이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

13.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57794

⸱

2018년 6월 19일

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Aichi Medical University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 3Department of Maternal and Perinatal Medicine, Nagoya University Hospital

이 논문에서

요약

난소 조직 문화 여 포 개발, 배 란, 그리고 여 포가 폐쇄 증의 모델로 사용할 수 있습니다 하 고 동적 난소 프로세스의 규제 메커니즘을 나타냅니다.

초록

포유류 암컷은 정기적으로 각 발 정기 주기 동안 oocytes의 거의 일정 한 수 배 란. 이러한 규칙과 주기 유지, 규정 hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 수준 및 난소에서 난 포 개발에 발생 합니다. 활성 연구에도 불구 하 고 여러 단계 휴면 원시 여 포 활성화에서 배 란을 및 각 소 낭 모양 단계에서 다른 규제 복잡성 때문에 여 포 개발 메커니즘이 명확 하지 않다. 여 포 발달의 기계 장치 그리고 발 정기 주기 낭의 역학 조사, 우리는 관찰 하는 현미경을 사용 하 여 여 포 개발 하는 데 사용할 수 있는 마우스 난소 조직 문화 모델을 개발 했다. 체계적인 여 포 개발, 정기 배 란 및 여 포가 폐쇄 증 모두 재생 될 수 있다 경작된 난소 모델에 그리고 문화 조건을 실험적으로 변조 될 수 있습니다. 여기, 우리 여 포 개발의 규제 메커니즘 및 다른 난소 현상의 연구에서이 방법의 유용성을 보여 줍니다.

서론

여성 마우스 난소 포함 몇 천 포1, 그리고 주기적인 배 란 각 발 정기 주기에서 약 10 oocytes를 성숙. 낭 여러 발달 단계로 분류 됩니다: 원시, 기본, 보조, antral, 및 각 oocyte 둘러싸고 granulosa 세포 층의 형태에 따라 Graafian 낭. 대부분 원시 낭은 휴면, 그들 중 일부는 활성화 하 고 각 발 정기 주기2주 낭으로 성장. 보조 소 낭 모양 단계 후 여 포 개발은 주로 gonadotropins, follicular 자극 호르몬 (FSH)과 황 호르몬 (LH)에 의해 규제 됩니다. 그러나, 원시 및 기본 모 근 개발 생식 샘 자극 호르몬, 독립적 이며 이러한 단계를 제어 하는 규제 메커니즘 남아 제대로 inderstood3,,45. 성장 인자와 호르몬, 원시 및 기본 여 포 여 포6,7간의 상호 작용에 의해 통제 된다. 따라서, 우리가 마우스 난소 조직, 뿌리 역동성의 분석을 수행 하 고 난소 조직 문화8,,910을 사용 하 여 관련된 규제 메커니즘을 조사 합니다.

여기, 두 개의 난소 조직 문화 모델 방법을 소개합니다. 첫 번째 follicular 분야의 측정에 의해 여 포 개발 분석 하 사용 되 고 두 번째는 유전자 변형 마우스 보조 뿌리 단계로 원시에서 초기 여 포 개발 하는 동안 규제 메커니즘을 연구 하는 데 사용 됩니다. 여 포 개발 분석, 우리가 주로 사용 4 주 오래 된 여성 쥐의 난소 낭의 쉽게 시각화를 허용 하기 때문에. 정기 배 란 및 모델 vivo에서 여 포 개발 유도, 우리 LH 서 지 및 관찰된 배 란, 여 포는이 폐쇄 증, 및 조직 배양 조건에서 estradiol의 분 비를 재현. 교양된 난소의 이미지 체포 되었다, 그리고 여 포 개발 프로세스 follicular 지역 변경 내용을 추적 하 여 분석 되었다. 그러나, 밝은 분야 현미경 검사 법 분석, 원시 및 초기 기본 모 공 사이의 구별 불분명 했다. 따라서, 우리 작은 낭을 감지 하 고 원시, 기본, 사이 구별 하는 방법을 개발 하 고 보조 뿌리에 배양 난소 조직을 사용 하 여 Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 그리고 0와 4 일 탄생11후 R26-H2B-mCherry 유전자 변형 쥐 난소. Oog1 식 oocytes에서 감지 감수 분열, 입국 후 고 주 낭 교양된 난소 조직의11 시간 경과 이미지를 사용 하 여 원시에서 전환의 관찰 수 있도록 뿌리 발달로 점차 증가 ,12. 형태학 상 방법을 휴면 원시 낭13,14,,1516활성화 요인 연구에 사용 되었습니다, 하지만 난소에 생리 여 포 개발은 관찰 하기 어려운 다양 한 요인의 효과 유지 새롭거나. 현재 문화 방법 실시간으로 분석 대상 요소의이 부족을 해결 하기 위해 설계 되었습니다.

현재 연구에서 우리가 follicular 개발 시간 경과 화상 진 찰 방법을 사용 하 여 추적 하 고 여 포 개발 과정 특징. 우리의 소설 메서드는 전례 없는 난소의 생리학을 조사 하기 위한 도구를 제공 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

마우스는 23 ± 1 ° C 12 h 빛/12 h 어두운 사이클 환경 제어 실에서 보관 되어 있었다. 동물 보호 프로토콜 및 실험 아이치 의과대학에서 동물 실험에 대 한 지침에 따라 실시 했다 고 현 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.

1입니다. 배양 및 요리 준비

  1. 기본적인 문화 매체를 준비 하려면 추가 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, 5 %v / v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL), 그리고 페니실린-스 (페니실린, 100 U/mL; 스, 100 mg/mL) 최소 필수 중간 알파 (MEM-알파)을 50 mL 튜브에 혼합.
    참고: 필요한 문화 미디어의 총 볼륨 실험, 사이 다르지만 문화 매체의 1 mL는 3.5 c m 유리 하단 문화 요리에 일반적으로 충분 합니다.
  2. 3.5 c m 유리 하단 문화 요리에 혼합된 문화 매체의 1 mL aliquots를 부 어 하 고 요리에 장소 30 mm 셀 문화 삽입을 설정 합니다. 미리 따뜻한 미디어와 인큐베이터 (5% CO2 와 37 ° C)에서 요리.

2입니다. 난소 조직 준비

  1. 미리 따뜻한 인산 염 (PBS) (−) 및 메모리-알파 5 %FBS, 100 U/mL 페니실린 그리고 인큐베이터 (5% CO2 와 37 ° C)에서 100 mg/mL 스 버퍼링.
    참고: 약 3 mL 난소 당 aliquots PBS (−)의 사용에 대 한 충분 한 난소 해 동안 되며 MEM-알파의 1 mL aliquots는 3.5 cm 요리에서 단일 난소의 일시적인 저장을 위해 충분 한.
  2. 4 주 오래 된 여성 (후 암 연구소 라는) ICR 마우스에서 난소를 소비 세와 손질가 위 핀셋 입체 현미경을 사용 하 여 난소를 둘러싼 조직. 예약 문화 매체의 제거 난소 (단계 2.1 참조) 사용까지.
    1. 필터 종이에 단일 난소 적신 장소는 PBS (−)에 미리 예 열 (단계 2.1 참조)와 입체 현미경 톰 블레이드를 사용 하 여 4 조각으로 조각.
      참고: 4 주 오래 된 ICR 생쥐의 난소는 지름 약 2 m m. 조각의 수; 난소 크기에 따라 달라 집니다. 그러나, 약 500 µ m 두꺼운 조각 적절 한 뿌리 관찰에 대 한 허용 (500 m m 보다 두꺼운 조각, 조직 투명도 감소; 500 m m 보다 얇은 조각, 많은 antral 낭은 깨진 손실).
    2. 해 부, 후 슬라이스 난소 표본 3.5 cm 요리 (단계 2.1 참조) 미리 데워 진된 문화 매체에 놓습니다.

3. 난소 조직 문화

  1. 난소 조직에 셀 문화 삽입 슬라이스 난소 조직 될 것입니다 약 0.5 µ L 당 문화 매체의 삭제는 micropipette를 사용 하 여 설정.
  2. 문화 매체 핀셋을 사용 하 여 셀 문화 삽입에의 한 방울으로 각 슬라이스 견본을 놓습니다.
  3. 37 ° c.에 5% CO2 난소 조직 문화
  4. 2 일 마다 신선한 미리 따뜻하게 매체와 문화 매체를 교체 합니다.
    참고: 4 주 오래 된 ICR 마우스에서 난소 섹션의 문화에 대 한 중간 변경 내용에 대 한 일정은 그림 1에 표시 됩니다.
    1. LH 큰 파도 재현 하려면 (그림 1) 4 일 마다 100 mU/mL FSH 및 LH 12 h를 포함 하는 매체와 교양된 4 주 오래 된 ICR 마우스 난소를 취급 합니다.

4. 현미경 이미지 교양된 난소의

  1. 교양된 난소 조직 세포 문화 삽입에 준수는 때 1 일 후 이미징 시작 하 고 시간 점 사이 충분 한 뿌리 성장 수 있도록 24 시간 간격 또는 거꾸로 confocal 현미경 분석을 수행.
    참고: Confocal 현미경 검사 법은 거꾸로 현미경 관찰 전체 교양된 난소 여 포에 대 한 우수.

5. 시간 경과 영상 교양된 난소의

  1. 레이저 농도 및 노출 시간, 이미징 시스템 (표 1)를 포함 하 여 시간 경과 이미징 조건 최적화.
    1. 치료 및 제어 그룹으로 사용 하기 위해 단일 마우스에서 쌍된 난소 견본을 선택 합니다. 레이저 농도 노출 시간 (표 1) 최고의 이미지를 달성 하기 위해 변화 한다.
    2. 각 문화 조건 하에서 여 포 성장 뿌리 지역 24 시간 간격 제어 샘플의 이미지와 시간 경과 영상 샘플 (6 단계 참조)를 측정 하 여 비교 합니다. 동시에, 각 난소 세트에서 ovulated oocytes의 수를 계산 하 고 최적의 시간 경과 이미징 조건을 선택 합니다.
  2. 30 분 간격으로 결정된 조건 (표 1)에서 시간 경과 이미징 시스템을 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오.

6. 여 포 성장 분석

  1. 여 포 개발 분석, ImageJ 소프트웨어 (http://resbweb.nih.gov/ij/)를 사용 하 여 캡처한 이미지에 뿌리 영역을 측정 합니다.
    1. 처음에, 도구 모음에서 "분석" 아래 "비율 설정"을 클릭 하 여 이미지의 규모를 설정 합니다. "알려진 거리"와 "픽셀에서 거리"의 빈 필드에는 캡처된 이미지와 픽셀의 해당 번호의 측면 길이 각각 입력 합니다.
    2. 도구 모음에서 "자유 재량"를 클릭 하 고 캡처된 밝은 필드 이미지에 낭 개요.
    3. 도구 모음에서 "분석"에서 "측정"을 클릭 합니다.
      참고: 다른 측정 데이터를 원하는 경우 "측정" "분석" 아래에서 설정 도구 모음을 클릭 하 고 목록에서 적절 한 확인란.

7. 유전자 변형 쥐를 사용 하 여 여 포 개발의 분석

  1. 출생 후 일 0과 4 (P0, P4) 여성 유전자 변형 쥐를 포함 하는 transgenes Oog1pro3.9 및 R26-H2B-mCherr, 그리고 삽입에서 문화에 설명 된 대로 단계 1.1-3.2, 하지 않습니다 제외 하 고 슬라이스는 P0, P4 난소에서 난소를 수집 합니다.
  2. 매 2 일 37 ° C에서 5% CO2 를 포함 하는 인큐베이터에서 3.5 cm 요리에 신선 하 고, 미리 데워 진 매체와 문화 매체를 교체 합니다.
    참고: P0, P4 난소의 문화 매체에서 LH의 농도 수 일정 남아 있다 P0, P4 쥐에 LH 서 지 발생 하지 않기 때문에.
  3. 교양된 P4 난소 (표 1)에 AcGFP1 양성 주 낭을 시각화 하기 위해 현미경을 설정 합니다.
    참고:만 원시 및 기본 모 공은 P4 여성 마우스 난소에 존재 한다.
  4. 교양된 P0 Oog1pro3.9의 이미지를 캡처 / 30 분 간격R26-H2B-mCherry 유전자 변형 쥐 난소 P4 난소 (단계 5.2 참조)에 사용 되는 설정을 사용 하 여.
  5. 추적 하 고 분석 하는 AcGFP1 및 H2B mCHerry 신호를 사용 하 여 여 포 개발.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

그림 1 난소 조직 문화 중 미디어에서 변경에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다. 이 프로그램, 4 주 된 ICR 마우스 난소 배양 되었고 24 시간 간격으로 confocal 현미경 검사 법 (그림 2)를 사용 하 여 몇 군데. 3 주 동안 난소 조직의 문화, 동안 가장 antral 및 보조 모 공 여 포가 폐쇄 증으로 전락 했다 고 일부 ovulated (그림 2D 및 표 2) 했다. ImageJ (그림 3)를 사용 하 여 여 포 분야의 분석, 일부 낭 각 LH 서 지 주기 (그림 3B 와 보충 영화 1<...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 연구에서 우리는 마우스 난소의 여 포 개발을 공부 하는 두 가지 새로운 방법 개발. 첫 번째 방법은 포함 한다 여 포 개발의 분석 뒤 슬라이스 난소 성인 쥐 조직의 문화 그리고 생식 샘 자극 호르몬 독립 단계 초기 여 포 개발을 시각화 하 시간 경과 화상 진 찰의 사용을 포함 하는 두 번째. 이전에 우리 여 포 개발8,9, 백혈병 금지 요인 및 호르몬의 효과 평가 하기 위해 현재 난소 조직 문화 방법을 사용 하 고 그들의 효과 집중력과 뿌리 단 다 보여주었다. 현재 연구에서 전시 하는 난소 조직 뿌리 역학,이 모델을 사용 하 여 난소 여 포 개발 메커니즘의 분석을 더 보증 슬라이스.

5 주 이상의 쥐에서 난소에 신체 lutea의 현미경 관찰을 방해 하는 포함 되어 있습니다. 따라서, 4 주 된 마우스 난소 여 포 개발 및 배 란의 관찰에 대 한 선호는 하 고 이후의 늦은 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

박사 Naojiro 미나미 (교토대학)는 Oog1pro3.9 마우스를 제공 하는 감사 합니다. 이 연구는 JSP (KAKENHI # JP15H06275)와 닛토 재단에 의해 지원 되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인간 뇌하수체의 난포 자극 호르몬SIGMAF4021
말 뇌하수체의 윤기 호르몬SIGMAL9773
페니실린-스트렙토마이신 용액Wako Pure ChemicalIndustries 168-23191
MEM a, GlutaMax, 뉴클레오티드 없음Thermo Fisher32561037
유리 바닥 접시MatTekP35G-0-10-C35mm 접시, No. 0 커버슬립, 10mm 유리 직경
밀리셀 세포 배양 인서트Merck MilliporePICM0RG50직경: 315mm, 기공 크기: 0.4mm, 재질: 친수성 PTTE
3.5cm 세포 배양 접시Greiner Bio-one627160
50ml / 원심분리기 튜브(트리플 씰 캡 포함IWAKI2345-050
로우 프로파일 일회용 블레이드 819라이카14035838925
LSM 710칼 자이스컨포칼 현미경
CellVoyager, CV1000요코가와 전기 주식회사타임랩스 이미징
BZ-X700KEYENCE타임랩스 이미징
)

참고문헌

  1. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  2. Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
  3. Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
  4. Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
  5. Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
  6. Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
  7. Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
  8. Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18(2015).
  9. Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
  10. Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
  11. Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686(2013).
  12. Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
  13. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
  14. Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
  15. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
  16. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
  17. Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
  18. Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
  19. Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
  20. Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

ImageJFSH LHmCherry
난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.