차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

요약

여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.

초록

병 적인 메커니즘 BEST1 공부에 대 한 좋은 vivo에서 모델의 부족 때문에 주로 애매 남아 있지만 인간의 BEST1 유전자에 200 개 이상의 유전자 변이 발견 되었고 망막 퇴행 성 질환에 연결, 그리고 생리 적인 조건 하에서 그것의 돌연변이입니다. BEST1 인코딩하는 이온 채널, 즉 BESTROPHIN1는 기능 (BEST1), 망막 안료 상피 (RPE); 그러나, 네이티브 인간의 RPE 세포에 매우 제한 된 접근성 과학 연구에 대 한 큰 도전을 나타냅니다. 이 프로토콜 BEST1 질병 유발 돌연변이 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에서 유도 분화에 의해 베어링 인간의 RPEs를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 연구자 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 다양 한 실험 분석에 대 한 hPSC RPEs의 지속적인 소스를 있으며 따라서에 대 한 매우 강력한 접시에 질병 모델을 제공 합니다 hPSCs 자동 재생으로 BEST1-망막 조건 관련. 특히,이 전략은 RPE (patho) 생리학과 RPE에 기본적으로 표현 하는 관심의 다른 유전자 연구에 적용할 수 있습니다.

서론

그것은 적어도 5 망막 퇴행 성 질환 BEST1 유전자^1,2,3,4,,56 유전자 변이 의해 발생 하는 문서화 되었습니다. ^{, 7 , 8}, 200, 여전히 증가에 이미 보고 된 돌연변이의 숫자와 함께. 이러한 BEST1-관련된 질병, 일컬어 bestrophinopathies, 진보적인 시력 손실과 심지어 실명, 원인과 현재 효과적인 치료법 없습니다. BEST1, 즉 BESTROPHIN1의 단백질 제품 (BEST1)는 캘리포니아^{2 +}-활성화 된 Cl^- 채널 (CaCC) 눈^{5,6, 망막 안료 상피 (RPE)에서 구체적으로 표....}

프로토콜

1입니다. RPE에 hPSC의 차별화

1. 유지 하 고 이전¹⁸을 설명 하는 통행 hPSCs.
   참고: 모든 셀 (를 포함 하 여 hPSCs와 hPSC-RPEs) 성장과 분화 프로토콜의 기간 내내 5% CO₂ 에서 37 ° C에서 성장 된다.
2. 차별화, 전에 미리 코팅된 6-잘 접시에 confluent hPSCs 분할.
   1. 플레이트 코트, 지하실 멤브레인 매트릭스 1 시간 약에 대 한 얼음에 녹여, 1시 50분에 4 ° C DMEM 매체에서 liquidized 매트릭스를 일시 중단 하려면 희석, 각 음을 800 µ L 코팅 혼합물을 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 품 어
   2. 코팅 작업이 완료 되 면 혼합물을 발음 하 고 즉시 우물에 1.5-2 mL 매체를 추가 합니다.
   3. 오래 된 문화 판에서 hPSCs 해제, 실 온에서 5 분에 대 한 PBS 플러스 0.5 m m EDTA와 셀을 품 어 하 고 솔루션, 발음 문화 매체와 작은 수 풀에서 셀 resuspend.
   4. 새로운 접시에 ~ 20 %confluency 종자 세포.
      참고:-20 ° C에서 100 µ L aliquots에 지하....

결과

가장 기술적으로 도전적인 단계는 차별화 된 P₀ hPSC-RPE 인구의 높은 순도 달성 하는 것을 목표로 수동 격리 합니다. 성공적인 격리 후 > 90% 셀 P₀ 인구에서 성장 하 고 서명 RPE 형태학 (그림 1C) 표시를 성숙. 비 RPE 또는 P₀ 인구에 미숙한 RPE 세포의 작은 부분의 존재 거의 불가피 하지만 간섭 하지 않습니다 다운스트림 실험으로 안료와 조약돌 모양의 hPSC-RPE 세포의 수는 압도 대다수입니다.

HPSC-RPE 기반으로 질병에서 요리 방식으로 각 환자 별 BEST1 돌연변이 종합적 특징이 vivo에서 그것의 단백질 식 (immunoblotting, .......

토론

HPSCs는 RPE BEST1에 대 한 올바른 세포 계보에 질병을 일으키는 돌연변이와 차별화 하는 질병--요리에 접근에 대 한 가장 중요 한 절차가입니다. 따라서, 각 분화 실험 후 결과 hPSC RPE 세포 확인 되어야 합니다 신중 하 게 그들의 성숙 상태에 대 한 RPE 특정 형태학 및 단백질 마커^16,,1718. 클론 유물을 최소화 하려면 동일한 환자에서 여러 hiPSC 클론 또는 동일한 돌연변이와 여러 hESC 클론 사용 해야 가능.

HiPSC와 hESC 라인을 모두 동일한 프로토콜 RPE에 분화 될 수 있다. hiPSCs 또는 BEST1 유전자에 돌연변이 없이 BEST1 환자 또는 건강 한 기증자의 피부 섬유 아 세포에서 각각 재설정 될 수 있습니다. BEST1 돌연변이 베.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
녹아웃(KO) DMEM	ThermoFisher	10829018
KO 혈청 대체품	ThermoFisher	10829028
비필수 아미노산	ThermoFisher	11140050
글루타민	ThermoFisher	35050061
페니실린-스트렙토마이신	ThermoFisher	10378016
니코틴아미드	시그마-알드리치	N0636
인간 액티빈-A	페프로테크	120-14
MEM (변형)	시그마-알드리치	M4526
소 태아 혈청	VWR	97068-085
N1 보충제	시그마-알드리치	N6530
글루타민-페니실린-스트렙토마이신	시그마-알드리치	G1146
비필수 아미노산	: 시그마 - 알드리치	M7156
타우린	: 시그마 - 알드리치	T0625
하이드로 코르티손	: 시그마 - 알드리치	H0386
트리 요오도 - 티로닌	: 시그마 - 알드리치	T5516
mTeSR-1 매체	줄기 세포 기술	: 5850
마트리겔	코닝	356230
콜라겐 분해 효소	Gibco	17104019
Trypsin	VWR	45000-664
M-PER 포유류 단백질 추출 시약	Pierce	78501
단백질 분해 효소 억제제 칵테일	Sigma-Aldrich	4693159001
RPE65 항체	Novus Biologicals	NB100-355
CRALBP 항체	Abcam	ab15051
BEST1 항체	Novus Biologicals	NB300-164
Beta Actin 항체	ThermoFisher	MA5-15739
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG	ThermoFisher	A-21202
염소 anti-mouse IgG	ThermoFisher	SA5-35521
염소 anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-68071
Hoechst 33342	ThermoFisher	62249
HEKA EPC10 패치 클램프 앰프	워너 인스트루먼트	895000
패치마스터	워너 인스트루먼트	895040