효율적인 정화와 10-11 전-2 5-Methylcytosine Dioxygenase에 대 한 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발

요약

여기, 우리는 활성 태그 인간의 효율적인 단일 단계 정화에 대 한 프로토콜 10-11 전 2 (TET2) 제시 5-methylcytosine dioxygenase 이온-교환 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피 탠덤 질량을 사용 하 여 그 분석 결과 사용 하 여 분석 (LC-MS/MS)-기반 접근.

초록

5-methylcytosine (5mC)에 의해 중재 후 전사 조절 핵 개발에 중요 한 역할을 담당해 왔습니다. 이 후 성적인 표의 demethylation thymine DNA glycosylase 종속 기본 절단 복구 뒤 10-11 전 dioxygenases (TET1-3)에 의해 계속적인 산화에 의해 수행 됩니다. 유전 돌연변이 또는 다른 후 성적인 기계 장치에 의해 TET2 유전자의 비활성화 다양 한 암, 특히 조 혈 악성 종양을 가진 환자에 있는 빈약한 예 지와 연결 됩니다. 여기, 양이온 교환 크로마토그래피를 사용 하 여 태그 한 인간 효소 활성 TET2 dioxygenase의 효율적인 단일 단계 정화를 설명 합니다. 우리는 더 분리 하 고 4 개의 수정된 시 토 신 기초 (5-메 틸, 5-hydroxymethyl 일까 지, 5 formyl 그리고 5-carboxyl) 뿐만 아니라 (A, T, G와 C), 4 개의 정상적인 DNA 기초를 정할 수 있는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 접근을 제공 합니다. 이 분석 결과 야생 유형 및 돌연변이 TET2 dioxygenases의 활동을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

서론

CpG 디 내에서 시 토 신 기지의 C5 위치는 포유류 유전자¹에 주된 메 틸 화 사이트 (5mCpG)입니다. 또한, 최근 연구 된 광범위 한 C5 시 토 신 메 틸 화 (5mC) 비 CpG 사이트에서 발견 (5mCpH, 어디 H = A, T, 또는 C)^2,3. 5mC 수정 생 retrotransposons 및 유전자 발기인^3,,45에 transcriptional 소음 기 역할을 합니다. 5mC에서 DNA 메 틸 화는 또한 X 염색체 비활성화, 유전자 각 인, 핵 프로그래밍 및 조직 관련 유전자 식^5,,67에 중요 한 역할을 재생합니다. C5 위치에서 시 토 신 메 틸 화 DNA methyltransferases에 의해 수행 됩니다 그리고이 효소에 돌연변이 발생할 상당한 발달 결함^8<....

프로토콜

1. 복제 및 태그 인간 TET2 Dioxygenase의 정화

1. 앞에서 설명한²²으로 사이트별 재조합 기술을 사용 하 여 pDEST14 대상 벡터에 인간 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843) 복제.
   참고: 이전 연구 C 터미널 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843) 도메인은 최소한의 촉매로 활성 도메인^21,23증명 하고있다. PDONR221 벡터를 사용 하 여 태그 TET2 dioxygenase 도메인을 표현 하기 위하여 빛나는 Dalgarno 및 Kozak 시퀀스는 PCR (표 1) 중 앞으로 뇌관에 통합 했다.
2. 세균성 변환에 대 한 추가 태그가 인간 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843)의 화학적으로 유능한 대장균 100 µ L 포함 하는 재조합 pDEST14 식 벡터의 1 µ L BL21 (DE3) 셀 1.7 mL 튜브에. 30 42 ° C에서 열 충격 이어서 적어도 15 분 동안 얼음에 혼합물을 계속 물 욕조에 s.....

결과

TET 가족 dioxygenases에 의해 DNA에 5mC의 동적 수정 epigenetic transcriptional 규칙에 중요 한 역할을 담당합니다. TET2 dioxygenase는 다양 한 조 혈 악성 종양¹²자주 변경 됩니다. 일반 개발 및 질병 TET2 효소의 역할을 조사, 우리 pDEST14 벡터²²에 어떤 선호도 태그를 하지 않고 최소한의 촉매로 활성 도메인을 복제 있다. 태그 TET2 dioxygenase 총 수용 성 단백질의 ∼5 %SDS 페이지 분석 박테리아에 의해 제작 되었다 대장균 BL21 (DE3) 세포. 때문에 TET2의 촉매 도메인은 대부분 원주민 대장균 단백질^{24,25,.......}

토론

TET2 유전자에 있는 돌연변이 다양 한 조 혈 악성 종양 환자에서 가장 많이 검색 된 유전자 변화입니다. 말도, 프레임 이동 및 missense 돌연변이 포함 하는 다른 TET2 돌연변이의 수백까지 환자¹²에서 확인 되었습니다. TET2 돌연변이 가진 환자 wt-TET2¹⁴와 그에 비해 골에서 게놈 5hmC의 낮은 레벨을 표시 합니다. 실험 노크에서 돌연변이 TET2 transfected 세포¹⁴5hmC 수준에이 돌연변이의 효과 지 있다. TET2-녹아웃 마우스 모델에서 결과 시연 TET2 효소의 수준은 반비례 조 혈 악성 종양^17,,1819,20

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HEPES	Carbosynth	FH31182
철 (II) 황산염 헵타 하이드레이트	Sigma-Aldrich	F8633
α - 케토 글루타르산 (2- 옥소 글루타르산)	Sigma-Aldrich	K1750
L- 아스코르브 산	Sigma-Aldrich	A4544
에틸렌 디아민 테트라 아세트산 디 소듐 염 수화물	Sigma-Aldrich	E5134
암모늄 아세테이트	시그마-알드리치	A1542
아세토니트릴	피셔 사이언티픽	75-05-8
HPLC 등급 물	피셔 사이언티픽	7732-18-5
올리고 클린 및 농축기	자이모 리서치	D4061
DNAse I	New England Biolabs	M0303S
S1 뉴클레아제	Thermo Scientific	ENO321
CIAP(송아지 장 알칼리 포스파타아제)	New England Biolabs	M0290S
LB Media	Affymetrix	J75852
IPTG	Carbosynth	EI05931
MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]	Carbosynth	FM37015
	Sodium chloride Fisher Scientific	7647-14-5
글리세롤	시그마-알드리치	G7893
SP 세파로스	피셔 사이언티픽	45-002-934
2'-데옥시-5-메틸시티딘	TCI	D3610
2'-데옥시-5-하이드록시메틸시티딘	TCI	D4220
2'-데옥시시티딘-5-카르복실산, 나트륨 소금	베리 & 앰프; 어소시에이츠	PY 7593
5-포르밀-2'-데옥시시티딘	베리 & 어소시에이츠	PY 7589
2'-데옥시시티딘	베리 & Associates	PY 7216
2'-Deoxyadenosine	Carbosynth	ND04011
2'-Deoxyguanosine	Carbosynth	ND06306
2'-Deoxythymidine	VWR Life Science	97061-764
Gateway technology	Thermo Fisher	11801016
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