방법 논문

급속 하 고, 확장 가능한 어셈블리 및 플래시 Nanoprecipitation 통해 다양 한 합성 Nanocarriers에 생리 활성 단백질의 Immunostimulants 로드

DOI:

10.3791/57793

⸱

2018년 8월 11일

 ,  , 
1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

나노 소재 기초 과학 및 변환 응용 프로그램에 대 한 제어 치료 납품의 다양 한 메커니즘을 제공 하지만 그들의 제조를 종종 가장 생물 의학 연구소에서 제공 하는 전문. 여기, 우리가 현재 확장 가능한 제조 및 플래시 nanoprecipitation를 사용 하 여 다양 한 자기 조립된 nanocarriers의 치료 로드에 대 한 프로토콜.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

나노 치료 및 이미징 응용 프로그램에 대 한 단일 및 결합 된 분자 페이로드의 제어 납품을 사용자 지정 하는 옵션의 넓은 범위를 제공 합니다. 이 증가 한 특이성은 더 높은 힘으로 감소 부작용 및 낮은 복용량을 포함 하 여 중요 한 임상 암시를 가질 수 있습니다. 또한, 위치 타겟팅 및 특정 셀 하위 집합의 제어 변조 수 강화 기본 생물학 현상의 생체 외에서 그리고 vivo에서 조사 하 고 세포의 기능을 조사. 나노 과학, 화학 및 종종 엔지니어링에 필요한 전문 지식을 조작 하 고 그들의 수사를 위해 도구 또는 차량으로 나노를 사용자 지정에서이 분야에 있는 경험 없이 실험실을 금지 하는 불행 하 게도, 그들의 치료 전략입니다. 여기, 우리는 합성 및 손쉬운 형성에 의무가 다양 한 비 독성 블록 공중 합체 시스템의 확장성 어셈블리와 나노 생명 의학 어플리케이션에 대 한 자동차의 로드에 대 한 프로토콜을 제공합니다. 플래시 nanoprecipitation poly(ethylene glycol)-bl에서 다양 한 nanocarriers의 급속 한 제조에 대 한 방법론으로 제시-폴 리 (프로필 렌 황화) 공중 합체. 이러한 프로토콜 실험실 다양 한 지식과 리소스를 쉽게 허용 하 고 reproducibly 그들의 응용 프로그램에 대 한 고급 nanocarrier 전달 시스템을 조작 합니다. 설계 및 플래시 nanoprecipitation를 촉진 하기 위하여 고속 주사기 펌프를 사용 하는 자동화 된 악기의 건설을 처리 하 고는 동질성을 향상 된 하 게 제어할 수 있도록, 크기, 형태 및 polymersome nanocarriers의 로드는 설명.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanocarriers 작고 고분자 화물, 제어 전송 허용 포함 활성 엔터티 하지 않을 경우, 캡슐화, 높은 분해 또는 vivo에서관리에 대 한 너무 소수 될 것 이다. 정기적으로 조작 nanocarrier 형태학의 폴리머 소포 리 (polymersomes 라고도 함)에 유사한 동시에 친수성 및 소수 성 화물1,2로드 기능을 제공 합니다. 그들의 유망한 장점에도 불구 하 고 polymersomes가 드물다 아직도 임상 응용에 인해, 부분적으로, 그들의 제조에 몇 가지 주요 과제를. 임상 사용을 위해 polymersome 공식 대규모, 살 균, 및 일관 된 일괄 처리에서 만들어질 필요가 있다.

다양 한 기술 diblock 공중 합체, poly(ethylene glycol)-블록등에서 양식 polymersomes를 사용할 수 있습니다-폴 리 (프로필 렌 황화) (페그-bl-조달 청), 용 매 분산3, 박막 재1 를 포함 하는 , 4, 마이크로 5,6, 그리고 직접 수 화7. 용 매 분산 단백질 같은 몇몇 bioactive 페이로드 변성 수 있습니다 유기 용 매 존재 긴 부 화 시간을 포함 한다. 박막 재 팬 들은 종종 요구 수용 monodispersity를 달성 하기 위해 비싸고 시간이 많이 걸리는 압출 기술이 형성된 polymersomes 증가할수록 제어의 정보를 제공 하지 않습니다. 또한, microfluids 및 직접 수 화는 큰 생산 볼륨 최대 규모 어렵다. 다른 nanocarrier 제조 방법의 플래시 nanoprecipitation (FNP) 대규모 및 재현성 정립8,,910을 할 수 있는 능력을 제공 합니다. 연구소는 최근 FNP 다양 한 PEG-bl-조달 청 nanostructure 형태학11, 의 일관 된 형성을 포함 하도록 사용 확장 FNP 이전 솔리드 코어 나노 입자의 정립에 대 한 소유 했다, 그러나 12, polymersomes11 와 bicontinuous 나노12를 포함 하 여. 우리는 발견 FNP 했다 성형 압출, 필요 없이 polymersomes의 단 분산 공식의 수 비 압출 polymersomes 박막 재 및 용 매 분산에 의해 형성 된에 비해 우수한 증가할수록 인덱스 값에 따른 11. 그들의 큰 소수 도메인, Bicontinuous 나노 박막 재 수 FNP12용 매 조건 아래 형성에 불구 하 고에 의해 형성 될 수 없었습니다.

여기,bl-조달 청 diblock 공중 합체 polymersome 형성에 사용 된 말뚝-의 합성에 대 한 자세한 설명을 제공, 한정 된 충돌 제트기 (CIJ) 믹서는 FNP FNP 사용 프로토콜 자체, 및 자동화 된 시스템을 구현 사용자 변화를 줄일 수 있습니다. 충분히 내 무료 공식 사용에서 vivo에서, 및 polymersomes FNP에 의해 형성의 특성에 관하여 대표 데이터를 생산 하는 시스템을 소독 하는 방법에 대 한 정보는 포함 됩니다. 이 정보를 polymersomes 생체 외에서 그리고 vivo에서 작업에 대 한 활용에 관심을 가진 독자 그들의 자신의 살 균, 단 분산 공식 조작 하 수 있을 것입니다. Nanocarrier 공식에 폴리머 합성 전문 경험을 가진 독자 급속 하 게 그들의 현재 배합 기술에 대 한 잠재적인 대안 FNP 사용 하 여 그들의 자신의 폴리머 시스템을 테스트할 수 있게 됩니다. 또한, 여기에 설명 된 프로토콜 nanocarriers 나노기술 실험실 과정에서의 수립을 위한 교육 도구로 사용할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Poly(ethylene glycol)-블록의 합성-폴 리 (프로필 렌 황화)-Thiol

  1. Methoxy-poly(ethylene glycol) mesylate 합성 (미네소타: 750) (MeO-말뚝17-Ms, 난).
    1. 자석 교 반 600 rpm에서 MeO-말뚝17-오 3 목 둥근 바닥 플라스 크 (RBF) 내에서 100% 톨루엔의 200 ml에서의 10 g을 분해.
    2. 3 목 RBF 자체는 콘덴서에 연결 된 딘-스 탁 장치를 연결, 불활성 가스에서 전체 시스템을 유지 질소 또는 아르곤.
    3. 3 목 RBF는 기름 목욕, 600 rpm에서 교 반 하면서 165 ° c 열에에서 놓습니다.
    4. 추적 물과 공 비 증 류를 사용 하 여 톨루엔의 100 mL를 제거 합니다.
    5. 기름에서 3 목 RBF 제거, 불활성 가스 조건 유지 하면서 딘-스 탁 장치를 분리 하 고 실내 온도에 냉각 허용.
    6. MeO-말뚝17-오 솔루션 600 rpm에서 교 반 하면서 5.6 mL 100 %triethylamine (3 어 금 니 식)과 무수 100% 톨루엔의 300 mL를 추가 합니다.
    7. 3 목 RBF는 얼음 목욕을 이동, 교 반 600 rpm 및 불활성 가스 조건 유지.
    8. 100% 톨루엔 30 mL에 100 %methanesulfonyl 염화 (3 어 금 니 식)의 3.1 mL를 희석, 3 목 RBF 600 rpm에서 교 반 하면서 추가 퍼 널을 통해 천천히 추가.
    9. 불활성 조건 하에서 실내 온도에 600 rpm에서 밤새 저 어.
    10. 규조토 가득한 부 흐 너 깔때기를 통해 필터 솔루션 ( 재료의 표참조) 염 분을 제거 하.
    11. 물 탕 40 ℃, 120 rpm 및 압력 50-100 밀리 바 사이 설정 회전 설정 회전 증발 기를 통해 톨루엔을 제거 합니다.
    12. 다시 제품 100 %dichloromethane (DCM), 200 mL에 녹이 고 규조토와 포장 부 흐 너 깔때기를 통해 필터링 ( 재료의 표참조).
    13. 물 탕 40 ℃, 120 rpm 그리고 450-600 밀리 바 사이 설정 압력에서 회전 설정 회전 증발 기를 통해 DCM을 제거 합니다.
    14. 아껴 서 다시 100 %DCM 제품을 분해 하 고 천천히 얼음 100 %diethyl 에테르의 500 mL에 dropwise (통해 파스퇴르 피 펫) 추가 하 여 제품을 침전 물. 300 rpm에서 감동 유지.
    15. 가만히 따르다 또는 침전 된 제품, MeO-말뚝17에서 diethyl 에테르를 제거 하려면 발음-Mesylate, 그리고 저장소에 진공 desiccator 완전히 건조 하룻밤.
    16. 제품을 즉시 사용 하거나 몇 달 동안-20 ° C에서 비활성 가스에서 저장 합니다.
  2. Methoxy-poly(ethylene glycol) thioacetate (MeO-말뚝17-TA, II) 음성 합성.
    1. MeO-말뚝17-Ms (I) 100% 무수 dimethylformamide (DMF) 3 목 RBF에서의 200 ml의 5 g을 분해, 불활성 가스에서 실 온에서 600 rpm에서 저 어.
    2. 교 반 솔루션을 100% 탄산 (3 어 금 니 식)의 2.5 g을 추가 합니다.
      참고: 탄산 솔루션에 완전히 용 해 하지 것 이다.
    3. 100%의 100 mL에서 100 %thioacetic 산 (3 어 금 니 식)의 1.3 mL를 희석 무수 DMF dropwise 추가 퍼 널을 통해 솔루션에 추가 하 고.
      참고: Thioacetic 산, 불유쾌 한 강한 냄새가 있다. 모든 더럽혀진된 개체 또는 청소 전에 하룻밤 화학 증기 두건에 계속 주의 해야 합니다.
    4. 적극적으로 저 어 실 온에서 하룻밤 (600 이상 rpm).
      참고: 소금 형성 쉽게이 솔루션의 감동을 방해할 수 있습니다. 밤새 감동 유지 하기 위해 주의 해야 합니다.
    5. 규조토 가득한 부 흐 너 깔때기를 통해 필터 솔루션 ( 재료의 표참조).
    6. 60 ° C, 120 rpm, 그리고 5-15 밀리 바 사이 설정 압력에서 회전 설정 물 목욕과 회전 증발 기를 통해 DMF를 제거 합니다.
    7. 제품의 100 %tetrahydrofuran (THF) 100 mL에 녹이 고 레드/오렌지 컬러 불순물을 제거 하는 중립 알 루미나와 함께 포장 하는 열에 추가.
    8. 물 탕 40 ℃, 120 rpm, 200-300 밀리 바 사이 설정 압력에서 회전 설정 회전 증발 기를 통해 THF를 제거 합니다.
    9. 아껴 서 다시 100 %DCM 제품을 분해. 경우는 소금 침전 형성, 6 μ m 기 공 크기 필터 종이 부 흐 너 깔때기를 사용 하 여 통해 필터 솔루션.
    10. 천천히 dropwise 파스퇴르 피 펫을 통해 300 rpm에서 감동 하는 얼음 처럼 차가운 100 %diethyl 에테르의 500 mL를 추가 하 여 제품을 침전. Diethyl 에테르 수 더 냉장-20 ° c는 방 냉장고에 몇 시간 동안 침전 충돌 하지 않는 경우에 할 수 있습니다 4 ° c.에 솔루션에서
    11. 가만히 따르다 또는 침전 된 제품, MeO-PEG17-Thioacetate에서에서 diethyl 에테르를 제거 하려면 발음. 진공 desiccator에 그리고 그 후-20 ° c. 불활성 가스에서 하룻밤 제품 저장
  3. Diblock 공중 합체 poly(ethylene glycol)-블록-poly(propylene sulfide)-thiol 합성 (페그17-bl-조달 청35-SH, III).
    1. MeO-말뚝17-TA (II) 100%의 10 mL에 녹 아르곤, 실내 온도 물 욕조에 400 rpm에서 교 반 하면서 Schlenk 플라스 크 내에서 무수 DMF.
    2. 나트륨 methoxide 메탄올에 (0.5 M 솔루션)의 1.1 어 금 니 eq 수 400 rpm에서 5 분간 저 어 추가 합니다.
    3. 솔루션을 신속 하 게, 100% 프로필 렌 황화의 35 어 금 니 eq를 추가 합니다. 400 rpm에서 10 분간 저 어 수 있습니다.
    4. 100% 빙 초 산의 10 어 금 니 eq를 추가, 400 rpm에서 5 분간 저 어 수 있습니다.
    5. 60 ° C, 120 rpm, 그리고 5-15 밀리 바 사이 설정 압력에서 회전 설정 물 목욕과 회전 증발 기를 통해 DMF를 제거 합니다.
    6. 다시 100 %DCM 아껴 서 제품을 분해, 80 mL 100% 메탄올, 두 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 사이에 침전.
    7. 4 ° c.에 5 분 동안 7500 x g에서 원심 분리기 원뿔 튜브 멀리 상쾌한 발음
    8. 매장 제품, 못17-bl-조달 청35-SH, 하룻밤 진공 desiccator에 그리고 그 후-20 ° c. 불활성 가스에서

2. 조립 못-bl-조달 청 Nanocarriers Hand-Powered 플래시 Nanoprecipitation를 통해

  1. (선택 사항) 한정 된 충돌 제트 (CIJ) 믹서를 소독.
    1. 생물 안전 캐비닛 (BSC), 내 모든 부분을 하룻밤 0.1 M NaOH 내 분해 믹서 잠수함.
    2. 재어셈블 CIJ 믹서, 고 luer 잠금 주사기를 사용 하 여도 무료 물을 통해 흐름.
    3. 물, 산도 테스트 하 고 중립으로 pH 레지스터까지 통해 물 흐름을 계속 합니다.
  2. 분해 못17-bl-조달 청35-SH 폴리머와 THF (충돌 해결 방법 1)에서 소수 화물.
    1. 말뚝17-bl-조달 청3520 밀리 그램의 무게-쉬 1.5 mL 튜브에.
    2. 소수 성 염료 (예를 들어,DiI, ICG), 추가 약물 (예:rapamycin), 또는 다른 화물.
      참고: 화물 건조, 또는 물 혼합할 수 있는 용 매, 선호 THF에에서 녹아 있을 수 있습니다. 화물 THF 또는 DMF에 용 해 되지 않으면 또 다른 물 혼합할 수 있는 용 매 사용할 수 있습니다, 하지만 아껴 서, 폴리머 용 해 될 것 이다. 로드할 수 있는 화물의 양은 화물 속성에 따라 달라 집니다 (예를 들어, 분자 무게, hydrophobicity, 입체 고려), 자체에 사건-의해-사건을 기준으로11,12탐험 한다.
    3. 100%의 500 µ L 추가 THF 폴리머 및 화물, 적극적으로 분해 하는 소용돌이.
  3. 친수성 화물 수성 버퍼 (충돌 솔루션 2)에 용 해. 이 수성 버퍼 (예를 들면, 인산 염 버퍼 염 분, 순수한 물, 등)의 500 µ L에서 폴리머 소포 내에서 로드할 수 필요에 따라 친수성 화물을 디졸브.
  4. 저수지에 버퍼를 추가 합니다.
    1. (예를 들어, 20 mL 유리 섬광 유리병) 적절 한 크기의 저수지를 선택 (예: 1 x 버퍼링 인산 염 분)의 수성 버퍼의 2.5 mL를 추가 합니다. 믹서에서 유출 직접 입력 저수지를 CIJ 믹서에서 저수지를 놓습니다.
  5. 별도 1 mL 플라스틱 일회용 주사기를 치는 행위 솔루션을 로드 합니다.
  6. 서로 동시에 nanostructures 및 페이로드와 로드에 대 한 솔루션 충돌
    1. CIJ 믹서 상단에 Luer 잠금 어댑터에 주사기를 삽입 합니다.
    2. 단일 부드럽고 빠른 모션에서와 동일한 힘으로 동시에 두 주사기를 우울 하 게.
      참고: 여러 순차적 impingements를 수행 하는 경우 먼저 빈 저수지에 유출 수집.
    3. (선택 사항) 여러 impingements를 수행 합니다. 두 개의 주사기, 그리고 최대 4 번 더 반복 단계 2.6.1-2.6.2 사이 분할 초기 nanostructure 솔루션.
    4. 2.4.1에 수성 버퍼 가득 저수지에서 유출 수집 하 고 부드럽게 혼합 되도록 저 어.
  7. 언로드된 화물 및 유기 용 매를 제거 합니다.
    1. (옵션 1) 2 버퍼 변경 적어도 24 시간 동안 적절 한 MW 컷오프의 튜브를 사용 하 여 nanocarrier 배합 치는 행위에 사용 되는 같은 수성 버퍼와 저수지, dialyze 이 실 온에서 수행할 수 있습니다.
      참고: MW 컷오프 튜브에 의해 유지 됩니다 Nanocarriers < 100000 kDa과 잠재적으로 높은 차단도에 의해 유지 수 있습니다. 이 옵션 불 임 불 임 버퍼를 사용 하 여 BSC에서 수행 하는 경우 유지 합니다.
    2. (옵션 2) 크기 배제 또는 담/버퍼 교환 열 (예를 들어, Sepharose 6B 열) 수성 버퍼 1 x PBS를 사용 하 여 배합을 필터링 합니다.
      참고:이 옵션 철저 하 게 소독 하는 열과 BSC에서 수행 될 때 불 임을 유지 합니다.
    3. (옵션 3) 진공 건조 하룻밤을 사용 하 여 휘발성 유기 용 매를 제거 합니다.
    4. (4 옵션) 정립 멀리 정화 되 고 unencapsulated 화물의 분자량에 따라 1 시간 15 분 동안 20-60 mL/min 흐름 속도에서 50-100 kDa 필터를 사용 하 여 접선 교류 여과 시스템을 사용 하 여 필터링 (큰 화물 오래 걸릴 것 이다).
  8. (선택 사항) Nanocarrier 배합을 집중 한다.
    1. (옵션 1) 회전 농축 기 시스템을 사용 하 여 집중 (MW와예를 들어, 스핀 열 차단 > 100000), 제조 업체에 의해 설명 된 대로 사용.
      참고: Nanocarriers와 회전 사이 resuspended를 할 수 원하는 볼륨으로 집중 하는 스핀의 수를 요구할 수 있습니다. 스핀 농도 nanocarrier 정립의 무 균을 줄일 수 있습니다.
    2. (옵션 2) 진공 건조를 사용 하 여 볼륨을 줄일 수 있습니다.
      참고: 볼륨 변경 이러한 조건 하에서 제어 하기 어려운 이며 주의 농도 전후 osmolarity를 유지 해야 한다.
  9. 개월 주 4 ° C에서 nanocarriers를 저장 합니다. 짧게 소용돌이 nanocarrier 공식 저장 후 사용 하 여의 사전

3. Nanocarrier 공법의 특성

  1. 적재 효율 측정
    1. 화물 형광 또는 260-450 nm에 밖으로 주어진된 파장에 강하게 흡수, 형광/흡 광도 fluorimeter/분 광 광도 계를 사용 하 여 측정.
      참고: 말뚝-bl-PPS는 260-310 nm에서 강하게 흡수 하 고 polymersome 공식 비슷한 파장에서 흡수 하는 화물의 정량화를 복잡 수 있습니다 310-450 nm에서 흡수.
    2. 화물 260-450 nm 범위 내에서 흡수 하 고 친수성, 정립의 25 μ 1% H2O2 또는 1%의 동일한 볼륨을 추가 하 여 말뚝-bl-조달 청 nanostructures 방해 Triton X-100과 연속적으로 분리 하 고 구별 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 수성 호환 크기 제외 열을 사용 하 여 통해 폴리머 흡 광도에서 화물 (예를 들어, Sepharose 6B 열) 11버퍼링 합니다.
    3. 화물 260-450 nm 범위 내에서 흡수 THF 또는 DMF에 녹는 경우 하룻밤 100 μ-80 ° C에서 1.5 mL 플라스틱 튜브에 고정 하 여 배합을 lyophilize. 그런 다음 유리 진공 용기와 장소는 lyophilizer에 튜브를 놓습니다. 동결은 발생 하 고 이후 다시 분리와 HPLC 통해 탐지 전에 DMF 또는 THF 50 μ에 용 해에 대 한 24 시간을 허용 합니다.
  2. 측정 nanocarrier 크기와 형태
    1. 사용 하 여 동적 산란 (DL)11 또는 나노 분석13 추적 nanocarrier 크기를 측정 하.
      참고: Nanocarriers 말뚝17-bl-조달 청35에서 형성-SH 것으로 예상 된다 100-200 nm 사이 평균 직경는 증가할수록와 색인 < 0.3.
    2. Nanocarrier 형태학 극저온 전송 전자 현미경 검사 법 (cryoTEM)14를 사용 하 여 결정 합니다.
      참고: Nanocarriers 말뚝17-bl-조달 청35에서 형성-SH 것으로 예상 된다 명확 하 게 뚜렷한 고분자 막과 크게 구형 폴리머 소포 (polymersomes).
  3. (선택 사항) 도 대 한 공식 테스트
    1. (옵션 1) 사용 하 여 세포 기반 분석 결과 내, 예를 들어, 원시 블루 셀 또는 블루 TLR4 HEK 세포 ( 재료의 표참조)의 존재에 대 한 제조 업체, lipopolysaccharides (LPS)13에 대 한 어느 한 양적 또는 질적 분석 결과에 의해 설명 된 대로 .
    2. (옵션 2) Limulus Amebocyte Lysate (LAL)15 시험 키트를 사용 하 여 제조 업체에 의해 설명 된 대로.

4. FNP 고속 주사기 펌프의 제조

  1. 사용자 지정 기기 부품을 조작.
    참고: 모든 사용자 정의 부품 가공을 위한 3D 모델 보충 자료에 나와 있습니다.
    1. 다층된 악기 섀시 ¾"아크릴 시트에서 기계 그리고 조립 ( 보충 파일 1-5참조).
      참고: 아크릴은 불 쌍 한 내 화학 성. 악기 가혹한 용 매 사용, 금속에서 베이스를 기계를 사용 하는 경우 응용 프로그램에 대 한 적합 한 것으로 간주.
    2. 3D 인쇄 부품 polylactide (PLA) 플라스틱으로 인쇄.
      1. 주사기 추방 (SE) 2 부분 장치 인쇄: 남동 제 1 부-후면 FNP 블록 잡고 캐리지 (그림 5 층, 회색 부분; 보조 파일 6) 그리고 SE 제 2 부-전면 추방 가이드 (그림 5 층, 검은 부분; 보조 파일 7)입니다. 회로도 대 한 보충 파일 2 를 참조 하십시오.
      2. 적외선 센서 지지대 (그림 5I, 블랙 박스; 인쇄 보조 파일 8, 9).
      3. (선택 사항) 듀얼 주사기 플런저 중괄호를 인쇄 합니다.
  2. M5 16 진수 볼트 함께 악기 섀시 레이어를 고정 하 고 기지에 고무 발을 추가 합니다.
  3. Raspbian g n U/리눅스 8.0 (제시) 운영 체제 (리눅스 데비안 기반)와 단일 보드 컴퓨터를 구성 합니다.
    참고: 장비 운영을 위한 소프트웨어는 요청 시 이용 가능. 악기 소프트웨어 소스 코드 요청 시 사용할 수 있습니다. 압축된 파일을 받으면 README 파일에 지정 된 모든 종속성을 다운로드 합니다. 이 소프트웨어는 기본 실행된 매개 변수 (모터 속도, 방향, 등)을 포함 한 악기 작업을 제어할 수 있도록 하는 간단한 그래픽 사용자 인터페이스를 포함 합니다. 사용자는 기존 소스 코드에 확장 하도록 하 고 그들의 자신의 실험에서 사용할 프로그램 사용자 지정 모듈에 맞게. 모든 소프트웨어는 사용 하 여 파이썬 2.7.12 그리고 현재 파이썬 3와 호환 되지 않습니다. RPi, PicoBorgRev, kivy, 그리고 다중 처리 모듈 활용 됩니다. 추가 정보 파일에는 소프트웨어 배포 라이센스에 대 한 자세한 정보를 포함 되어 있습니다.
  4. 24 V 솔 질 한 DC 모터 (그림 5A) 및 정밀 슬라이드 (4.5"(114.3 밀리미터) 치기, 1.27 m m 나사 리드) (그림 5C)를 설치 합니다.
    참고: 여기에 사용 된 24 V DC 모터는 한 RPM최대, 나최대및 4,252 RPM, 4.83 A의 완전-부하 토크 및 ~0.2 N * m, 각각.
    1. (선택 사항) 저해할 작업 중 진동 모터 밑 패딩을 놓습니다.
      참고: 2-3 m m 두꺼운 고무 패드 악기 자료의 모터 마차 크기에 맞게 잘라 하는 것이 좋습니다.
    2. 악기 자료를 정밀 슬라이드를 탑재 합니다.
      1. 일시적으로 스레드 로드를 제거 합니다.
      2. 2 #8-32 평면 기계 나사를 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.
    3. 마운트 DC 모터 나사 빔 커플링 (1-1/4"길이) 6/16" 및 1/4"직경을 사용 하 여 정밀 슬라이드를 한 거죠.
      참고: 악기 기본 레이어를 기계를 사용 하는 아크릴의 두께 따라 shim 모터 및 정밀 슬라이드 샤프트를 필요할 수 있습니다.
  5. 금속 격판덮개 및 L 모양의 코너 중괄호 (그림 5D)에서 추방 플랫폼을 조립. (스레드 로드에 연결 된) 슬라이딩 플랫폼 기본 금속 플랫폼 탑재 #6-32 나사를 사용 하 여. 장착 제한에 관한 자세한 내용은 제조업체에서 제공 하는 정밀 슬라이드 회로도를 참조 하십시오.
  6. 주사기 추방 시스템 설치 프로그램을 조립 한다.
    1. 선형 모션 베개 블록 (장착 플랫폼 + 선형 모션 베어링) M8 크롬 도금 스테인레스 스틸 레일 (병렬 강철 레일 관찰 될 수 있다 쉽게 그림5에서)에 연결 합니다.
    2. 선형 샤프트를 통해 스레드 레일 가이드/지원 및 레일을 잠금. 레일 당 세 가이드를 사용 합니다. 1 및 2 m 4 기계 나사를 사용 하 여 베개 블록에 마운트 SE 부분입니다.
    3. 느슨하게 SE 파트 1 및 2 m 8 16 진수 볼트와 함께. SE 1과 2 부 나선형 압축 스프링 각 볼트를 덮고 보호 되는 두 개의 안으로 향함 나일론 부싱 (참조 그림 5 층) 사이 사이의 공간을 구성 합니다. 이러한 부싱 SE 1 부 및 2 남동 부의 외부에 탑재 합니다.
  7. 와이어 회로 (코어 배선 다이어그램 그림 6 참조)
    1. I2C/SDA, 3.3 V, 모터 컨트롤러에 연결 하 고 GND 핀에 싱글 보드 컴퓨터.
    2. M과 M + 모터 컨트롤러 보드의 블록을 DC 모터 단자를 연결 합니다. 24 V, 2.5 A 전원 공급 장치 (그림 5B) 모터 컨트롤러의 V +와 GND 블록을 연결 (컨트롤러 최종 디자인에서 간단한 전자 제품 상자에 쌌 다입니다, 그림 5 H참조).
    3. 단일 보드 컴퓨터에 해당 핀에 모터 제어 보드의 3V3 및 5V 핀을 연결 합니다. 연결할 모터 컨트롤러의 SDA와 SCL 핀 핀 3과 5 단 하나의 보드 컴퓨터의 각각.
      참고: 명령은 모터 컨트롤러를 통해 단일 보드 컴퓨터에서 DC 모터에 발급 됩니다. 모터 속도 펄스 폭 변조를 통해 모터 단자에서 전압을 조절 하 여 제어 됩니다. 24 V DC 모터를 통해 최대 현재 실행이 설정에서 (완전-부하 전류: 4.83 A) 2.5 A 24 V 전원 공급 장치에 의해 제한 됩니다. 모터 회로 평상시 닫힘 (NC) 비상 정지 (5J 그림)를 통해 유선은 하는 것이 좋습니다. 이렇게 기본적인 비상 셧다운 작업 수 있도록 모터 회로 방해 하는 수단을 제공 합니다.
    4. 연결 전면 및 후면 적외선 근접 센서 (디지털 거리 센서, 그림 5I) RPi GPIO 핀 24, 23, 각각.
      1. 악기 자료에 도관을 통해 경로 센서 배선.
        참고: IR 센서는 비접촉 휴식-빔 2-10 cm의 감지 범위와 모션 센서.
      2. 4.7.4.2 3D 인쇄 적외선 센서 지지대 (그림 5I, 블랙 박스)로 유선된 IR 센서 있고 악기 베이스에 탑재 됩니다. 올바르게 설정 된 경우는 중괄호에, 센서 얼굴 해야 내 다 바깥쪽으로 14 m m x 7 mm에서 여는 중괄호의 직사각형.
        참고: 이러한 센서 중괄호 일시적으로 장착할 수 Velcro 또는 접착제를 사용 하 여 (임시 장착 유용 적절 하 게 조정 하 고 최적화 하는 적외선 센서 배치). 또는, 악기 자료에 작은 가이드 구멍을 시추 하 고 M2 나사와 지지대를 고정 하 여 영구적으로 탑재 합니다.
    5. 5v, GND, 7"터치 스크린 LCD 디스플레이 연결 하 고 단일 보드 컴퓨터의 직렬 인터페이스 (DSI) 핀을 표시 합니다. 7"RPi 및 어셈블리를 표시 LCD 그림 5G에 표시 됩니다.

5. 조작 FNP 맞춤 고속 주사기 펌프를 사용 하 여 통해 Polymersomes

  1. (옵션 1) 자동 실행 모드를 사용 합니다.
    1. 주 메뉴에서 자동 실행 을 선택 합니다. 시스템 모터 자동으로 정밀 슬라이드의 시작 부분에 주사기 추방 플랫폼을 위치를 수 있도록 사용자를 자극할 것 이다. 진행 하기 전에 분명 금속판 뒤에 앞에 경로 인지 확인 합니다.
    2. 섹션 2.5에에서 설명 된 대로 1 mL 플라스틱 주사기 CIJ 믹서의 여성 Luer 커넥터에 마운트 주사기를 로드 합니다. 로드 CIJ 믹서 (주사기 첨부) 후면 퇴 학 캐리지의 직사각형 개통으로 ( 그림 5E참조).
    3. 원하는 모터 속도 설정 (단위: rpm) GUI에서 슬라이더를 사용 하 여 (중요 한 고려 사항에 대 한 아래 참고 참조). 최적의 모터 속도 펌프 특정 설치에 따라 달라 집니다 하지만 여기에 제공 된 CIJ 믹서 채널 차원에 대 한 적어도 1 mL/s 흐름 속도 확인 해야 합니다.
      참고: 설정 유량 동안 다음을 고려 하십시오. 수직 수동 FNP 구성에서 반응 물 퇴 학 ~ 1 mL의 속도로 주사기에서 / s, 그러나 수 높은 변수 때 손에 의하여 몬. 이것은 단순히 흐름 속도는 사용자 주사기 플런저를 이동 하는 속도 의해 제어 되는 주사기 배럴을 통해 이다. 1 mL/s 속도 하지 작은 직경의 노즐에서 출구 유량을 참조. 위의 지정 된 채널 차원, ~ 1 mL/s 난 류 혼합10에 대 한 적절 한 Reynold 수 있도록 유지 되어야 한다. 다른 흐름 율으로 채널 직경은 사나운 조건을 지 원하는 Reynold의 번호를 유지 하기 위해 적절 하 게 조정 사용할 수 있습니다. 높은 정밀 알루미늄 슬라이드 따라 이동 결합 24 V DC 모터를 솔 질 하는 수직 금속 격판덮개에 의해 주사기 plungers 고급입니다. 이 구성에서 최대 총 유량은 (1) 최대 모터 속도 (4,252 rpm)를 포함 하 여 요인의 숫자에 의해 영향을 하 고 정밀 슬라이드 (1.27 m m) 결합 된 모터로의 나사 리드 (2) 모터의 토크 샤프트 (~0.2 N * 전체 l m oad 토크)는 저항으로 유체 항목에서 (3) 백 프레셔 기여 흐름과 CIJ 믹서, 그리고 (4)에서 사용 하는 주사기의 종료을 극복 하는 데 필요한 (사용자는 주사기에 행동 하는 세력의 한다의 주사기를 사용 하 여 적절 한 강도)입니다. 포인트 (2), 흐름을 증가 하는 때에 관한 속도 충분 한 토크는 다시 압력 아래 꾸준히 추방 유지 하면서 모터를 연기 하지 않도록 해야 합니다. 배럴 흐름을 설명 하기 위해 배럴 흐름 속도-속도 전술 시스템 얻을 수, 경우를 고려 어디 FNP 반응 2 1 밀리 주사기에 로드를 사용 하 여 수행 됩니다. 1 mL/s 흐름을 달성 하기 배럴, 모터를 통해 속도 금속 플레이트 1 초에 플런저 길이 (~ 68 m m는 일반적인 1 mL 주사기)에 의해 정의 된 거리를 미리 해야 합니다. 정밀 슬라이드의 1.27 m m 나사 리드, 그것은 따른다 4,252 rpm에서 DC 모터는 최대 플랫폼의 능력을 제공 ~ 90 m m/s (71 계/s * 1.27 m m/회전). 이 배럴 유량 ~1.3 mL/s, 1 mL/s 대상 속도 초과에 해당 합니다.
    4. 악기를 실행 하기 전에 확인 되도록 하는의 경로 시스템 플랫폼은 분명 장애물, 그리고 전면 및 후면 적외선 근접 감지기는 (적외선 센서는 정밀도 슬라이드 근처 작은 블랙 박스 장애물의 명확 터미널; 그림 5I참조). 또한 적절 한 컬렉션 컨테이너에 CIJ 믹서에서 모 세관 배관 출구 라우팅되는지 확인 (예: 유리 비 커, 등).
    5. 반응 그리고 CIJ 믹서에 주사기에서 추방, 소프트웨어 인터페이스에서 실행 단추를 누릅니다.
  2. (옵션 2) 사용 하 여 수동 실행된 모드입니다. 위의 자동 실행 모드 지시를 참조 하 고 5.1.5 단계 다음과 같이 변경: 앞으로 버튼 누르면 실행 (즉, 플랫폼에 프레스 이벤트와 모터 발전의 완성을 통해 지속적으로 보도 중지 됩니다-출시 이벤트에 대 한 응답에서).
  3. (옵션 3) 위치 모드; 수동 플랫폼을 사용 하 여 이 모드는 정방향 및 역방향 단추 소프트웨어 인터페이스에 대 한 응답에서 사용자가 낮은 속도 (20% 전력)에서 모터를 실행 하 여 플랫폼을 위치를 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리는 vivo에서 마우스와 비 인간 영장류 관리11,13안전 nanocarriers 친수성 및 소수 성 화물 적재 능력의 정립에 대 한 간단한 프로토콜을 제시 했습니다. 우리는 또한 우리의 대표 결과, CIJ 믹서에 솔루션의 기계적으로 제어 충돌에 대 한 사용자 지정 악기 제작에 대 한 설명에에서 사용 되는 폴리머의 합성에 대 한 자세한 프로토콜 포함. 못17-bl-조달 청35생산할 수행 합성 단계에 대 한 개요를 제공 하는 그림 1 -SH, diblock 공중 합체 자기 조립 polymersome nanocarriers 사용. 조달 청 못-bl polymersomes 치료제 또는 이미징 에이전트 로드 조립 FNP 프로토콜에 대 한 개...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 polymersomes 말뚝17-bl-조달 청35를 사용 하 여의 급속 한 제조에 대 한 자세한 지침을 제공-SH diblock 공중 합체로. 기공을 polymersomes 친수성이 고 소수 조달 청 블록 분자량의이 비율에서 조립 기본 집계 형태입니다. 여러 번 충돌 하는 경우 그들은 직경 및 일치 후 200 nm 멤브레인 통해 압출 polymersomes 증가할수록 박막 화를 통해 형성. 이 프로토콜은 따라서 단 분산 polymersome nanocarriers의 제조 동안 추가 돌출 단계에 대 한 필요성을 제거합니다. Polymersomes 통해 FNP 형성 친수성 및 소수 성 화물을 로드 하 고 정립 과정11그 분자의 bioactivity를 유지. 추가 프로토콜은 필요할 때, 하도 무료 고 따라서 생화학 및 면역학 분석 실험에 적합 뿐만 아니라 안전 관리 vivo에서 polymer...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 직원 및 계측 노스웨스턴 대학에서 구조 생물학 시설에서 지원 인정 합니다. 상대습도 Lurie 종합 암 센터의 노스웨스턴 대학교와 노스웨스턴 대학교 구조 생물학 시설 지원은 인정 했다. Gatan k 2 직접 전자 검출기는 Searle 자금 시카고 커뮤니티 트러스트에서 지 원하는 시카고 생명 컨소시엄에서 제공 하는 자금으로 구입 했습니다. 우리는 또한 노스웨스턴 대학에서 다음 시설 감사: 켁 학 제 표면 과학 시설, 구조 생물학 시설, 생물 학적 영상 시설, 고급 분자 이미징 센터와는 분석 Bionanotechnology 장비 코어입니다. 이 연구는 국립 과학 재단 교부 금 1453576, 국가 학회 건강 감독의 새로운 혁신 상 1DP2HL132390-01, 재생 Nanomedicine 카 탈 수상 한 2014 맥코믹 카 탈 수상 센터에 의해 지원 되었다. SDA는 NIH predoctoral 생명 공학 교육 그랜트 T32GM008449에 의해 부분에서 지원 했다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate 스타터 키트 - 32 GB EditionCanaKitUPC 682710991511
선형 베어링 플랫폼 (작은) - 8mm 직경Adafruit1179
선형 모션 8 mm 샤프트, 330 mm 길이, 크롬 도금, 케이스 경화, 메트릭VXB키트11868
선형 레일 샤프트 가이드/지원 - 8 mm 직경Adafruit1182
수동 위치 정밀 슬라이드 4.5" 스트로크, 15lb 부하 용량McMaster-Carr5236A16
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC 모터Iron HorseMTPM-P10-1JK43
공식 Raspberry Pi Foundation 7" 터치스크린 LCD 디스플레이Raspberry PiB0153R2A9I(ASIN)
PicoBorg Reverse - Raspberry PiPiBorgBURN-0011
폴룰루 캐리어 샤프 GP2Y0D810Z0F 디지털 거리 센서 10cmPololu1134
Ruland PSR16-5-4-A 세트 스크류 빔 커플링, 광택 알루미늄, 인치, 5/16" 보어 A 직경, 1/4" 보어 B 직경, 1" OD, 1-1/4" 길이, 44 lb-in 공칭 토크RulandPSR16-5-4-A
폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르Sigma Aldrich202495
메탄설포닐 클로라이드시그마 알드리치471259
톨루엔시그마 알드리치179418
톨루엔, 무수시그마 알드리치244511
트리에틸아민시그마 알드리치T0886
셀라이트 545 (규조토)시그마 알드리치419931
디클로로메탄시그마 알드리치
디 에틸 에테르시그마 알드리296082
N, N- 디메틸 포름 아미드, 무수시그마 알드리치227056
탄산 칼륨시그마 알드리치791776
티오 아세트산시그마 알드리치T30805
테트라 하이드로 푸란시그마 알드리치360589
알루미늄 산화물, 중성, 활성화, Brockmann ISigma Aldrich199974
메톡시드 나트륨 용액, 메탄올 0.5M SigmaAldrich403067
프로필렌 설파이드Sigma AldrichP53209
아세트산Sigma AldrichA6283
메탄올Sigma Aldrich320390
수산화나트륨 용액 1.0NSigma AldrichS2770
내독소가 없는 물GE Healthcare Life SciencesSH30529.01
종이 pH 스트립,Fisher Scientific13-640-508
내독소가 없는 Dulbecco의 PBSSigma AldrichTMS-012
붕규산 유리 섬광 바이알Fisher Scientific03-337-4
1 mL 모든 플라스틱 주사기Thermo ScientificS75101
Sepharose CL-6BSigma AldrichCL6B200
액체 크로마토그래피 컬럼Sigma AldrichC4169
CIJ 믹서, HDPE맞춤형
Triton X-100Sigma AldrichX100
과산화수소 용액Sigma Aldrich216763
HEK-Blue hTLR4InvivoGenhkb-htlr4
RAW-Blue CellsInvivoGenraw-sp
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1
PYROGENT 겔 응고 LAL 분석LonzaN183-125
용 고급 모터 제어320269치 , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
  2. Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
  3. Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
  4. Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
  5. Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
  6. Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
  7. O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
  8. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  9. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302(2003).
  10. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  11. Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
  12. Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
  13. Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
  14. Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624(2018).
  15. Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
  16. Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
  17. Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
  18. Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Flash NanoprecipitationPolymer VesiclesBioactive Protein LoadingImmunostimulant DeliverySynthetic NanocarriersHigh Speed Syringe PumpConfined Impingement JetsDynamic Light ScatteringCryogenic Transmission Electron MicroscopyTangential Flow Filtration

관련 논문