방법 논문

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

DOI:

10.3791/57791

⸱

2018년 8월 24일

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

병 적인 메커니즘 BEST1 공부에 대 한 좋은 vivo에서 모델의 부족 때문에 주로 애매 남아 있지만 인간의 BEST1 유전자에 200 개 이상의 유전자 변이 발견 되었고 망막 퇴행 성 질환에 연결, 그리고 생리 적인 조건 하에서 그것의 돌연변이입니다. BEST1 인코딩하는 이온 채널, 즉 BESTROPHIN1는 기능 (BEST1), 망막 안료 상피 (RPE); 그러나, 네이티브 인간의 RPE 세포에 매우 제한 된 접근성 과학 연구에 대 한 큰 도전을 나타냅니다. 이 프로토콜 BEST1 질병 유발 돌연변이 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에서 유도 분화에 의해 베어링 인간의 RPEs를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 연구자 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 다양 한 실험 분석에 대 한 hPSC RPEs의 지속적인 소스를 있으며 따라서에 대 한 매우 강력한 접시에 질병 모델을 제공 합니다 hPSCs 자동 재생으로 BEST1-망막 조건 관련. 특히,이 전략은 RPE (patho) 생리학과 RPE에 기본적으로 표현 하는 관심의 다른 유전자 연구에 적용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그것은 적어도 5 망막 퇴행 성 질환 BEST1 유전자1,2,3,4,,56 유전자 변이 의해 발생 하는 문서화 되었습니다. , 7 , 8, 200, 여전히 증가에 이미 보고 된 돌연변이의 숫자와 함께. 이러한 BEST1-관련된 질병, 일컬어 bestrophinopathies, 진보적인 시력 손실과 심지어 실명, 원인과 현재 효과적인 치료법 없습니다. BEST1, 즉 BESTROPHIN1의 단백질 제품 (BEST1)는 캘리포니아2 +-활성화 된 Cl- 채널 (CaCC) 눈5,6, 망막 안료 상피 (RPE)에서 구체적으로 표현 8,9. BEST1의 중요 한 것은, 임상 표현 형-관련된 질병은 빛 자극, 라이트 피크 (LP) electrooculogram10,11; 측정 이라고 감소 시각적 반응입니다 LP는 RPE12,,1314CaCC에 의해 중재 될 여겨진다. 더 나은 BEST1 돌연변이의 병 적인 메커니즘을 이해 하 고 잠재적인 치료 쪽으로 작동, 돌연변이 BEST1 채널 endogenously 인간의 RPE 세포에 표현 공부를 필수적입니다.

그러나, RPE 취득 라이브 환자에서 직접 셀 아니다 매우 실용적인. 네이티브 RPE 세포 인간의 시신과 태아의 생 검에서 수확 수 있습니다, 비록 어려운 접근성이이 소스에는 크게 과학 연구를 제한 합니다. 따라서, 그것은 대체 RPE 자사 인간의 눈을 중요입니다. 이 전화 기능 RPE 세포 이제 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 배아 줄기 세포 (hESCs)를 포함 하 여에서 분화 될 수 있다 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 후자로 줄기 세포 기술에 있는 최근 전진에 의해 응답 되어 기본 피부 섬유 아 세포 기증자16,,1718에서 프로그래밍에 의해 생성 되 고. 자체-갱신 및 hPSCs의 pluripotency hiPSCs의 환자의 특이성 및 게놈 수정 잠재력 (예를들면, CRISPR에 의해) hESCs의 다양 한 요리에 질병 모델을 제공 하는 동안 RPEs, 생성 하는 신뢰할 수 있는 소스를 확인 하는 중요 한 것은, 원하는 BEST1 돌연변이.

hPSC-RPE 쥐 RPE 모델에 몇몇 이점이 있다: 1) BEST1 녹아웃 마우스 어떤 망막 이상19, 생쥐와 인간; 사이 BEST1 RPE에의 다른 유전 요구의 가능성을 높이 나타나지 않습니다 2)의 3% 인간 RPE 세포는 쥐20; 35% 달리 binucleate 3) hiPSC-RPE potentiates 임상 헌 이식 망막의 치료 장애21. 그럼에도 불구 하 고, 동물 모델은 여전히 라이브 시스템에 RPE 생리학과 병리학 공부를 위한 불가결 하 고 hiPSC의 종양 가능성을 간과할 수 없습니다.

여기 절차 RPE 차별화 프로토콜 연구 및 임상 목적을 위해 사용 될 수 있는 유용 하 고 비교적 간단한 hPSC을 설명 합니다. 이 프로토콜 니코틴 (비타민 B3)를 사용 하 여 더 치료 activin-a에 의해 RPE로 분화를 유도 신경 조직에 hPSCs의 증가 니코틴 치료가 보여왔다 색소 세포 (RPE로 차별화의 기호)를 증가 시킬 가능성이 셀22차별화의 apoptotic 활동을 약하게 하 여. 결과 hPSC RPE 세포 네이티브 인간의 RPE 세포22로 동일한 키 마커, 조약돌 형태학 및 세포 기능을 표시합니다. 따라서, 연구 설정에서 결과 hPSC RPE 세포는 immunoblotting, immunostaining, 및 자세한 실험 절차는 또한 제공 하는 전체 셀 패치 클램프를 포함 한 다운스트림 기능 분석에 적합 합니다. 임상, RPE 세포 줄기 세포에서 파생 된 동물 연구와 인체 실험23황 반 변성의 이식 치료를 위한 큰 잠재력을 보여왔다.

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프로토콜

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1입니다. RPE에 hPSC의 차별화

  1. 유지 하 고 이전18을 설명 하는 통행 hPSCs.
    참고: 모든 셀 (를 포함 하 여 hPSCs와 hPSC-RPEs) 성장과 분화 프로토콜의 기간 내내 5% CO2 에서 37 ° C에서 성장 된다.
  2. 차별화, 전에 미리 코팅된 6-잘 접시에 confluent hPSCs 분할.
    1. 플레이트 코트, 지하실 멤브레인 매트릭스 1 시간 약에 대 한 얼음에 녹여, 1시 50분에 4 ° C DMEM 매체에서 liquidized 매트릭스를 일시 중단 하려면 희석, 각 음을 800 µ L 코팅 혼합물을 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 품 어
    2. 코팅 작업이 완료 되 면 혼합물을 발음 하 고 즉시 우물에 1.5-2 mL 매체를 추가 합니다.
    3. 오래 된 문화 판에서 hPSCs 해제, 실 온에서 5 분에 대 한 PBS 플러스 0.5 m m EDTA와 셀을 품 어 하 고 솔루션, 발음 문화 매체와 작은 수 풀에서 셀 resuspend.
    4. 새로운 접시에 ~ 20 %confluency 종자 세포.
      참고:-20 ° C에서 100 µ L aliquots에 지하실 멤브레인 매트릭스를 저장 하 고 한 약 수를 사용 하 여 6 잘 플레이트 코트. 코팅에 대 한 시간 또는 하룻밤 실 온에서 37 ° C에서 4 h까지 확장할 수 있다. 일시 중단 하 고 3-5 셀 보다는 단일 세포의 작은 수 풀으로 hPSCs 씨앗에 중요 하다.
  3. 세포는 성장 전체 confluency 때 차별화 매체 (4 mL/음)와 문화 매체를 대체 (표 1, activin-A). 문화, 14 일에 대 한 변화 하는 매체 (4 mL/잘) 3 배 / 주.
    참고: hPSC 플레이트 밀도 복식 약 마다 24 h. 중요 한 세포 죽음 차별화 절차의 시작으로 예상 된다. 죽은 세포와 우물에서 파편의 집계는 중간 변경 시 맨 눈으로 볼 수 있습니다.
  4. 하루 28 일 15에서에서 100 ng/mL 인 activin-A (표 1, 인간 activin-A)와 차별화 매체를 보충. 매체 (4 mL/잘) 변경 3 x / 주.
  5. Activin-A 보충 주 29 (표 1, 인간 activin-A)에 시작을 중지 합니다. 안료 hPSC-RPE 클러스터 (그림 1A-B)이 나타날 때까지 8-10 주에 대 한 차별화 매체에 경작 하는 셀을 계속.
    참고: 클러스터 색소 세포의 볼 수 있습니다 셀 문화 접시에 작은 어두운 점으로 (그림 1A-B, 톱) 육안에 의해. 서명 조약돌 모양으로 개별 안료 세포는 현미경 20 X (그림 1A-B, 아래) 볼 수 있습니다.

2. 격리와 차별화 된 RPE 세포의 문화

  1. 차별 매체를 제거, PBS로 한 번 씻어, 0.05 %trypsin 플러스 각 음에 콜라의 1 U / µ L의 1 mL를 추가 20-30 분 제거 트립 신/콜라에 대 한 37 ° C에서 품 어 고 부드럽게 6 잘 플레이트의 각 음에 미리 따뜻하게 RPE 매체의 2 개 mL를 추가 (< c0 > 표 2).
    참고: 다각형 트립 신/콜라 치료 하기 전에, hPSC-RPE 세포의 형태를 모니터링 하는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 충분 한 소화 후 라운드 되 고.
  2. 당겨 유리 펫 파스퇴르 분 젠 버너를 사용 합니다.
    1. 두 손으로 잡고 오래 (9 인치) 파스퇴르 피 펫 수평, 그래서 양쪽 끝에 분 젠 버너 위에 피 펫의 얇은 부분의 길이를 약 2/3.
    2. 일단 유리는 불꽃에서 부드러운 되 고, 신속 하 게 당겨 두 끝 떨어져, 마이크로 스 크레이 퍼 같은 팁은 피 펫 (그림 2)의 새로운 끝에 형성 되도록 합니다.
    3. 여러 "셀 기구"를 만드는 데 여러 번 반복 합니다. 가져온된 펫 살 균에 대 한 70% 에탄올 스프레이 하 고 셀 문화 후드에 그들을 건조.
  3. 현미경, 마이크로 "셀 스 크레이 퍼"를 사용 하 여 부드럽게 분리 접시에서 안료 hPSC-RPE 클러스터를.
    1. 부드럽게 탭 (긁어 하지 않습니다) 직접 색소 세포에는 플 로트 것입니다 최대 문화 매체에 일단 그들이 우물의 바닥에서 해리.
    2. 즉시 사용 하 여 20 µ L micropipette 부드럽게 해리 hPSC-RPE 세포를 흡입 하 고 RPE 중간24미리 코팅된 6 잘 플레이트에 그들을 전송.
    3. 미리 코팅 12-잘 접시의 단계 2.3.1–2.3.2 필요에 따라 여러 번 반복 하 여 각 5 ~ 103 셀 (~ 10% confluency 20 X 현미경 관찰) 배를 수집 합니다. 2 mL에 매체의 최종 볼륨을 가져와.
      참고: 해리 hPSC-RPE를 방지 하기 위해 부동에서 셀, 하지 마십시오 플레이트의 움직임을 분리 과정에서 천연된 셀 매체에 떠 있지만 여전히 로컬 집중 유지 되도록.
  4. RPE 매체 안료 단층 (그림 1C)을 형성 있도록 또 다른 6-8 주 동안에 12-잘 접시에 문화 새로 격리 hPSC-RPE 세포 (P0)
  5. 3 매체 변경 x / 주. 매체를 변경할 때 기존 매체의 약 1/3 볼륨에 각 잘 두고 신선한, 미리 데워 진 RPE 매체의 2/3 볼륨 추가. 이 단계에서 12-잘 접시에 각 잘 RPE 매체의 2 mL을 사용 (따라서, 중간의 1.3 mL 때마다를 교환).
    참고: P0 hPSC-RPE 세포의 단층 지붕, 셀 적극적으로 체액을 운반 하 고 단단한 접속점25에 의해 정박 제안 양식 수 있습니다. 따라서, 돔 형성 RPE 상태 성숙의 지표 이다.

3. RPE Immunoblotting 운명 유효성 검사

  1. 확인 hPSC-RPE 세포 lysate 가수분해 억제 물 보충 포유류 단백질 추출 버퍼를 사용 하 여 칵테일. 소화 세포 파편을 삭제 하도록 4 ° C에서 15 분 13000 x g 에서 원심 분리 하기 전에 30 분 동안 얼음에 세포 lysate를 품 어. Lysate의 총 단백질 농도 측정 합니다.
  2. 변성 40 75 ° C에서 Laemmli SDS 샘플 버퍼에 총 단백질의 µ g 단백질을 분리 하는 10 분에 대 한 샘플에 15 분 및 염료 앞에 도달 될 때까지 다음 150 V 90 V의 정 전압에서 10% 트리 스-글리신 SDS 페이지 젤 젤의 하단.
  3. 100 V 1 h 10% 메탄올 보충 사전 냉각된 트리 스-글리신 버퍼에 니트로 막에 단백질을 전송 합니다.
  4. 0.1% 비 이온 세제 (TBST)와 실 온에서 1 h 5% 비 지방 건조 우유 염 분 Tris 버퍼에 막을 차단 합니다.
  5. 4 ° C에서 블로킹 버퍼에 하룻밤 희석 주 항 체를 막 품 어. 다음과 같이 RPE 특정 마커 단백질을 대상으로 하는 항 체 희석: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1의 1:1, 000 Β-말라 로드 컨트롤을 검색 하는 1:10,000에서 β-걸에 대 한 항 체 희석.
  6. 각 세척에 대 일 분으로 TBST 3 시간 막 씻으십시오.
  7. 마우스로 fluorophore 활용된 염소 항 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 IgG 이차 항 체 희석 1:10,000 막 품 어.
  8. 각 세척에 대 일 분으로 TBST 4 시간 막 씻으십시오.
  9. 이미징 시스템 (그림 3)는 적외선을 사용 하 여 단백질을 감지 합니다.

4. 검사 Immunostaining에 의해 BEST1 Subcellular 지 방화

  1. 2 mL PBS의 hPSC-RPE 세포를 한 번 세척 하 고 실 온에서 45 분 동안 4% paraformaldehyde 2 mL에 수정.
  2. 두 번, 2 mL의 PBS로 세척 하 고 2 mL PBS의 0.1% 비 이온 계면 활성 제 및 2% 당나귀 세럼 45 분 비 특정 바인딩 사이트 차단와 함께 셀을 품 어.
  3. BEST1 항 체 (1: 200 희석) 실 온에서 2 h에 대 한 셀을 품 어.
  4. 셀 2 mL PBS 3 번을 씻는 다. 함께 품 어 fluorophore 활용 보조 IgG (1:1, 000) 실 온에서 1 h.
  5. 씻어 2 mL PBS 3 번 언바운드 이차 항 체를 제거 하.
  6. Confocal 현미경 검사 법 (그림 4)에 의해 스테인드 세포를 관찰 합니다.

5. 녹음 캘리포니아2 +-hPSC-RPE 전체 셀 패치 클램프에 의해에 종속 Cl- 전류

  1. 패치 클램프 전에 24-72 h (조약돌 모양의 안료)는 완전히 confluent 잘 (12-잘 접시)에 성숙한 P0 hPSC-RPE 세포의 분할. PBS와 중간, 세척 한 번 발음 하 고 우물에 0.05 %trypsin 플러스 1 U / µ L 콜라의 1 mL를 추가 합니다.
    참고: 사전 사용 하기 바로 전에 37 ° C에 트립 신/콜라 따뜻한.
  2. 8 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    참고:이 단계 후 hPSC-RPE 세포는 여전히 부착 연결.
  3. 1 mL micropipette 부드럽게 세척 접시, 떨어져 세포를 사용 하 여 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 소화 혼합물에 셀을 전송. 잔여 세포를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 결합을 미리 데워 트립 신/콜라의 1 mL와 잘을 씻는 다.
    참고: hPSC RPE 세포는이 시점에서 여전히 큰 덩어리에서. 활기찬 pipetting으로 셀 덩어리를 휴식 하지 마십시오. 일부 덩어리 1 mL 팁의 내부 벽에 충실 수 있습니다.
  4. 8 분 동안 37 ° C 건조 욕조에 원뿔 튜브를 품 어.
  5. 10-15 회 소화 믹스 1 mL micropipette 위아래 부드럽게 피 펫을 사용 합니다.
    참고: 셀 덩어리 훨씬 작은 하지만 여전히 표시 된다. 활기찬 pipetting 하지 마십시오.
  6. 위의 두 단계를 반복 합니다.
    참고: 셀의 대부분 pipetting 후 단일 셀에 있어야 한다. 여전히 사용할 수 있습니다 몇 가지 작은 세포 덩어리 수 있습니다. 선택 사항: 추가 5 분 뒤에 부드러운 pipetting 37 ° C에서 원뿔 튜브 품 어. 37 ° C에서 트립 신/콜라에 총 시간 30 분 (8 + 8 + 8 + 5 = 29)을 넘지 말아야 한다.
  7. 소화 셀을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브를 미리 데워 RPE 매체의 5 mL를 추가 합니다. 셀 수집을 5 분 동안 200 x g 에서 회전 합니다. 10-20 %confluency 미리 코팅된 35mm 요리에 다시 일시 중단 하 고 씨 셀 (예를 들어, 100% 10 %confluency 대 한 5 개의 35mm 요리 12-잘 접시에 confluent).
    참고: 항상 피할 활기찬 pipetting 원심 분리 후에 상쾌한에 명백한 어두운 세포 파편에 의해 표현 되는 중요 한 세포 죽음을 발생할 수 있습니다. 잘 분리 된 단일 셀 시드 패치 클램프 기록에 대 한 필수적입니다.
  8. 수행 하는 전체 셀 패치 클램프18,26,,2728,29,30,31위에서 설명한 대로. 취득 단계 잠재력의 가정에서 현재 추적 (-100 + 100 0의 지주 잠재력에서 뮤직 비디오 mV) (그림 5).
    참고: 내부 및 외부 솔루션의 조리법에 대해서는 표 3 과 표 4, 각각.

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결과

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가장 기술적으로 도전적인 단계는 차별화 된 P0 hPSC-RPE 인구의 높은 순도 달성 하는 것을 목표로 수동 격리 합니다. 성공적인 격리 후 > 90% 셀 P0 인구에서 성장 하 고 서명 RPE 형태학 (그림 1C) 표시를 성숙. 비 RPE 또는 P0 인구에 미숙한 RPE 세포의 작은 부분의 존재 거의 불가피 하지만 간섭 하지 않습니다 다운스트림 실험으로 안료와 조약돌 모양의 hPSC-RPE 세포의 수는 압도 대다수입니다.

HPSC-RPE 기반으로 질병에서 요리 방식으로 각 환자 별 BEST1 돌연변이 종합적 특징이 vivo에서 그것의 단백질 식 (immunoblotting, ...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HPSCs는 RPE BEST1에 대 한 올바른 세포 계보에 질병을 일으키는 돌연변이와 차별화 하는 질병--요리에 접근에 대 한 가장 중요 한 절차가입니다. 따라서, 각 분화 실험 후 결과 hPSC RPE 세포 확인 되어야 합니다 신중 하 게 그들의 성숙 상태에 대 한 RPE 특정 형태학 및 단백질 마커16,,1718. 클론 유물을 최소화 하려면 동일한 환자에서 여러 hiPSC 클론 또는 동일한 돌연변이와 여러 hESC 클론 사용 해야 가능.

HiPSC와 hESC 라인을 모두 동일한 프로토콜 RPE에 분화 될 수 있다. hiPSCs 또는 BEST1 유전자에 돌연변이 없이 BEST1 환자 또는 건강 한 기증자의 피부 섬유 아 세포에서 각각 재설정 될 수 있습니다. BEST1 돌연변이 베...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로젝트는 NIH 교부 금 EY025290, GM127652, 및 시작 자금 로체스터의 대학에 의해 투자 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
녹아웃(KO) DMEMThermoFisher10829018
KO 혈청 대체품ThermoFisher10829028
비필수 아미노산ThermoFisher11140050
글루타민ThermoFisher35050061
페니실린-스트렙토마이신ThermoFisher10378016
니코틴아미드시그마-알드리치N0636
인간 액티빈-A페프로테크120-14
MEM (변형)시그마-알드리치M4526
소 태아 혈청VWR97068-085
N1 보충제시그마-알드리치N6530
글루타민-페니실린-스트렙토마이신시그마-알드리치G1146
비필수 아미노산: 시그마 - 알드리치M7156
타우린: 시그마 - 알드리치T0625
하이드로 코르티손: 시그마 - 알드리치H0386
트리 요오도 - 티로닌: 시그마 - 알드리치T5516
mTeSR-1 매체줄기 세포 기술: 5850
마트리겔코닝356230
콜라겐 분해 효소Gibco17104019
TrypsinVWR45000-664
M-PER 포유류 단백질 추출 시약Pierce78501
단백질 분해 효소 억제제 칵테일Sigma-Aldrich4693159001
RPE65 항체Novus BiologicalsNB100-355
CRALBP 항체Abcamab15051
BEST1 항체Novus BiologicalsNB300-164
Beta Actin 항체ThermoFisherMA5-15739
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgGThermoFisherA-21202
염소 anti-mouse IgGThermoFisherSA5-35521
염소 anti-Rabbit IgGLI-COR Biosciences926-68071
Hoechst 33342ThermoFisher62249
HEKA EPC10 패치 클램프 앰프워너 인스트루먼트895000
패치마스터워너 인스트루먼트895040

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
  2. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
  3. Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
  4. Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
  5. Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
  6. Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
  7. Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
  8. Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
  9. Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  10. Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
  11. Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
  12. Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
  13. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
  14. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
  15. Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
  16. Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
  17. Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
  18. Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
  19. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
  20. Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631(2015).
  21. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  22. Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
  23. Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  24. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  25. Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
  26. Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540(2013).
  27. Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
  28. Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
  29. Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079(2012).
  30. Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
  31. Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
  32. Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272(2015).
  33. Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126(2018).

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