복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

요약

여기 우리가 설명 복제 설정 방법, 양적 측정 C. 선 충 수명/생존 하 접근법 및 healthspan 높은 처리량 및 강력한 방법으로 데이터 품질을 희생 하지 않고도 많은 조건의 심사 되므로. 이 프로토콜은 전략 하 고 데이터 복제 집합의 분석을 위한 소프트웨어 도구를 제공 합니다.

초록

복제 설정 방법은 양적 측정 수명 또는 꼬마 선 충 선 충의 생존의 동일한 금액에 더 많은 치료 또는 조건 화면을 단일 조사 되므로 높은 처리 방식에 대 한 접근 데이터 품질의 손실 없이 시간. 방법 C. 선 충 작업 대부분 실험실에서 발견 하는 일반적인 장비를 요구 한다 고 따라서 채택 간단 합니다. 접근 각 관측 지점에서 모집단의 독립 샘플 보다 시간이 지남에 단일 샘플 전통적인 경도 방법 시 금에 센터. 점수 다 잘 접시의 우물에 액체를 추가 하는 수반는 자극 하는 선 충 C. 이동 하 고 healthspan에서 측정 변화를 용이 하 게. 복제 설정 방법의 다른 주요 장점으로는 agar 표면 (예: 형 또는 곰 팡이), 공 수 오염 물질의 감소 된 노출 최소한의 동물, 및 견고성 산발적 잘못 채 점 (예: 때 그것은 여전히 죽은 동물을 호출을 처리 살아 있는). 적절 하 게 분석 하 고 복제 세트 스타일 실험에서 데이터 시각화, 사용자 정의 소프트웨어 도구는 또한 개발 되었다. 소프트웨어의 현재 기능 모두 복제 설정 및 전통적인 (카 플 란-마이어) 실험으로 통계 분석 생존 곡선의 복제 세트에 대 한 표시 포함 됩니다. 여기에 제공 된 프로토콜 전통적인 실험적인 접근 복제 설정 방법 뿐만 아니라 해당 데이터 분석에 대 한 개요를 설명 합니다.

서론

노화의 유전 기초 이해를 향한 가장 transformative 기술 발전의 한 개 이었다 C. 선 충¹; 먹이 기반 RNAi의 개발 RNAi의 실험적인 사용 전에 노화의 많은 고기 유전자 세공 되지 않았습니다. 먹이-기반 RNAi dsRNA 일치 하는 대장균 내에서 생산을 통해 이루어집니다는 생 선 충 C. mRNA: IPTG 중 선 충 C. cDNA의 삽입 또는의 부분에서 양방향 전사를 유도 한 플라스 미드²내의 열려있는 독서 프레임. C. 선 충 에 그대로 피드 박테리아에 의해 생산 하는 대장균, dsRNA 루멘에서 SID-2 막 횡단 단백질³을 통해 장 세포로 수송 이며 다음 SID-1⁴를 통해 동물의 나머지 부분을 통해 배포. 각 셀 내에서 외 인 dsRNA에 의해 처리 됩니다 Dicer 복잡 한 siRNA에 새로운 만들려고 보완 기본 페어링 통해 성숙한 mRNA와 상호 작용 하는 siRNA mRNA 이중. 이 이중 RISC 복합물에 의해 인식 하 고, 그로 인하여 죽 습 생 mRNA⁵저하. 따라서, 단지 플라스 미드 삽입 변경, 하나 C. 선 충 게놈 내에서 거의 모든 유전자의 기능을 비활성화 수 있습니다. 이 발견의 라이브러리 컬렉션 변형 대장균 주식의 약 86%의 범위를 달성 하기 위해 결합 될 수 있는 몇 가지 큰 먹이 기반 RNAi의 창조에 주도 알려진 C. 선 충 유전자^{6, 7}.

먹이-기반 RNAi의 발전 이후 종합 화면 C. 선 충 에 수명 비활성화 (로 WormBase에 큐레이터 RNAi 형 협회 입증) 때 우리가 참조를 변경 하는 900 개 이상의 유전자의 발견에 지도 gerogenes로. 대부분 장 수 제어에 gerogenes의 역할 몇 정액 보고서에 RNAi 먹이-기반을 통해 발견 되었다 (자세한 내용은 그림 1A 및 추가 파일 1 참조). 경우에 따라 이러한 gerogenes는 RNAi 치료와 수명에 정량 측정을 제공할 수 있는 단일 또는 몇 시간 지점에서 생존 능력 측정에 따라 확인 되었습니다. 다른 경우에,이 유전자가 수명, 추가 나이 관련 된 고기에 있는 변화에 대 한 양적 평가 되었습니다. 예를 들어, 우리는 이전 159 유전자를 정상적이 고 증가 수명 감소 인슐린/IGF-1 신호, 동물의 필요 그리고 healthspan에서 변화를 정량 확인. 이들의 103 유전자 inactivations 귀 착될 progeric 표현 형으로 손실 귀착되 었 다 조기 노화⁸의 하나 이상의 표시.

일부 gerogenes 100 이상의 연구 (예: daf-16, daf-2, 선생님-2.1)와 연결 된, 400 gerogenes 10 이하의 인용 (그림 1B및 보조 파일 2) 있다. 따라서, 동안 포괄적인 먹이 기반 RNAi 스크린 발견 하 고 엉 특징 상 상속 gerogenes의 수백, 장 수 제어에서 이러한 유전자 기능 및 이러한 유전자 제품 사이 유전 상호 관계 유지 하는 방법을 제대로 공부. 나이 관련 된 고기에 대 한 전체 경도 분석 gerogenes (예: epistatic 상호 작용, asynthetic 상호 작용, 등등) 사이 유전 상호 작용을 식별 하는 데 필수입니다. Gerogenes 사이 유전 상호 관계에 대 한 깊은 통찰력을 얻고 또한 먹이 기반 RNAi의 장점을 활용 하 여 높은 처리량 양적 방법을 필요 합니다.

노화의 가장 일반적인 대리 측정은 수명. C. 선 충 사망률을 측정 하기 위한 전통적인 방법은 작은 인구 샘플 내에서 시간이 지남에 개별 동물의 죽음을 추적 합니다. 동물의 비교적 적은 수 시간이 지남에 따라 하 고 정기적으로 부드럽게 백 금 철사 또는 속눈썹, 생존 (그림 2A)의 지표로 서 운동으로 prodded. 이 방법은 널리 사용 되었습니다, 평균 및 최대 수명, 직접 측정을 제공 합니다. 그러나,이 전통적인 방법은 이다 시간과 상대적으로 낮은 처리량을 동시에 제어 방식으로 측정할 수 있는 조건과 동물의 수를 제한. 시뮬레이션 연구는 최근 많은 C. 선 충 수명 연구 조건⁹사이의 작은 변화를 안정적으로 감지 수 동물의 충분히 큰 수를 시험 하지 않습니다 발견. 또한,이 전통적인 방법은 차례로 수 소개, 오염 및 손상 하거나 점점, 세 동물을 죽 일 시간 동안 동물의 동일한 코 호트를 반복적으로 처리를 포함 한다.

C. 선 충 수명 측정에 대 한 대체 "복제 세트" 방법론을 개발 했습니다. 이 위해, 나이 동기화, isogenic 동물의 큰 인구 수 작은 인구 (또는 복제)으로 나누어집니다. 충분 한 복제 샘플 계획 된 실험에서 각 시간 포인트를 충당 하기 위해 생성 됩니다. 각 관찰 시간이 시점에서 복제본 중 하나가 죽은 생활의 수를 위해 득점 하 고 검열된 동물, 다음 그 복제 동물 삭제 됩니다. 따라서, 이상의 독립 모집단의 시리즈 전체 인구의 예상된 수명은 주기적으로 샘플링 (그림 2B). 복제 세트를 사용 하 여 잠재적인 환경 오염 없이 반복된 노출의 아무 반복 괴롭히는 있다. 1 회 시점에서 관찰 생존 모든 다른 관측, 처리를 최소화 하 고 적어도 크기 순서에 의해 처리량 증가의 완전히 독립적입니다. 이 RNAi의 수백 클론^8,10동시에 대 한 수명에 변화를 quantitate 하을 수 있다.

여기 C. 선 충 수명 복제 세트와 C. 선 충 장 수 득점을 위한 전통적인 방법을 통해 수행을 위한 상세한 프로토콜 선물이. 우리는 방법 사이 비슷한 결과 얻은 것을 보여 줍니다. 우리는 우리가 자유롭게 GPL V3 라이센스 (참조 자료의 테이블)에서 제공 하는 어느 접근 방식을 통해 생성 된 수명 데이터의 그래픽 분석을 지원 하기 위해 개발 된 소프트웨어를 있다. "WormLife" R¹¹, 작성 하 고 Mac OS와 리눅스에서 테스트 되었습니다 데이터를 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 포함 한다. 마지막으로, 우리가 비교 하 고 각 방법의 한계를 대조 C. 선 충 수명에 양적 변화를 측정 하는 방법을 선택할 때 다른 고려를 강조.

프로토콜

1. 전통적인 방법 점수 C. 선 충 장 수

1. 시 약의 준비
   1. 유전자 먹이 기반 RNAi 통해 비활성화를 식별 합니다. 관심의 RNAi 클론을 포함 하는 HT115 대장균² 의 변형 된 주식을 구입. 또는, L4440 플라스 미드의 multicloning 사이트에 관심사의 유전자의 cDNA를 subclone.
      참고: HT115은 IPTG을 유도할 수 있는 T7 중 합 효소 활동, 박테리아 내의 dsRNA의 저하를 방지 하는 데 사용 되는 RNase III 불충분 한 E. 콜라이 긴장. 먹이-기반 RNAi를 사용 하지 않는 수명 연구, HT115 또는 OP50 표준 NGM 접시에 대장균 수 사용된.
   2. 3-6 (또는 더 많은) 6 cm 테스트 조건 (제조 법에 대 한추가 파일 3 ) 당 RNAi 접시를 준비 합니다. 몇 개월에 대 한 박테리아와 뿌리기 전에 4 ° C에서 RNAi 접시를 저장.
   3. 성장 변형된 대장균 하룻밤 (16-20 h, 180-220 RPM에서 인큐베이터를 떨고 37 ° C).
      참고: HT115 대장균 암 피 실린 (50 mg/mL)와 파운드에 성장 된다. 표준 OP50 대장균 은 항생제 내성 고 암 피 실린 없이 성장. 문화 볼륨 판, #에 따라 다릅니다 하지만 일반적으로 실험적인 디자인에 따라 파운드의 8, 100 mL 사이.
      1. 벤치탑 원심 분리기에서 15-20 분 3000 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 집중. 상쾌한, 발음 하 고 다시 1에서 펠 릿을 일시 중지/10 시작 볼륨 (즉, 10 x) 암 피 실린 HT115 (또는 표준 OP50에 대 한 암 피 실린 없이)와 파운드에.
      2. Aliquot 200 µ L의 각 6 cm 접시 10 x 박테리아 집중. 테스트 상태, 오염 시 사용 될 2 여분의 백업 플레이트와 당 3-4 복제를 준비 합니다. 접시를 준비할 때 점수 분석 결과 실험은 실험 조건에 눈 먼 색상 코드 또는 유사한 코딩 구성표를 사용 하 여 그들을 라벨. 코드가 기록 됩니다 확인 합니다.
      3. 모든 액체를 흡수 하는 층 류 벤치 등 깨끗 한 환경에서 건조 또는 벤치에 하룻밤 건조 커버 플레이트 오픈 격판덮개를 허용 한다. 지나치게 건조 하지 않고는 agar는 건조 되도록 건조 하는 동안 접시를 모니터링 합니다.
         참고:-접시 건조 한 선 충 C. 는 agar에 뚫으 하는 것은 천의 크래킹 이끌어 낸다. 서 부 유럽 표준시 agar 표면도 내 홍보
   4. DsRNA 생산의 유도 있도록 실 온에서 하룻밤 (최대 24 h) 웜 상자 내에서 말린된 접시를 저장. RT에서 1 일 후 (접시 밖으로 건조 하지 않도록) 하려면 밀봉된 지퍼 잠금 가방에 접시 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장 합니다. 사용 하기 전에 공 수 곰 팡이 오염 물질을 소개에서 응축을 방지 하기 위해 지퍼 잠금 가방 내에서 실내 온도에 번호판을 반환 합니다.
2. 차 아 염소 산 치료 C. 선 충 의 동기화
   주: M9과 차 아 염소 산 솔루션 조리법에 대 한 추가 파일 3 을 참조 하십시오.
   1. M9 벗 성인 동물을 수집 합니다. 연결된 유리 피 펫을 사용 하 여 2 x 15 mL 튜브로 이동.
   2. 30"~ 2000 rpm에 대 한 튜브를 회전 합니다. 튜브의 아래쪽에 선 충에의 한 풀에 대 한 확인 하십시오. 상쾌한 발음 M9 솔루션, 스핀과 열망을 반복 두 번 씻어.
   3. 다시 m 9의 4 mL에 C. 선 충 을 일시 중단 합니다. 차 아 염소 산 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 정기적인 활기찬 동요와 함께 ~ 3 분, 즉시 소용돌이. 3 분 후 계란 해 현미경의 구름을 찾습니다. 소용돌이 추가로 10-20의 계란 3 분 후 해제 되지 않은 경우.
      참고: 차 아 염소 산 치료 타이밍은 필수적입니다. 벗 성인 내 계란은 어떤 치료 생존. 3 분 후 벗 성인 깨 그리고 계란을 밖으로 유출. 그러나, 계란은 차 아 염소 산 솔루션에서 출시 후 너무 오래 그들은 죽을 것 이다. 반대로, 만약 벗 성인은 충분히 차 아 염소 산 솔루션에 빠지지 않고, 계란이 나올 것 이다.
   4. 빠르게 M9 솔루션 단계 2.1.2 에서처럼 두 번 세척.
   5. 다시 3 mL M9에 새로운 15 mL 튜브에 C. 선 충 계란 펠 릿을 일시 중단 합니다. 20 ° c.에 회전 M9 솔루션의 3 mL에서 하룻밤 해치 배아 허용
   6. L1 솔루션 3의 10 µ L를 놓아 µ L 당 L1 동물 (또는 배아)의 밀도 계산 x 6 cm 접시 및 수 L1s / µ L의 평균 수를 계산 하는 L1 동물 수.
      참고: L1 동물 시간이 지남에 정착 됩니다. 따라서, L1 솔루션 주기적으로 혼합 되어야 한다.
   7. 접시 당 종자 50 L1 동물입니다. 접시를 반전 하 고 고무 밴드와 함께 인감. 플라스틱 웜 상자에 접시를 놓습니다. 큰 지퍼 잠금 가방에 상자를 봉인 합니다. 20 ° C 인큐베이터로 이동 합니다.
3. Deoxyuridine (FUdR)-5-플 루 오로-2'의 추가 의해 자손 생산을 방지
   1. 동물 20 ° c.에 L4 단계까지 성장 확인 하십시오 동기화 여부 동물 L4를 개발한 시드 (2.1.7 단계) 후 약 40 h.
      참고:선 충 C. 발달 시간¹² 및 성장 속도는 요금 하지 특징 되는 돌연변이 동물의 실험적으로 테스트 해야 합니다 서로 다른 온도에서 달라질 수 있습니다.
      1. 추가 50의 160 µ L L4 동물과 각 6 cm 접시에 x FUdR.
         참고: FUdR L4 단계에 추가 하는. 편의 위해 만들 1000 FUdR x 주식 1 g FUdR 10 mL에 용 해 하 여 초순 H₂o. 필터를 소독 주식 FUdR 0.2 µ m 필터와 10 cc 주사기. Aliquot 살 균 1.5 mL 튜브에 재고 mL ~ 1 와-20 ° c.에 저장
   2. 남자의 존재에 대 한 번호판을 검사 C. 선 충. 모든 남성을 제거 합니다.
      참고: 수명은 일반적으로 광고에 나온 것 하 고 없는 남성에 대 한 측정. 친구는 광고에 나온 것도 FUdR¹³존재 unmated 동물 보다 짧은 라이브. 남성 작고 얇은 다음 광고에 나온 것 이며, 독특한 구부려 진된 꼬리¹⁴에 의해 쉽게 확인 될 수 있다.
   3. 지퍼 잠금 가방에 다시 상자를 넣어. 20 ° C 인큐베이터를 반환 합니다.
4. 생존 점수
   1. 백 금 철사 또는 속눈썹 머리에 동물을 부드럽게 만져 매일 생존을 점수. 동물 죽은로 이동 하 고 (그림 2A) 접시에서 그들을 제거에 실패 하는 점수. 죽은 모든 관찰 시간 지점에 대 한 각 조건에 대 한 관찰 번호를 기록 합니다.
      참고: 득점 편견의 위험을 줄이려면는 실험 실험 조건에 눈 먼 있어야와 마찬가지로 참조 하지 않아야 합니다 결과 이전 시간에서에서 득점 하는 동안.
   2. 파열, 검열 동물 접시의 측면을 다른 명백한 개발 결점, 또는 크롤 링에서 죽을: 통계 분석에서 고려에 대 한 이러한 동물과 각 번호 관찰 시간 기록 지점 제거. 또한, 남성 발견 되 면, 그들을 제거 하 고 관찰 하는 수를 기록.
   3. 반복 단계 1.4.1에서에서 매일 아무 동물 살아 남아 때까지.
      참고: 대장균 의 잔디 크게 축소 해야 하거나 곰 팡이 접시에 성장, 적절 한 RNAi와 FUdR 신선한 접시에 모든 나머지 동물을 전송 하기 시작 합니다.
5. 데이터 분석-플로팅 및 통계
   1. 입력 또는 비패라메트릭 카 플 란 Meier 견적¹⁵ 와 로그-순위 생존 분석을 지 원하는 소프트웨어에 오픈 기록된 관찰 데이터 테스트¹⁶ ( 보충 파일 3참조). 검열 된 동물을 포함 해야 합니다. 있는 경우에 관찰 된 남성을 포함 하지 마십시오.
      참고: 데이터 형식 소프트웨어, 사이 다를 수 있습니다 하지만 일반적인 포맷은 별도 줄에 관찰 각 개별 동물 기록. 죽은 동물은 관찰 실험 timepoint "이벤트" 시간 이다. "이벤트" 시간을 검열, 이면 timepoint는 동물을 검열 했다. 일반적으로 필드 또는 검열 된 관측 하려면 확인란입니다.
   2. 카 플 란-마이어 생존 곡선을 플롯. 가독성을 높이기 위해 많은 조건을 분석 했다 단일 줄거리에 대 한 미만 6 조건을 선택 합니다.
      1. 시각적으로 명백한-누락 된 관측값, 예기치 않은 컨트롤 결과, 등 데이터 문제를 확인 -통계 분석 하기 전에 이러한 해결.
   3. 소프트웨어에서 로그-순위 테스트 함수를 사용 하 여 쌍 수행 통계 비교. 데이터 오른쪽 검열 검열된 결과의 처리에 대 한 모든 사용 가능한 옵션 적절 하 게 설정 되어 있는지 확인 합니다.

2. 복제 점수 C. 선 충 장 수에 대 한 Set 메서드

참고: 전통적인 방법 필요 조건 당 3-6 판 (1.1.2 참조. 위), 복제 설정 방법을 사용 (단계 2.2.2 아래 참조) 더 많은. 전통적인 방법 (그림 2A) 실험을 통해 같은 접시에 동물을 다음과 같습니다. 반면, 복제 세트와 동물만 득점 된다 한 번: 한 복제 (재판) 당 각 시간 지점에서 득점은 되도록 많은 동일한 복제 실험의 시작 부분에 설정 되어 (그림 2B).

1. 라이브러리 설정입니다.
   참고: 나눠 RNAi 클론에 추가 세부 사항 여기, 프로토콜은 많은 RNAi 클론의 동시 득점 의무가 복제 세트로 덮여 고 잘 100 클론을 한 번에 확장할 수 있습니다. RNAi 클론의 컬렉션 형식 96 잘 접시에 유지 하는 글리세롤 주식으로 유지 됩니다. 복제 설정된 실험 24-잘 접시를 사용합니다. 각 잘 RNAi 클론, 다른 화학 치료, 동물, 긴장과 등의 컬렉션에 해당 수는 다른 테스트 조건입니다.
   1. 다음 조건이 충족 되는 RNAi 클론의 컬렉션에 대 한 sublibrary의 레이아웃을 조립.
      1. 96-잘 컬렉션에서 잘 a 1은 빈 벡터 부정적인 제어를 확인 합니다.
      2. 모든 24 웰 스 내에서 임의로 추가 빈 벡터 제어를 삽입 합니다.
      3. 각 24-잘 접시가 하나에 무작위로 삽입 부정적인 컨트롤 (그림 2C)는 96 잘 접시 24 웰 스의 블록으로 분할.
      4. 24-웰 스 (그림 2C)의 각 그룹 내에서 무작위로 긍정적인 컨트롤을 삽입 합니다.
         참고: 긍정적인 제어 실험 질문에 따라 달라 집니다. 예를 들어 그 증가 수명 클론 RNAi의 컬렉션을 보고, daf-2(RNAi) 자주 포함 되어 있습니다. 반대로, 짧은 수명에서 볼 때, daf-16(RNAi) 자주 사용 됩니다.
2. 복제 세트의 준비
   참고: 복제 필요한 수는 최소 수를 시간 포인트 (그림 2B). 하나는 귀납적은 주파수 (예: 모든 다른 날 점수와 함께 40 일을 실행 하는 복제 세트 실험 준비 20 복제 세트에 대 한 최소 요구 점수 뿐만 아니라 실험의 시작에 앞서 수명 측정을 얼마나 알고 있어야 합니다. 각 조건에서 실험의 시작). 그것은 ~ 5 여분의 백업 세트 (2.2.2 및 2.2.2.3 아래 참조)를 확인 하는 것이 좋습니다.
   1. RNAi sublibrary의 신선한 스탬프를 만들려면 다음 단계에 의해 96 핀 플레이트 복제기를 사용 하 여 96 잘 형식 (600 µ L 플레이트)에 잘 당 200 µ L 파운드 + 앰프 예방:
      1. 순차적으로 50%의 표 백제, 초순 H₂O, 그리고 에탄올에 핀을 immersing 하 여 96 핀 플레이트 복제기를 소독. 계속 적어도 30에 대 한 몰입 핀 표 백제와 에탄올 단계에 대 한 s.  에탄올에 침수 후 팁을 간단히 불꽃. 반복 합니다.
         참고: 씻어 모든 표 백제, 그리고 노출 장기간, 표 백제 표 백제 스테인리스 스틸 핀 부식 수 있습니다 핀을 두지 마십시오.
      2. 냉동된 96 잘 글리세롤 재고 라이브러리 플레이트와 부드럽게 접착 호 일 덮개를 조심 스럽게 제거 하지만 단단히 여전히 냉동된 글리세롤의 우물에 소독된 판 복제기의 팁을 갈기. Inoculate 200 µ L 파운드 + 앰프 문화 고 침투성 막으로 접종된 접시를 봉인. 벤치탑에 밤새 껏 성장 하는 문화를 허용 한다.
      3. 2.1.1 단계 같이 격판덮개 복제기 소독, 신중 하 게 하룻밤 성장 후 액체 문화 판에서 물개를 제거 하 고 복제기 핀의 끝을 젖어. 적절 한 공간 인접 지점 사이 남아 있도록 작은 원형 모션으로 부드럽게 플레이트에 핀에서 직사각형 파운드 앰프 + tet 천 배지 및 전송 박테리아 심지어 압력으로 팁을 적용. 한 천 배지에서 37 ° c.에 하룻밤 성장 식민지 허용 LB + 앰프/Tet의 준비에 대 한 추가 파일 3 참조 접시.
      4. 이전에 사용, 4 ° C 거꾸로 (아래 뚜껑 쪽)에서 한 천 배지 파라핀 영화에 싸여 저장 합니다.
         참고: 교차 오염 RNAi 클론을 응축 수 식민지 뚜껑 쪽을 저장! RNAi 클론 유지 시간 가변 길이 IPTG 유도 후 dsRNA를 유도에 효능으로 특정 RNAi 클론에 따라 4 ° C에서 2-8 주에 대 한 대장균 의 식민지를 저장할 수 있습니다. RNAi 클론의 작은 컬렉션, RNAi 효율 결정 되어야 합니다 경험적으로 실시간 정량 Pcr에 의해 최저 확인 하.
   2. 24-잘 접시 실험에의 한 재판에 필요한 최소 수를 계산: (복제 세트 당 # 접시) x (예상된 # 시간 점). 몇 가지 추가 복제 세트 (그림 2B) 오염 등의 문제를 처리 하기 위한 포함 되어 있는지 확인 합니다.
      참고: RNAi 클론의 총 수는 각 시간 포인트 (그림 2C)에 대 한 복제본의 한 세트를 만들기 위해 24-잘 접시의 수를 결정 합니다.
      1. 1.1.2 (제조 법에 대 한추가 파일 3 ) 단계 24-잘 접시를 준비 합니다. 실험 분석 결과 득점 색상 코드 또는 유사한 코딩 구성표를 사용 하 여 실험 조건에 눈 먼 것 들을 준비할 때 접시를 레이블.
      2. 한 세트 1.5 mL 파운드 + 앰프 문화 (2.2.2 참조) 모든 10 복제본의 예방 문화 (2.1.3)로 접시 복제기 2.1.4 (그림 2C, 왼쪽)에서 세균성 식민지를 사용 하 여 96 잘 깊은 잘 격판덮개에 접종 숨 막 인감, 동요를 가진 20 h (37 ° C) 성장.
      3. (그림 2C, 오른쪽) 간격 조절 팁 6 잘 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 접시에 하룻밤 문화의 120 µ L 씨 모든 액체를 흡수 하는 층 류 흐름 후드에서 발견 건조 접시. -건조 하지 않습니다. 하룻밤 실 온에서 접시를 저장.
3. C. 선 충 도 발견 됐 죠 치료를 사용 하 여 동기화
   1. 동물 실험에 필요한 최소 수를 계산: 필요 L1s의 최소 # = (15-20 동물/잘) (24 웰 스/접시) (접시/복제 세트 X)(Y replica sets).
      참고: 복제 설정 방법을 사용 하는 기존의 방법 보다 더 많은 동물. 한 10 cm 접시 가득 벗 웜 20000-50000 L1 동물 벗 성인의 밀도 따라 제공할 수 있습니다. 마찬가지로, 20 6 cm 접시 ~ 30000 L1 동물 주위 얻을 수 있습니다. 필요한 동물의 최소 수를 두배로 하는 계란 준비를 준비 하려고 합니다. 준비에서 인구는 굶 어 다시 공급 또는 새로운 접시에 덩어리 고 넘어가기^17,18전에 음식에 적어도 3 세대를 허용. 다시 남은 L1s을 동결 해야 합니다.
   2. 따라 단계를 전통적인 방법에서 1.2 1.2.6 L1 동물 동기화. 씨앗 잘 사용 하 여 각 6-잘 조정 가능한 간격 피 펫 및 시 약 저수지, 1.2.7 비슷합니다으로 15-20 L1 동물. 주기적으로 혼합 솔루션 동물의 침전을 방지 하는 L1.
4. Deoxyuridine (FUdR)-5-플 루 오로-2'의 추가 의해 자손 생산의 예방
   1. 1.3.1 단계를 따릅니다.  살 균 50 FUdR 주식 x를 준비 (단계 1.3.1.1 참조).
   2. 동물 도달 L4, 추가 50의 25 µ L 24-잘의 각 음에 x FUDR 6 채널 가변 간격 피 펫을 사용 하 여 격판덮개.
5. 점수 생존
   1. 복제 격판덮개의 1 세트를 제거 하 고 잘, 당 레코드 총 동물 M9 솔루션과 우물 홍수 다음 부드럽게 움직이지 않는 동물 웜 선택 (그림 2B)과 머리에 터치. 동물 이동 하는 실패는 죽음으로 주어진 다. 삭제 판 득점입니다. 매일 기록 생존 능력입니다.
      참고: 동물 파열, 쇼 총 형태학 결함, 개발, 실패 하거나 잘 측면을 크롤 링을 죽은 및 총 값에서 그들을 제외 하 여 검열 하는.
      1. 다른 값에서 별도로 각 시간 지점에서 각 잘 내에서 검열 하는 동물의 수를 기록 합니다.
      2. 식품 또는 오염 웰 스 점수 하지 마십시오 (예: 곰 팡이 또는 점액); 이러한 웰 스 검열 된 것으로 간주 됩니다. 또한, 모든 동물의 형태학 또는 발달의 결함을 표시 하는 경우는 잘을 검열. 이 시간 지점에서 복제/잘이이 RNAi에 대 한 검열 이벤트를 기록 합니다.
      3. 복제 판, 득점 후 그것을 폐기. 새로운 복제 점수 설정 모든 우물에 걸쳐 모든 동물은 죽은 때까지 매일 계속. 바이어스 득점의 위험을 줄이려면는 실험 실험 조건에 눈 먼 남아 있어야 하 고 유사 하 게 참조 하지 않아야 합니다 결과 이전 시간에서에서 득점 하는 동안.
      4. 잘 모든 동물 했다 주어진된 시간 포인트에서 죽은 다음 그 날의 득점 후, 검사 모든 동물에 대 한 두 개의 연속 시간 포인트 죽은 골 되었습니다 여부는 잘 주어진. 그렇다면, 생존 점수 이상 필요 후속 시간 포인트에서 잘 합니다.
      5. 추가 독립 실험 시험을 실시 합니다. 추적 연속 시험의 결과 별도로 그 이전 재판에서 재판 수 지적 했다.

3. 그래프 데이터

참고: 복제 세트와 곡선 맞춤 방법은 평균 및 최대 수명을 적용 됩니다. C. 선 충 사망률을 평가 하기 위한 매개 변수 적합 로짓 곡선¹⁹.  새로운 프로그램 (복제 세트);에 대 한 로짓 커브를 개발한 대부분의 생존 도구 로짓 곡선 맞춤을 지원 하지 않습니다, 카 플 란-마이어 곡선 (전통적인 방법)에 대 한 지원 됩니다.

1. 소프트웨어와 함께 시작. 최신판 (참고 자료 섹션)에 대 한 릴리스 zip 파일을 다운로드 합니다. 폴더에 zip 파일을 압축을 풉니다. 추가 설치 지침에 대 한 압축 푼된 폴더에서 "추가 정보" 파일을 참조 하십시오.

1. 플로팅 인터페이스를 시작 합니다. Zip 파일에서 추출한 폴더에서 "코드" 디렉터리의 위치를 찾아 (예:  "/ 사용자/사용자 이름 /Desktop/WormLife/코드").
   1. 그냥 확인 폴더 경로 대 한 대체 R 콘솔에서 다음 명령을 입력 합니다. 눌러 입력 하거나 각 줄을 입력 한 후: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), 3) openMain().
   2. 그림 3A와 같이 기본 화면을 키우는 새 창에서 로드를 인터페이스에 대 한 시간을 허용 합니다. R는 백그라운드에서 실행 하자.
2. 쉼표로 구분 된 값 (CSV) 또는 탭 구분 된 값 (TSV) 파일 포맷 데이터. 열과 분석의 종류에 따라 이름을 지정 합니다. 미리 서식이 지정 된 예제 데이터에 대 한 추가 파일 4 (복제 설정) 및 보조 파일 5 (전통/카 플 란-마이어) 참조.
   참고: "긴" 형태로, 변형/치료 시간 포인트 재판 당 당 당 즉, 한 행 데이터를 지정 해야 합니다. CSV 파일은 플랫폼 간의 최고의 호환성을 위해 권장 됩니다.
   1. 생략 되거나 검열 된 관측에 해당 하는 행을 제거 합니다. 확인 누락 또는 숫자가 아닌 값의 부재로 데이터를 가져올 때 오류가 발생할 수 있습니다.
   2. 전통적인 카 플 란-마이어 스타일 분석, 독립적인 재판-줄거리에서 데이터 풀 할 하지 그들 별도로. 다음 "TrialView" 기능을 사용 하 여 조사 하 고 분석 복제 세트에 대 한 여러 실험에서 데이터 풀 (6.3.3.4 참조).
3. 플로팅 인터페이스를 사용 하 여
   1. ("가져오기" "파일" 메뉴에서) 데이터 파일 로드 대화 상자를 사용 하 여. 파일을 열려면 ".csv", ".csv" 내려 놓기에서 파일 형식을 변경 합니다 (기본값은 ".txt/.tsv"), 데이터 파일 폴더로 이동 합니다. 여기는 파일 복제 설정 예제 데이터 (보충 파일 4)입니다.
      참고: dataset가 이미 열려 있을 때 파일 가져오기 현재 데이터 집합을 대체 합니다.
   2. 가져오기 마법사를 선택한 파일 (그림 S1A 복제 세트에 대 한)의 열을 식별 안내 시작을 가져올 파일을 선택 합니다. 입력된 데이터는 복제 세트 실험에 대응, 연구 유형에 대 한 "로짓"를 선택 합니다.
      참고: 가져오기 워크플로 복제 세트 (그림 s 1A)와 전통 (카 플 란-마이어) (그림 s 1B) 사이 다르다.
   3. "데이터 플롯". 데이터를 플롯 하려면 "추가 라인"을 선택 합니다. (선 한 조건 집합에 해당합니다. 특징이 있다 실험에 도움이 많은 조건 시험 되었다).
      1. 플롯은 제어 조건-N2 (WT) L4440 예제 데이터의 경우 (빈 벡터) RNAi는 적절 한. 선 추가 마법사를 시작 하려면 "그래프" 메뉴에서 "추가 라인"을 선택: 라인을 나타내는 플롯 및 그래픽 매개 변수에 조건을 선택.
         1. 3.3.3.1 단계를 반복 하는 다른 조건에 대 한 곡선을 수동으로 추가 하려면
         2. 색 변경 또는 플롯 라인에 대 한 기호, "그래프 메뉴"에서 "수정 라인"을 선택 합니다.
         3. 모든 라인을 삭제 하지 않고 한 줄을 제거 하려면 "그래프 메뉴"에서 "삭제 라인"을 선택 합니다.
         4. 현재 플롯에서 모든 라인을 취소 하려면 "그래프 메뉴"에서 "명확한 선"을 선택 합니다.
         5. 자동으로 선택 된 최대 x 축 (시간) 값을 재정의 하려면 "그래프 메뉴"에서 "설정 X 규모"를 사용 합니다.
            참고: y (살아남은 분수) 20%의 증가 0% (아래) 100% (위) 항상 표시 됩니다. X 축은 항상 5 단위로 표시 됩니다. 축 레이블은 하지 작 이미지를 저장 한 후 라벨에 유연성 있게 그려집니다.
      2. 현재 표시 된 줄거리의 JPEG 형식 이미지를 저장 하려면 "파일 메뉴";에 "그림 저장" 옵션을 사용 현재 플롯에만 저장 됩니다.
      3. 한 실험에서 많은 다른 조건에 대 한 개별 플롯을 만들기 위한 소프트웨어 정의 및 플롯 "시리즈" 수 있습니다.
         참고: 시리즈 개념의 구현 작업 큰 실험을 할 때 효율성을 향상 시킵니다.
         1. 빈 플롯 작업 영역에서 시작 해 서, 모든 플롯 (3.3.3.1 참조) 시리즈에 걸쳐 일관 되 게 제어 조건에 해당 하는 라인을 추가 합니다.
         2. 그래프 메뉴에서 "정의 시리즈" 시리즈를 정의 합니다. 해당 라인 시리즈;에 먼저 표시 하는 조건을 선택합니다 하나만 선택할 수 있습니다. 3.3.3.1에서 라인에 대 한 그래픽 매개 변수 (선 색깔과 그림 기호)을 선택 합니다.
         3. 다양 한 테스트 조건에 대 한 플롯을 검토 합니다. 상단 메뉴바 (그림 3A-C) 뿐만 아니라 주요 줄거리 창 측면에 왼쪽/오른쪽 화살표 단추를 사용 하 여 조건을 사이 "시리즈 라인"의 표시를 전환 합니다.
            참고: 선택한 시리즈 라인은 이전에 추가 된 컨트롤/참조 라인 중 하나로 동일한 조건, 새로운 라인 나타날 수 있습니다 중첩 된.
         4. 특정 다른 기능 사용 가능 (저장 시리즈 플롯 및 Trialview 참조 3.3.3.4 후자에 대 한)을 시리즈를 정의 합니다. 시리즈를 정의한 후 새 폴더에 시리즈에서 각 플롯에 대 한 개별 플롯 이미지 파일을 저장 하는 "파일" 메뉴에서 "저장 시리즈 플롯" 옵션을 사용 합니다.
      4. Trialview-복제 세트 실험의 독립 시험에서 결과 머릿속으로. 여러 실험 샘플 그룹의 하나 이상의 실행 했다, 개별 시험에서 데이터와 별도로 독립 실험 (참조 그림 3D) 사이의 일관성을 평가 하는 모든 시험에서 풀링된 데이터 플롯.
         1. 3.3.3.3에 설명 된 대로 일련을 설정 합니다. 다른 시험 지정된 참조/컨트롤 샘플에 대 한 각 실험을 통해 각 다른 이미지에서 "다양 한" 샘플 그룹의 플롯 됩니다.
         2. TrialView 이미지를 저장 하려면 이동 "인쇄 TrialViews" 데이터 메뉴; JPEG 이미지는 시리즈에서 각 플롯에 대 한 출력 될 것입니다.
            참고: 그림 3d에서 예제 결과 두 실험의 경우입니다.
   4. 평균 수명 데이터 복제 집합에 대 한 요약 테이블입니다. 시각적으로 데이터의 적당 한 적합을 보장 하기 위해 커브를 검사 "요약 테이블을 선택한 다음" 각 샘플 형식. 에 대 한 평균 수명 값 (로짓 곡선에 50% 생존 시간)의 테이블을 저장 하 고 데이터 메뉴에서 옵션
4. 복제 설정 메서드를 통해 생성 된 데이터의 통계 평가
   1. 복제 세트 실험에서 두 그룹 간의 통계 분석에 대 한 수정 하 고 릴리스 zip 파일에 제공 하는 R 스크립트를 실행 (참조 "WormLife 통계 분석 템플릿 스크립트입니다. R ")입니다.
      연구에서 능력 참고:이 스크립트를 실행할 필요가 없습니다. 추가 문서 파일에 코멘트에 있다입니다. 스크립트 예제 데이터 복제 집합의 분석에 대 한 준비가 되어있습니다. 사용자 생성 데이터를 적절 한 형식에서 ( 보충 파일 4참조) 또한 분석할 수 있습니다.
      1. R (R GUI 또는 RStudio)에서 스크립트 파일을 엽니다.
         참고:이 그것을 실행 하지 않고 스크립트를 표시 합니다.
      2. 컴퓨터에서 위치를 일치 하도록 필요한 파일의 위치를 수정 합니다.
         참고: 이러한 파일 경로 "정규화" 수 있어야 합니다 (즉, 폴더를 포함 하 여 전체 파일 위치를 포함 한다).
         1. "WlDir" (디렉터리의 위치), "데이터 파일" (복제 세트 데이터 파일을 분석), "compFile" (해당 되는 경우를 실행 하 고 비교의 사양), 및 "outputPath" (결과 파일이 작성 될 위치에 대 한 경로 (파일/폴더 위치) 수정 에)입니다.
      3. 분석 파일에 있는 열 이름을 예제 파일에서 다른 경우 "데이터 파일의 열 지정" 섹션에서 열 이름을 설정 합니다. 각 매개 변수에 대 한 열을 지정 합니다. 경우는 연구는 여러 변종, 하지만 아무 RNAi (또는 다른 처리) (예: "no_treatment", 등) 모든 행에 대해 빈 항목 또는 같은 데이터 파일에 항목을 포함.
      4. "CompFile" 매개 변수를 설정 합니다. 나를 "compFile" 매개 변수를 설정 하는 경우 그룹의 모든 가능한 없음을 비교 실행 됩니다.
         참고: 그룹 스트레인/유전자와 연결 되 고 "strain_treatment"로 표시 되는 치료의 조합에 의해 정의 됩니다. 많은 그룹 큰 연구에 대 한 비교를 지정 하 여 CSV 파일을 제공할 수 있습니다. 예제 파일 "comps_rsm_example.csv"를 참조 하십시오.
      5. 몬테 카를로 리샘플링 반복의 수를 설정 ("k.resamp", 기본값은 1, 000).
         참고: 너무 몇 반복; 수행 될 때 반환 될 수 있습니다 0의 P-값 이러한 경우에 그것은 보고서에 적합 한 "p < 0.01" (경우 k.resamp = 100), 또는 "p < 0.001" (경우 k.resamp = 1000), 등
      6. 스크립트 실행: RStudio에서 "소스" 버튼 (편집 창 오른쪽 상단) 또는 R GUI에서 "편집" 메뉴에서 "소스 문서". (실행 시간이 좀 걸릴 수 있습니다.)
      7. R "바쁜" 표시기가 더 이상 표시 됩니다 때 열고 출력 디렉터리 거기 각 비교 (메디아 생존, p-값, % 평균 수명 변화)의 결과 테이블을 될 것입니다.

결과

어떤 새로운 방법론의 개발, 새로운 방법 이전 접근 허용된 결과 고 필드 내에서 표준 충족 필수적입니다. 우리는 이전 표시 경험적으로 복제 설정 및 C. 선 충 수명 시 금를 위한 전통적인 방법 유사한 결과²⁰생산. 야생-타입 C. 선 충 (N2) 일반적으로 20 ° C에서 유지 우리 전통 (그림 4A, 검은 선)과 복제 세트 접근 (그림 4B, 블랙) 관찰 20 ~ 25 일 살고 있다. 따라서, 두 방법 모두 합리적으로 야생-타입 수명 근사치. 또한 새로운 방법을 테스트 조건 및 상당한 변화를 감지 하는 통계적 인 힘 사이 변화를 정확 하 게 계량을 해상도 필수적 이다. 우리의 이전 연구에서 우리가 발견 Myc 가족 녹음 방송 요인의 C. 선 충 장 수의 결정 요인.

토론

두 전통 및 복제 설정된 방법 날짜순 세 동물의 동기화가 필요합니다. 우리는 수정 된 달걀만 벗 성인 치료를 생존 벗 성인, 차 아 염소 산 치료를 사용 하는 동물을 동기화 하는 메서드를 포함 합니다. 이러한 배아 액체에 해치 고 발달 첫번째 애벌레 단계 (L1)에서 체포. L1 동물 식품 (예: 대장균 표현 dsRNA의 유전자)에 시드, 후 동물 개발을 다시 시작 합니다. L1 동물 벗 성인의 차 아 염소 산 처리에 의해 동기화 장점이 남은 unseeded L1 동물 동결 되 고 무한정 액체 질소 또는-80 ° C 냉장고에서 저장 될 수 있습니다. 이 방법에서는, 미래 연구를 위한 귀중 한 자원 만들기 및 재현성을 향상 실험 설치의 시간에 각 스트레인의 샘플 보존 됩니다. 그러나, 차 아 염소 산 벗 성인 동물의 치료는 노화 연구²²에 대 한 동기화 된 동물을 얻을 수 있는 일반적인 방법을, L1 체포 기아 응답 이다. 따라서, 어떤 실험실 접시에 발생...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
IPTG (이소 프로필 베타 -D-1- 티갈 락토피라 노시드)	Gold Bio	12481C100
FuDR (5- 플루오로 -2'- 데옥시 우리딘)	Alfa Aesar	L16497
24 웰 배양 플레이트	Greiner Bio-One	# 662102
Retangular Non-treated Single-well 플레이트, 128x86mm	Thermo-Fisher	242811
600 µ L 96웰 플레이트	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96웰 플레이트	Greiner Bio-One	#780286
통기성 플레이트 씰	VWR	60941-086
96핀 플레이트 리플리케이터	Nunc	250520
bacto-peptone	VWR	90000-368
세균 한천	Affymetrix/USB	10906
C. elegans RNAi 클론 라이브러리 in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	Kamath et al, Nature 2003 참조.
C. elegans RNAi 클론 라이브러리 in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	Rual et. al, Genome Research 2004 참조. 이 라이브러리는 Dharmacon에서도 사용할 수 있습니다.
WormLife- 복제 세트 생존 분석을 위한 소프트웨어	Samuelson Lab	해당 사항 없음
https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife L4440 빈 벡터 플라스미드	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/
웜베이스			http://www.wormbase.org/
오아시스			https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/
Graphpad 프리즘			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/