Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

요약

특정 RNA 순서 묶는 단백질 유전자 발현에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 바인딩 사이트의 상세한 특성은 유전자 규칙의 우리의 이해를 위해 중요 합니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis에 대 한 단일-단계 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 모든 단백질 바인딩 사이트 RNA에 대 한 관련입니다.

초록

유전자 규칙 개발에 중요 한 역할을 한다. 수많은 DNA과 RNA 의무적인 단백질 높은 특이성 유전자 발현 제어를 가진 그들의 대상 시퀀스를 바인딩합니다. 이러한 규제 단백질 유전자 발현 DNA (전사)의 수준에서 또는 RNA (이전 mRNA 접합, polyadenylation, mRNA 전송, 부패, 및 번역)의 수준에서 제어합니다. 식별 규제 시퀀스의 유전자가 켜거나 전환 뿐만 아니라 또한 어떤 다운스트림 유전자 규정 하는 특정 단백질에 의해 통제 된다 이해 하는 데 도움이 됩니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

서론

유전자 규칙 생물학에 있는 중요 한 역할을 한다. 유전자의 전사 사전 mRNA 접합, 3' 끝, RNA 수출, 번역, mRNA 지 방화, 붕괴, 포스트 번역 상 수정/안정성, 등 모두 DNA과 RNA 의무적인 단백질 유전자에 핵심 역할 수준에서 통제 될 수 있다 규칙입니다. 수많은 규제 단백질 식별 분자 유전 분석, 하는 동안 그들의 작은 하위 집합만 그들의 세포질 기능 또는 바인딩 사이트 비보완전히 특징 되어 있다. 계통 발생 시퀀스 분석과 mutagenesis DNA 또는 RNA 단백질 상호 작용의 특성을 상호 보완적인 접근을 제공 합니다.

RNA-바인딩 단백질은 성적인 감 별 법을 포함 하 여 개발 프로세스에서 중요 한. 섹스-치명적인 (SXL) 초파리 단백질 또는 마스터 섹스-스위치 단백질은 결 석 남성, 여성에서 현재에. Uridine-풍부한 시퀀스 또는 pyrimidine 책자 다운스트림 사전 mRNA 목표 (변압기, 치명적이 지 섹스, 남성 전용 lethal2) 체세포^{1,2에서에서 특정 스플라이스 사이트에 인접 한 인식 ,,34}. 또한, 그것은 기초의 증강 (e(r)) 사본^5,6uridine 풍부한 polyadenylation 증강 시퀀스에 바인딩하여 스위칭 polyadenylation 사이트 조절. SXL 가능성이 조절 되도록 남아 있는 여성 생식에 추가 대상 확인^{1,7,,89,,1011, 12 , 13}.

일반적으로, 바인딩 사이트의 특성을 포함 한다 mutagenesis를, 예를 들어 삭제 또는 단일 또는 여러 개의 뉴클레오티드의 대체. 야생-타입 RNA 순서를 기준으로 각 돌연변이 바인딩 사이트 다음 바인딩 선호도 결정 하기 위해 일련의 단백질 농도 사용 하 여 분석 (K_d 또는 평형 분리 상수); 관심사의 단백질에 대 한 K_d 50 %RNA 바인딩을 얻을 하는 데 필요한 단백질 농도 이다. 자세한 mutagenesis의이 노동 집약적인 과정 포함 세대 및 수많은 돌연변이의 분석-3 야생 타입 뉴클레오티드 바인딩 사이트에 있는 각 위치에 대 한. 따라서, RNA에 단백질 의무 사이트의 빠르고, 쉽고, 저렴 한 포화 mutagenesis에 대 한 다른 접근 방법에 대 한 필요가 있다.

여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

프로토콜

참고: 그림 1 phosphorothioate mutagenesis에 대 한 개요를 제공 하 고 프로세스의 주요 단계를 요약.

1. 돌연변이 체의 도서관의 세대-야생 타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑

1. T7 뇌관 종합 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') 화학 합성 DNA 합성기에 의해.
2. 화학 합성 단백질 바인딩 사이트에 해당 하는 DNA 합성기에 의해도 핑된 oligonucleotide (보완 가닥) 음성 합성. 야생 타입 뉴클레오티드 (참조 대 한 자세한 내용은이 비율에 대표적인 결과)로 10 %T 90 %A 야생-타입 뉴클레오티드의 비율로 핑 X (아래)의 각 사이트에 대 한 화학 합성 하는 동안 phosphoramidites의 적절 한 혼합을 사용 합니다.
   참고: 여기,도 핑된 oligonucleotide의 순서는 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTG참조CTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. 밑줄이 그어진된 순서는 SXL 단백질 바인딩 사이트, 플러스 로드 컨트롤 되 고 뿐만 아니라, RNA에 모든 변경 영향을 확인 하는 유용한 컨트롤을 제공 하는 바인딩 사이트 밖에 서 추가 뉴클레오티드의 역방향 보완 비교 그리고 뉴클레오티드 바인딩 사이트 내에서 정상화. SXL 바인딩 사이트 시퀀스에에서 존재 하는 변압기 중 mRNA^14,15,,1617, UUUUUGUUGUUUUUUUU 제안 된 방법론을 고안 하 사용 되었다. 기울임꼴로 시퀀스 T7 뇌관 순서에 무료 이며 생체 외에서 전사의 T7 발기인.

2입니다. RNA의 합성

1. 앞에서 설명한¹⁸으로 20 µ L 녹음 방송 반응에서 RNA를 음성 합성.
   1. 믹스 T7 전사 버퍼와 1 µ M T7 oligonucleotide, 1 µ M 실수로 oligonucleotide, 10 m m dithiothreitol (DTT) 2mm GTP, 1 mM 각 ATP, CTP, UTP (guanosine, 아데노신, cytidine, 및 uridine 3 인산 염), 그리고 2 U / µ L T7 RNA 중 합 효소.
   2. 추가, 두 개의 별도 microcentrifuge 튜브 0.167 m m α-thio ATP 또는 0.05 m m α-thio UTP RNAs에 phosphorothioates (회로도 그림2에서 참조)을 통합 하.
      참고: 다른 프로토콜에 대 한도 핑된 oligonucleotide 뉴클레오티드 대체 남은 두 테스트를 포함 하는 적절 한 녹음 방송 반응에 0.2 m m α-thio CTP 또는 0.2 m m α-thio GTP를 추가 합니다.
   3. 2 h 37 ° c.에 대 한 RNA 합성 반응 혼합물을 품 어
2. RNA 샘플을 2.5 µ L 열 정한 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 2.5 µ L 10xphosphatase 버퍼를 추가 합니다. 5' 인산 염 제거를 37 ° C에서 10-30 분이 25 µ L 반응을 품 어.
3. 2-5 분 동안 80 ° C에 난방에 의해 알칼리 성 인산 가수분해 효소 효소 비활성화.
4. Dephosphorylated RNA의 5' 끝 radiolabel (5 pmole) 1 µ L T4 polynucleotide 키 니 아 제 1 µ L γ-³²P ATP 10 µ L 반응 볼륨에서을 사용 하 여. 37 ° c.에 30-60 분에 대 한 반응 혼합을 품 어
5. 20-30 분 동안 65 ° C에서 난방에 의해 T4 polynucleotide 키 니 아 제 효소 비활성화.
6. 젤 전기 이동 법 polyacrylamide 젤을 변성 시키기 10%에 의해 RNA를 정화. Autoradiography 하 여 젤에 RNA를 찾습니다. 소비 세 포함 된 방사선된 RNA 젤 슬라이스, 피 펫 팁, 벽에 눌러 microcentrifuge 튜브에 크 러시와 가수분해 K (PK) 버퍼 (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 m m EDTA, 150 mM NaCl, 1% 나트륨 라우릴 황산 염)에 담근 다. 하룻밤에 2 h에서 실내 온도에 튜브를 회전 합니다.
7. 원심 젤 슬러리, 젤 삭제 및 버퍼 솔루션을 수집 합니다.
8. 페 놀-클로 프롬의 같은 볼륨으로 두 번 그리고 한 번 클로 프롬 솔루션을 추출 하 고 수성 단계를 수집 합니다.
9. 아세트산 나트륨, pH 5.2, 캐리어 3 M의 수성 단계 0.1 볼륨에 추가 tRNA 또는 glycogen, 그리고 에탄올의 2.5 볼륨. 1 h-80 ° C에서 샘플을 유지.
10. 16,873 x g에서 고속 microcentrifuge에서 5-10 분 샘플 원심 RNA 펠 렛을 방해 하지 않고 버퍼/에탄올 솔루션을 신중 하 게 제거 합니다.
11. 70% 에탄올과 펠 릿을 세척 하 고 신중 하 게 2-5 분 제거 에탄올에 대 한 원심. 건조 한 공기에 있는 펠 릿.
12. 20-50 µ L diethyl pyrocarbonate (DEPC)에서 펠 릿 resuspend-물 처리. -20 ° C에서 사용까지 저장 합니다.
    참고: 방사선된 RNA 방사능 으로부터 보호 하기 위해 적절 한 예방 조치 및 플 렉 시 유리 방패를 사용 하 여 모든 단계를 수행 합니다. 현재, 스핀 열 RNA의 젤 정화 대 안으로 비법 인된 방사능, 더 일반적으로 사용 되 고 더 편리 하 게 제거 하는.

3. 단백질 바인딩 반응 및 바인딩된 RNA의 분리

1. 에 있는 재조합 형 단백질을 표현 하 고 대장균에서 정화.
2. 분 광 광도 법에 의해 또는 알려진된 단백질 기준, 둔감 한 혈 청 알 부 민 (BSA) 옆 SDS polyacrylamide 젤에서 분리 하 여 재조합 단백질 농도 견적 한다. 얼룩이 Coomassie 화려한 블루 R-250와 젤 여 관심과 표준 BSA의 단백질을 시각화. 알려진된 양의 BSA 희석 동일한 젤에 비해 단백질 quantitate
   참고: 저장에서-80 ° C까지 사용 하 고 20 m m 4-(2-Hydroxyethyl) 희석 piperazine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES), pH 8.0, 1 m m dithiothreitol (DTT), 재조합 단백질 0.2 m m Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 0.05 %NP-40, 20% 글리세롤. 사용 0.5-1.0 m m 프로 테아 제 억제 물 phenylmethane sulfonyl 불 (PMSF)는 선택 사항입니다.
3. 10 mM Tris HCl, pH 7.5에에서 RNA 바인딩 반응 (20-100 µ L) 수행, 0.09 µ g / µ L 소 혈 청 알 부 민, 1 mM EDTA, 0.15 µ g / µ L acetylated 1mm DTT, 50mm KCl, 0.5 단위 / µ L RNase 억제제, tRNA, 5'-끝 방사선 RNA, 그리고 적절 한 농도 (a의 6 µ L 농도는 RNA의 50%는 단백질을 바인딩합니다) 단백질의.
   참고:이 바인딩 버퍼 3 RNA-바인딩 단백질에 대 한 작동 (SXL, U2AF⁶⁵, 및 PTB), 그러나 관심사의 단백질에 대 한 표준화 해야 합니다. 약 50%를 얻을 하는 데 필요한 특정된 단백질 준비에 대 한 다양 한 희석을 사용 하 여 실험적으로, 단백질 농도 추정 RNA 바인딩. 이 조건 또는 K_d RNA 바인딩 곡선의 가장 민감한 부분을 나타냅니다.
4. 단백질 바인딩 반응 (또는 얼음) 25 ° C에서 20-30 분 동안 품 어.
5. 두 가지 방법 중 하나를 사용 하 여 언바운드 분수에서 단백질 바인딩 RNA 분수를 구분:
   1. Nitrocellulose 필터 바인딩
      1. 실 온에서 진공 매니폴드에 연결 nitrocellulose 필터에 바인딩 반응 (20-100 µ L)를 적용 합니다.
         참고:만 RNA-단백질 복잡 한 필터에 유지 하 고 필터를 통해 RNA 흐름을 언바운드. 필터 바인딩 접근 바운드 RNA의 높은 복구 수 이며 빠르고 간단 하 게, 젤 기동성 교대 분석 실험에 비해. DEAE 막 nitrocellulose 필터 아래에 배치 하 여 언바운드 RNA 분수 수집 또는 바운드 분수와 함께 비교에 대 한 RNA를 무료 수 이기도 합니다.
      2. Nitrocellulose 필터를 포함 하는 유지의 부분 microcentrifuge 튜브에 맞게 더 작은 조각으로 방사성 RNA 필터 조각 몰입할 충분 한 PK 버퍼 (300-500 µ L 포함 10-20 µ g PK)에 담가 잘라내어 필터에서 RNA elute 2-3 h 또는 하룻밤.
      3. 페 놀-클로 프롬, 클로 프롬로 추출 하 고 수집 수성 단계. 추가 나트륨 아세테이트, 에탄올, 냉장고에 부 화 한 후 원심, 세척, 건조 하 고 resuspend DEPC 처리 한 물에 RNA. 2.10에 2.14 위의 단계에서 설명한 대로 다음이 단계를 따릅니다.
   2. 젤 기동성 교대
      1. 준비 하 고 5% 기본 polyacrylamide 젤 유해 (후 60: 1 Acrylamide:bis-아크릴) 0.5에서 필터 바인딩 방법 하는 대신 바인딩 반응 시작 하기 전에 x TBE (표준 트리 스-Borate-EDTA 버퍼).
      2. 미리 콜드 룸 (4 ° C)에서 250 V 15 분 젤을 실행 합니다.
      3. 위의 사전 실행된 젤의 별도 우물으로 각 바인딩 반응 (위)를 로드 합니다.
         참고: 단백질 저장 버퍼 샘플 로드 웰 스에 대 한 충분 한 글리세롤을 제공 한다.
      4. 단백질 바인딩 RNA 젤 전기 이동 법 특정 단백질 및 RNA 크기에 따라 1 ~ 2 h에 대 한 250 V에서 차가운 방에 구분 합니다.
      5. Autoradiography 하 여 젤에 RNA-단백질 복합체의 위치를 찾습니다. RNA-단백질 복합물을 포함 하는 젤 슬라이스 삭제하시오 젤 조각 분쇄 하 고 PK 버퍼에 몸을 담글 하 여 젤 조각에서 RNA을 elute.
      6. 페 놀-클로 프롬, 클로 프롬로 추출 하 고 수집 수성 단계. 나트륨 아세테이트, 에탄올, 냉장고에 부 화 한 후 원심, 세척, 건조, 공기 더하고 DEPC 처리 한 물에 RNA를 resuspend. 2.10에 2.14 위의 단계에서 설명한 대로 다음이 단계를 따릅니다.

4. 돌연변이 뉴클레오티드 위치 검출을 위한 요오드 죽 습 Phosphorothioate 제품의 분석

1. 20 µ L DEPC 처리 물 포함 최대 10 µ g 캐리어에에서 1mm 요오드를 추가 RNAs (바운드 및 총 RNAs) phosphorothioate 관의 사이트에서 다니엘에 tRNA. 5 분 동안 실 온에서 품 어.
   참고: 요오드 분열 약간 다른 조건에 세부 사항 더-7% (v/v) iodoethanol, 3 분 동안 95 ° C에서 난방-Gish & 엑스 타인과 1988¹⁹에서 찾을 수 있습니다.
2. 위에서 설명한 대로 추가 나트륨 아세테이트/에탄올, 쪼개진된 RNA 침전. 젤을 변성 시키기 위한 로드 염료에 resuspend. 열 및 RNA 조각에 15-20% 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법으로 분리 하는 샘플을 로드 합니다.
3. 노출 x-선 필름 polyacrylamide 젤.
4. 총 풀 autoradiography를 사용 하 여 대 바인딩된 분수 밴드를 감지 합니다.
   참고: 배기 후드에 요오드와 모든 단계를 수행 합니다. 여기에 표시 된 RNA 분리,이 젤의 하단에 추가 인치 긴 스페이서를 삽입 하 여 젤 접시의 하단에 두 스페이서의 두께 두 배로 얻을 수 있다 쐐기 모양의 젤 채택 된다. 이 모양은 짧은 RNA 파편 사이 더 균일 한 또는 더 가깝게 간격을 허용 한다. 또는, 검색 및 방사능의 정량에 대 한 x 선 필름 보다는 phosphorimager는 사용할 수 있습니다.

결과

도 핑을 사용 하 여 포화 mutagenesis의 원리:

야생-타입 및 다른 뉴클레오티드의 적절 한 어 금 니 비율을 분석 하는 것입니다 한 위치 하는 경우에 모든 4 개의 뉴클레오티드의 동등한 혼합물을 사용 합니다. 그러나, 그러므로 동시에 여러 위치를 분석 비율의 비-야생 타입 야생-타입 뉴클레오티드를 조정 해야 합니다, 즉, 감소. 그렇지 않으면,이 하나의 대체 뿐만 아니라 있을 것입니다 또한 단일 뉴클레오티드 대체의 효과의 분석을 제외 하는 분자에 여러 야생 타입 뉴클레오티드와 함께 서식 파일. 따라서, 엄지손가락의 규칙으로 사용 비율의 비-야생 타입 1/n의 야생-타입 뉴클레오티드를 여기서 n은 분석을 위치 수입니다. 여기, 우리가 분석 10 위치 동시에 야생-타입 뉴클레오티드의 90%와 10%의 DNA 템플렛을도 핑에 대 한 야생 타입 뉴클레...

토론

Mutagenesis은 긴 단백질 바인딩 사이트 특성에 사용 되었습니다. 첫째, 돌연변이의 시리즈 구성 하 고 바인딩 바인딩 선호도에 미치는 영향을 분석 하는 분석에서 개별적으로 테스트 될 수 있습니다. 기준이 mutagenesis 접근 여러 시퀀스를 분석 하는 방법을 제공 하는 동안 여러 단계 돌연변이 구성 하 고 바인딩 각 돌연변이 대 한 반응의 일련과 같은 표준 접근에, 힘들고 시간이 걸리는 이며 하지 않을 수 있습니다. 특히 긴 시퀀스에 대 한 포화 mutagenesis 허용. 둘째, 시퀀스를 무작위 수 있습니다 고 수영장 사용 여러 사이클 바인딩 및 중 합 효소 연쇄 반응의 증폭 (PCR). 이러한 시퀀스 단백질을 복제 하 고 식별 하 고 일치 시퀀스에서 바인딩 사이트 유효성을 시퀀싱 할 것 이다. 그럼에도 불구 하 고,이 반복 바인딩 및 증폭 옵션 여러 단계를 포함 하 고 확인 하는 바인딩 사이트 내에서 중요 한 잔류물에 힘 드는입니다. 또한, 반복된 시퀀스 확대 PCR에 시퀀스 바이어스를 발생할 수 있습니다. 셋째,...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Uridine 5' a-thio triphosphate	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-017
Adenosine 5' a-thio triphosphate	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-016
진공 매니폴드	Fisher Scientific		XX1002500 Millipore  25  mm 유리 미세 분석 진공 필터
진공 매니폴드	Millipore		XX2702552 1225 샘플링 진공 매니폴드
니트로셀룰로오스	Millipore	HAWP
니트로셀룰로오스	Schleicher & Schuell	PROTRAN
탈인산화 키트	NEB	M0508
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제	NEB	M0201S
단백질 분해 효소 K	NEB	P8107S
T7 RNA 중합효소		NEB M0251S
RNasin	Promega		RNase 억제제
유리판	표준	표준
젤 전기 이동법 장비 표준		표준 표준
X-선 필름	표준
표준 폴리아크릴아미드 젤 해결책	표준	표준