성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Summary

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

Abstract

기본 인간 keratinocytes 신선한 피부 조직 및 그들의 확장에서 에 체 외에서 고립 된 실험실 연구와 임상 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 인간의 keratinocytes의 기존의 격리 방법은 포함 한다 낮은 세포 회복 율 및 감소 셀 성인 조직에서 1 차 셀을 생성 효율적으로 입증 된 2 단계 순차 효소 소화 절차를 생존 능력입니다. 우리는 최근 매체에 노 키 니 아 제 억제 물 Y-27632를 활용 하 여 피부 조직에서 인간의 기본 상피 조상 세포 분리 고급 방법 보고. 전통적인 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 간단 하 게, 쉽게, 그리고 보다 적게 시간이 걸리는, 그리고 상피 줄기 세포 수확량 증가 이며 그들의 줄기 세포 특성을 향상 시킵니다. 또한, 새로운 방법론, 진 피에서 표 피의 분리는 필요 하지 않습니다 이며, 따라서 여러 유형의 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 적합 한. 이 새로운 격리 방법 기존 방법의 주요 단점을 극복 하 고 높은 힘 실험실 및 임상 응용 프로그램에 대 한 많은 수 표 피 세포의 생산에 대 한 더 적합 합니다. 여기, 우리가 새로운 방법을 자세히 설명합니다.

Introduction

목표 임상 응용 성인 조직에서 기본 인간의 keratinocytes (HKCs)을 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발 했다. 피부의 기저 층에 피부 표 피 줄기 세포 증식 및 분화 keratinocytes 피부^1,2,3, 의 기능을 유지 하기 위해 제공 하는 높은 잠재력을가지고 ⁴. HKCs 피부 조직 목적을 위해 피부 조직 공학 및 재생, 특히 손상 된 피부의 복구와 임상 응용 프로그램^5,6에 대 한 유전자 치료에 널리 이용 된다에서 격리. HKC-기반 응용 프로그램에 대 한 중요 한 문제는 파악 하 고 확장 하는 높은 잠재적인 생체 외에서^7,8HKCs의 큰 숫자입니다. 다양 한 연구 그룹 줄기 같은 HKCs의 문화를 생산 하는 방법을 개발 했습니다, 하지만 이러한 방법을 수행 하 고 낮은 셀 수율 등 피부 견본 형식에 의해 제한 되 고 ....

Protocol

이 프로토콜에서 사용 하는 인간의 조직 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침에 따라 처리 된 (NO.2015120401, 날짜: 2015 년 5 월 12 일).

1입니다. 준비

1. 얼음 처럼 차가운 Dulbecco의 10 mL 50 mL 튜브에 병원에서 성형 수술에서 삭제 수집 신선한 성인 복 부 피부 조직이 글 중간 (DMEM)으로. 표본은 세포 생존 능력에 크게 영향을 주지 않고 최대 72 h 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.
2. 아래에 설명 된 시 약 및 문화 매체를 준비 합니다.
   1. 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS) 세척 솔루션 준비의 50 mL에 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 mg/L) 1 mL를 추가 합니다.
   2. 두 효소 소화 솔루션의 준비: (1) dispase (2.5 mg/mL에서 DMEM) 50 mL를 준비 하 고 50 mL의 유형 I 콜라 (2.5 mg/mL에서 DMEM) 별도로 기존의 방법; (2) 50 mL dispase의 혼합물을 준비 하 고 나에 게 콜라를 입력 (디졸브 125 mg dispase 가루와 125 밀리 그램의 유형 I 콜라 분말 DMEM의 50 ml에서) 새로운 방법에 대 한.
      참고: 모든 효소 솔루션 해야 0.22 μ m 스 트....

Results

새 메서드 (그림 1A)와 기존의 방법 (그림 1B)의 도식 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 기존의 방법은 2 일 절차는 2 단계 소화 합니다. 대조적으로, 새로운 방법은 작업에 약 3 시간 소요 단계 소화 합니다. 중요 한 것은, 한 단계 새로운 방법 접종 매체에 Y-27632의 존재에 달려 있는 동시에 두 개의 인구 (표 피 및 피부 세포)를 얻을 수 있습니다. 또한, 초기 문화 시간 같은 수의 셀 분리 후 주사 하는 경우 합류 약 80%에 도달 하는 표 피 세포의 최소 3 일 종래의 방법 보다는 더 적은 일반적으로 걸립니다.

새로운 방법 식민지 형태학에 성장 더 기본 표 피 세포를 생성 합니다........

Discussion

상처를 치료 클리닉에서 3 년 이상에 대 한 교양된 기본 HKCs 널리 이용 되었습니다 그리고, 그때 이후로, 그것은 항상 중요 했다 효율적으로 적시에 임상 응용 프로그램에 대 한 셀의 충분 한 번호를 얻을. 따라서, 실제로 기존의 절연 메서드와, 진 피에서 표 피 분리, 어렵게 셀과 낮은 수 성인 셀 통로의 낮은 수율으로 인해 이러한 요구 사항을 충족 합니다. 여기, 우리는 우리가 효율적으로 연구소 및 임상 응용 프로그램에 더 적당 한 이전 보고서^13,14에 따라 성인 조직에서 HKCs를 개발 하는 새로운 간단한 방법을 설명 합니다.

주의 새로운 방법에 대 한 최상의 결과 달성 하기 위해 다음 중요 한 단계에 지불 한다. 첫째, 균질 절차는 중요 한 단계; 부족 한 균질 효소 소화와 해리 셀의 낮은 수율에서 결과의 효율성 영향을 명확 하 게 것입니다. 둘째, 트립 신 소화 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess 자동 세포 계수기	Invitrogen Inc.	C10227	자동 세포 계수
CO2 인큐베이터	Thermo Scientific	51026333	세포 배양용
Sorvall ST 16R 원심분리기	Thermo Scientific	75004380	세포 원심분리기
항온 셰이커	Shanghai Boxun	150036	수조용
전자 저울	Harbin Zhonghui	1171193	조직 계량용
세포 배양 접시	Eppendorf	30702115	세포 배양용
50ml 원심분리기 튜브	KIRGEN	171003	세포 원심분리기용
Cell Strainer	Corning은	431792	Cell filtration
Phosphate 완충 용액	Solarbio Life Science	P1020-500	세척 용액
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	중화 배지 구성 요소
정의 K-SFM	Life Technologies	10785-012	표피 세포 배양 배지
페니실린 스트렙토마이신	Thermo Scientific	15140-122	항생제
소 태아 혈청	생물학 산업	04-001-1AC5	중화 매체 구성 요소
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	HKC 해리용
0.25% Trypsin	베이징 솔라바이오 사이언스 & Technology	T1350-100	HKC 해리용
코팅 매트릭스 키트	Life Technologies	R-011-K	코팅 매트릭스
Dispase	Gibco	17105-041	HKC 절연
콜라겐분해효소 유형 I	Life Technologies	17100-017	HKC 절연용
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	HKC 절연
F12용 영양소 믹스, Hams	Life Technologies	31765035	G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	구성 요소 17504044	G-medium
FGF-2의 성장 인자 Millipore	Merck Biosciences	341595	G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK 억제제
Fungizone	Gibco	15290026	G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	증식 및 세포독성 분석
Mouse Anti-Human Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	HKC
의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용토끼 항 인간 Loricrin	Covance	PRB-145p	HKC의 분화 마커를 확인하기위한 면역 형광 염색
용 마우스 항 인간 Vimentin	세포 신호 기술	3390	피부 섬유 아세포
Integrin &alpha의 면역 형광 염색; 6(GOH3)	산타크루즈	SC-19622	유세포 분석
IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	&alpha의 음성 대조 항체; 6-인테그린  유세포 분석 분야