난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

요약

난소 조직 문화 여 포 개발, 배 란, 그리고 여 포가 폐쇄 증의 모델로 사용할 수 있습니다 하 고 동적 난소 프로세스의 규제 메커니즘을 나타냅니다.

초록

포유류 암컷은 정기적으로 각 발 정기 주기 동안 oocytes의 거의 일정 한 수 배 란. 이러한 규칙과 주기 유지, 규정 hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 수준 및 난소에서 난 포 개발에 발생 합니다. 활성 연구에도 불구 하 고 여러 단계 휴면 원시 여 포 활성화에서 배 란을 및 각 소 낭 모양 단계에서 다른 규제 복잡성 때문에 여 포 개발 메커니즘이 명확 하지 않다. 여 포 발달의 기계 장치 그리고 발 정기 주기 낭의 역학 조사, 우리는 관찰 하는 현미경을 사용 하 여 여 포 개발 하는 데 사용할 수 있는 마우스 난소 조직 문화 모델을 개발 했다. 체계적인 여 포 개발, 정기 배 란 및 여 포가 폐쇄 증 모두 재생 될 수 있다 경작된 난소 모델에 그리고 문화 조건을 실험적으로 변조 될 수 있습니다. 여기, 우리 여 포 개발의 규제 메커니즘 및 다른 난소 현상의 연구에서이 방법의 유용성을 보여 줍니다.

서론

여성 마우스 난소 포함 몇 천 포¹, 그리고 주기적인 배 란 각 발 정기 주기에서 약 10 oocytes를 성숙. 낭 여러 발달 단계로 분류 됩니다: 원시, 기본, 보조, antral, 및 각 oocyte 둘러싸고 granulosa 세포 층의 형태에 따라 Graafian 낭. 대부분 원시 낭은 휴면, 그들 중 일부는 활성화 하 고 각 발 정기 주기²주 낭으로 성장. 보조 소 낭 모양 단계 후 여 포 개발은 주로 gonadotropins, follicular 자극 호르몬 (FSH)과 황 호르몬 (LH)에 의해 규제 됩니다. 그러나, 원시 및 기본 모 근 개발 생식 샘 자극 호르몬, 독립적 이며 이러한 단계를 제어 하는 규제 메커니즘 남아 제대로 inderstood^3,,45. 성장 인자와 호르몬, 원시 및 기본 여 포 여 포^6,7간의 상호 작용에 의해 통제 된다. 따라서, 우리가 마우스 난소 조직, 뿌리 역동성의 분석을 수행 하 고 난소 조직....

프로토콜

마우스는 23 ± 1 ° C 12 h 빛/12 h 어두운 사이클 환경 제어 실에서 보관 되어 있었다. 동물 보호 프로토콜 및 실험 아이치 의과대학에서 동물 실험에 대 한 지침에 따라 실시 했다 고 현 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.

1입니다. 배양 및 요리 준비

1. 기본적인 문화 매체를 준비 하려면 추가 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, 5 %v / v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL), 그리고 페니실린-스 (페니실린, 100 U/mL; 스, 100 mg/mL) 최소 필수 중간 알파 (MEM-알파)을 50 mL 튜브에 혼합.
   참고: 필요한 문화 미디어의 총 볼륨 실험, 사이 다르지만 문화 매체의 1 mL는 3.5 c m 유리 하단 문화 요리에 일반적으로 충분 합니다.
2. 3.5 c m 유리 하단 문화 요리에 혼합된 문화 매체의 1 mL aliquots를 부 어 하 고 요리에 장소 30 mm 셀 문화 삽입을 설정 합니다. 미리 따뜻한 미디어와 인큐베이터 (5% CO₂ 와 37 ° C)에서 요리.

2입니다. 난소 조직 준비

1. 미리 따뜻한 인산 염 (PBS) (−) 및 메모리-알파....

결과

그림 1 난소 조직 문화 중 미디어에서 변경에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다. 이 프로그램, 4 주 된 ICR 마우스 난소 배양 되었고 24 시간 간격으로 confocal 현미경 검사 법 (그림 2)를 사용 하 여 몇 군데. 3 주 동안 난소 조직의 문화, 동안 가장 antral 및 보조 모 공 여 포가 폐쇄 증으로 전락 했다 고 일부 ovulated (그림 2D 및 표 2) 했다. ImageJ (그림 3)를 사용 하 여 여 포 분야의 분석, 일부 낭 각 LH 서 지 주기 (그림 3B 와 보충 영화 1<.......

토론

이 연구에서 우리는 마우스 난소의 여 포 개발을 공부 하는 두 가지 새로운 방법 개발. 첫 번째 방법은 포함 한다 여 포 개발의 분석 뒤 슬라이스 난소 성인 쥐 조직의 문화 그리고 생식 샘 자극 호르몬 독립 단계 초기 여 포 개발을 시각화 하 시간 경과 화상 진 찰의 사용을 포함 하는 두 번째. 이전에 우리 여 포 개발^8,9, 백혈병 금지 요인 및 호르몬의 효과 평가 하기 위해 현재 난소 조직 문화 방법을 사용 하 고 그들의 효과 집중력과 뿌리 단 다 보여주었다. 현재 연구에서 전시 하는 난소 조직 뿌리 역학,이 모델을 사용 하 여 난소 여 포 개발 메커니즘의 분석을 더 보증 슬라이스.

5 주 이상의 쥐에서 난소에 신체 lutea의 현미경 관찰을 방해 하는 포함 되어 있습니다. 따라서, 4 주 된 마우스 난소 여 포 개발 및 배 란의 관찰에 대 한 선호는 하 고 이후의 늦은 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인간 뇌하수체의 난포 자극 호르몬	SIGMA	F4021
말 뇌하수체의 윤기 호르몬	SIGMA	L9773
페니실린-스트렙토마이신 용액	Wako Pure Chemical	Industries 168-23191
MEM a, GlutaMax, 뉴클레오티드 없음	Thermo Fisher	32561037
유리 바닥 접시	MatTek	P35G-0-10-C	35mm 접시, No. 0 커버슬립, 10mm 유리 직경
밀리셀 세포 배양 인서트	Merck Millipore	PICM0RG50	직경: 315mm, 기공 크기: 0.4mm, 재질: 친수성 PTTE
3.5cm 세포 배양 접시	Greiner Bio-one	627160
50ml / 원심분리기 튜브(트리플 씰 캡 포함	IWAKI	2345-050
로우 프로파일 일회용 블레이드 819	라이카	14035838925
LSM 710	칼 자이스		컨포칼 현미경
CellVoyager, CV1000	요코가와 전기 주식회사		타임랩스 이미징
BZ-X700	KEYENCE	타임랩스 이미징

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