uM intercalator 염료 (자료 테이블)의 500의.
    10. 파 마/워시 버퍼 셀 펠 릿 + 세포내 항 체 칵테일 찬 1:10에서 최고.
    11. 5 분, 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. CSM와 얼룩 튜브 떨어져 가기. 계산 하 고 휴대폰 번호를 기록 합니다. 5 분, 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 단계 4.9에서에서 intercalator 솔루션의 1 mL에 셀 resuspend 완전 윤에 대 한 실 온에서 20 분 이상 incubate 또는 (샘플 intercalator 솔루션에 머물 수 있습니다 4 ° C에서 질량 cytometry 악기에 그들을 실행 하기 전에 최대 1 주) 4 ° C에서 하룻밤.
  2. 대량 cytometry 악기에 대 한 셀을 준비 합니다.
    1. 필터링 된 ddH2O 3 mL와 4 ° c.에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기 튜브 끝 잠재적으로 대량 cytometry 악기를 방해할 수 있는 집계 또는 어떤 파편 든 지 제거를 100 μ m 필터를 통해 필터링 된 ddH2O. 전달의 3 mL에 셀이이 정지를 resuspend.
    2. 계산 하 고 셀 번호 후 여과 기록 합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기
  3. 1:10 필터링된 ddH2o.에에서 그것을 diluting 하 여 교정 비드 솔루션 (테이블의 자료) 준비
  4. Resuspend는 스테인드 셀 1시 10분의 필요한 볼륨에 희석 교정 비드 솔루션 1 ~6 셀/10ml x의 세포 농도 달성 하기 위해.
    참고: 45 µ L/분에 CyTOF1에 대 한 권장된 최적은 5 x 105 셀/mL; 헬 리오스에서 30 µ L/분, 7.5 105 셀/mL x에 대 한.
  5. 대량 cytometry 악기9에 샘플을 실행 하려면 이동 합니다.

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결과

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그림 1 자극에 대 한 워크플로 보여 줍니다 및 혈액 샘플 aliquots의 할당을 포함 한 주변 혈액 샘플의 처리 자극 에이전트, 단백질의 추가의 타이밍 수송 억제 물 칵테일, 그리고 보육 적혈구 (RBC) 세포 및 고정까지 시간. 자극 제의 선택은 평가 대상 신호 및 cytokine 경로에 따라 달라 집니다. 예를 들어 여기에 설명 된 프로토콜 TLR 촉진제 여러 셀 종류에서 타고 난 면역 감지 메커니즘을 평가 하기 위해 사용 됩니다. 대표 extracellular (LPS, TLR4 길 항 제) 및 (R848, TLR7/8 주 작동 근) endoplasmic agonists 선정 됐다. 다른 자극 에이전트 Phorbol Myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 등 Ionomycin (PMAIONO), T 세포 활성 제 역할을 할 수 있는. 특정 cytokines 또한으로 사용 될 수 있습니다 자극 하는 ...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기 소설, 단일 셀, proteomic 접근 방식은 동시에 여러 면역 세포 유형을 평가 하 고 환자 특정 "병원 성" 주변 혈액 플라스마 순환 요인의 주위에 그들의 다양 한 cytokine 물결을 감지 하 여 설명 합니다. 이 방법은 분석 차량과 면역 세포 phenotypic와 기능 이상의 평가 위한 도구로 대량 cytometry로 주변 전 혈을 사용합니다. 메서드는 인간과 쥐 연구21, 쉽게 적용 하 고 다른 면역 기능 분석, 감지 신호 이상14등와 호환 되.

사용자는이 절차의 성공에 영향을 미칠 수 있는 변수의 수의 인식 해야 합니다. 우리의 경험을 바탕으로, 혈액 샘플을 피하기 위해 초기 유도 세포 cytokines (데이터 표시 되지 않음)의 컬렉션의 2 시간 이내 처리 한다. 혈액 샘플 있어야 실내 온도 (25 ° C)에서 대기 하는 동안 처리 합니다. 혈액 샘플을 수집 수 중 나트륨...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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우리는 그녀의 지적 입력 및 도움이 의견에 대 한 아미 Pugh-버나드를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 Boettcher 재단 웹 Waring 생명 의학 연구 상 및 수상 수 K23 1K23AR070897는 NIH에서 엘레나 W.Y. 셰에 의해 지원 되었다. 그녀는 또한 어린이 건강, 스탠포드 CTSA UL1 TR001085, 및 아동 건강 연구를 위한 아동 건강 및 인간 개발 및 루 패 커드 재단의 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소에서 보너스 번호 K12-HD000850에 의해 지원 되었다 연구소의 스탠포드 대학입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RuxolitinibSanta CruzSC-364729A증권 계수 : 10 mM; 최종 콘크: 5 μ M
R848Invivogentlrl-r848-5주식 가격: 1 μ 지/&무; L; 최종 콘크: 1 μ g/mL
LPS-EKInvivogentlrl-eklps주식 계수: 1 μ 지/&무; L; 최종 콘셉트: 0.1 μ g/mL
멸균 PBSLonza17-516F
Lyse/Fix BufferBD biosciences558049재고 계약: 5X; 최종 Conc : 1X (ddH2O에 희석)
BD Phosflow perm / wash buffer IBD biosciences557885Stock Conc : 10X; 최종 농도 : 1:10 (ddH2O에 희석)
RPMIGibco21870-076
아지드 나트륨 (NaN3)시그마 - 알드리치S-8032주식 농도 : >99.9 %; 최종 계약: 0.0002
단백질 수송 억제제(PTI)eBiosciences00-4980-93재고 계약: 500X; 최종 Conc: 1X
DNA 인터컬레이터Fluidigm201192B주식 Conc: 500 μ M; 최종 콘셉트: 0.1 μ M
세포 염색 매체 (CSM)PBS + 0.5 % BSA, 0.02 % NaN3
MaxPar 바코드 파마 버퍼Fluidigm201057재고 Conc : 10X; 최종 계약: 1X
20-plex Pd 바코드 세트FluidigmS0014재고 계약: 해당 사항 없음; 최종 Conc: 해당 없음
EQ TM 4요소 교정 비드Fluidigm201078재고 Conc: 10X; 최종 농도 :
1X 16 % MeOH가없는 포름 알데히드 용액Thermo28908주식 농도 : 16 % (w / v); 최종 Conc : 1.6 % (w / v)
멸균 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브VWR60818-496재고 Conc : n / a; 최종 Conc: 해당 사항 없음
폴리프로필렌 클러스터 튜브Light LabsA-9001재고 계약: 해당 없음; 최종 Conc: n/a
Helios CyTOF 기기FluidigmHeliosCyTOF 분석에 사용되는 모든 용액에는 금속 오염이 없어야 합니다. ddH2O는 모든 용액의 준비에 사용되며 저항률은 18.0M&Omega 이상이어야 합니다. ddH2O 및 자체 준비된 용액은 한 번도 고압멸균된 적이 없는 새 플라스틱 또는 유리병에 보관해야 합니다.
NameCompany카탈로그 번호Comments
Mass Cytometry에 사용되는 항체
표면 마커
CD1cBiolegendL161질량: 161
CD3BDUCHT1질량: 144
CD4BiolegendSK3질량: 174
CD7BDM-T701질량: 149
CD8BiolegendSK1질량: 142
CD11bFluidigmICRF44질량: 209
CD11cBDB-ly6질량: 152
CD15BDHI98질량: 115
CD14BiolegendM5E2질량: 154
CD16eBioscience/ThermoB73.1질량: 165
CD19Santa CruzSJ25C1질량: 163
CD21BiolegendBu32질량: 141
CD27BDL128질량: 155
CD38FluidigmHIT2질량: 172
CD45 총BiolegendHI30질량: 89
CD45RABiolegendHI100질량: 153
CD56MiltenyiREA196질량: 168
CD66BDB1.1/CD66질량: 113
CD86FluidigmIT2.2질량: 150
CD123Fluidigm6H6질량: 143
CD278/ICOSBiolegendC398.4A질량: 156
CD179/PD1BiolegendEH12.2H7질량: 162
IgDBiolegendIA6-2질량: 146
IgMBiolegendMHM-88질량: 151
CXCR5BDRF8B2질량: 173
HLADRBiolegendL243질량: 167
Cytokines
IL-1&알파;Biolegend364-3B3-14질량 : 147
IL-1 β바이오레전드 H1B-98질량: 169
IL-1RA산타크루즈 AS17질량: 157
IL-6BiolegendMQ2-13A5질량: 164
IL-8BDE8N1질량: 160
IL-12/IL-23p40Biolegend C8.6질량: 171
IL-17ABiolegend BL168질량: 148
IL23p19eBioscience/Thermo23dcdp질량: 176
MIP1βBDD21-1351질량: 158
MCP1BD5D3-F7질량: 170
IFNα밀테니 LT27 : 295질량 : 175
IFN γ바이오레전드4S. B3질량: 165
PTENBDA2B1질량: 159
TNF&알파;BiolegendMab11질량: 166
Note: 제조업체가 Fluidigm으로 명시된 경우 이 항체는 금속이 사전 접합된 Fluidigm에서 구입했습니다. 제조업체가 Fluidigm 이외의 것으로 명시되어 있는 경우, 이 항체는 MaxPar Multi-Metal Labeling을 사용하여 자가 접합되었습니다. 제조업체 프로토콜에 따른 키트(Fluidigm Cat: 201300)입니다.

참고문헌

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