셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

Summary

우리 불멸 하 게 종양 및 섬유 세포 bioprintable alginate/젤라틴 bioink에 포함 된 구성 된 이기종 유 방 암 모델 개발. 모델이 비보에 종양 microenvironment tumorigenesis 운전 메커니즘에 대 한 통찰력을 양보 하는 다세포 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다.

Abstract

기본 종양 microenvironment의, 생화학, 세포 및 생물이 하지 성장 불멸 하 게 암 세포 선을 사용 하 여 기존의 2 차원 (2D) 세포 배양 하 여 지는. 다른 종류의 세포에 의하여 포함 된 다른 유형의 3 차원 (3D) 종양 모델을 만들 bioprinting 기술을 사용 하 여 이러한 문제를 극복할 수 있습니다. Alginate와 젤라틴은 bioprinting 그들의 생체 적합성, biomimicry, 및 기계적 특성 때문에 가장 일반적인 생체 재료의 두. 두 고분자를 결합해 서, 우리는 네이티브 종양 stroma의 미세한 구조 유사성과 bioprintable 복합 하이드로 겔을 달성. 우리는 유동성을 통해 복합 하이드로 겔의 전이성 공부 하 고 얻은 최적의 인쇄 창. 유방암 세포 및 섬유 아 세포는 hydrogels에 포함 되었고 vivo에서 microenvironment를 흉내 낸 3D 모델을 형성 하. Bioprinted 이종 모델 장기 세포 배양 (> 30 일)에 대 한 높은 생존 능력을 달성 하 고 추진 하 고 있는 다세포 종양 spheroids (MCTS)으로 유방암 세포의 자기 조립. 마이그레이션 및 암 관련 fibroblast 세포 (CAFs)의이 모델에는 MCTS 상호 작용 관찰합니다. Bioprinted 셀 문화 플랫폼, 공동 문화 시스템을 사용 하 여 기질 구성 tumorigenesis의 의존도 공부 하는 독특한 도구를 제공 합니다. 이 기술은 높은 처리량, 저렴 한 비용, 및 높은 재현성, 기능 그리고 그것은 또한 기존의 세포 단층 배양을 다른 모델 및 암 생물학 연구를 동물 종양 모델을 제공할 수 있습니다.

Introduction

2 차원 세포 배양은 암 연구에서 널리 이용 된다, 비록 제한 영양분과 산소의 동일한 농도로 단층 형태로 재배 되 고 세포 존재 합니다. 이러한 문화는 중요 한 셀 부족과 상호 작용 세포-매트릭스 네이티브 종양 microenvironment (TME)에 제시. 따라서, 이러한 모델 제대로 탈 셀 동작, 등 부자연 스러운 형태학, 불규칙 한 수용 체 조직, 막 분극, 다른 비정상적인 유전자 발현의 결과로 생리 조건 정리 조건^1,2,,34. 다른 한편으로, 3 차원 세포 배양, 어디 집계, spheroids, 또는 organoids로 체적 공간에서 세포를 확장 수 더 정확한 생체 외에서 근본적인 세포 생물학과 생리학을 공부 하는 대안 기술을 제공 합니다. 3D 세포 배양 모델 수 또한 네이티브 TME 생체 외에서^1,,45의 중요 한 생리 적 특성은 세포-ECM 상호 작용을....

Protocol

1. 재료, 하이드로 겔, 셀 문화 자료의 준비

1. 소재와 솔루션 준비
   1. 세척 하 고 건조 한 250 mL 및 100 mL 유리 비 커, 자석 교 반기, 주걱, 10 mL 카트리지, 25 G (0.5의 길이)와 250 µ m의 내경 원통 노즐. 압력가 마로 소독 하 여 자료를 소독 그들에서 121 ° C/15 분/1 atm. 사용까지 무 균 조건 하에서 재료를 유지.
      참고: 공급 업체 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
   2. (여기서 부터는 A3G7로 표기) 3 세대 alginate (3 %w / v)과 젤라틴 (7 %w / v)의 7 g 무게.
   3. 4 h: alginate와 젤라틴 분말, 파라핀 필름, 알루미늄 호 일 조각 5 cm², 및 1 mL와 5 mL 주사기에 대 한 자외선 아래에서 다음 항목을 소독. 적어도 4 h 70% 에탄올에 그들을 immersing 하 여 끝 모자, 팁 모자, 및 피스톤을 소독 하 고 그들을 씻어 소독된 울트라 순수 물으로 2 배.
      참고: 공급 업체 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
   4. 4g 울트라 순수 물 agarose 녹이 고 압력....

Results

온도 스윕 25 ° C와 37 ° C에서 A3G7 전조의 뚜렷한 차이 보여줍니다. 전조는 37 ° C에 액체 있으며 1938.1 ± 84.0 mPa의 복잡 한 점도 큰 G에 의해 유효성이 검사 되는 s, x "G 이상 '. 으로 온도 감소, 전조 트라이-나선 형성^29,30에 젤라틴 분자의 자발적인 물리적 녹 채 인해 실제 겔 화를 겪 습. 모두 G'는 g "증가 하 고 솔-젤 전환을 나타내는 30.6 ° C에 수렴. 계수 468.5 ± 34.2 도달 감소 온도 증가를 계속 Pa의 G'와 140.7 ± 9.3 G의 Pa "25 ° C (그림 1a)에서. 우리는 인쇄 온도 25 ° C를 선택 온도 청소의 결과에 따라. 겔 화 속도 론 실험 시뮬레이션 샘플 준비 및 처리 하는 동안 발생 하는 온도 변화 (즉

Discussion

셀-라덴 구조 오염 (생물학 또는 화학) 과정에서 어느 시점에 발생 하는 경우 손상 될 수 있습니다. 일반적으로, 생물 학적 오염 2 후 본 또는 색 문화의 3 일 문화 미디어 또는 bioprinted 구조 변경. 따라서, 살 균 (물리적, 화학적 소독) 모든 셀 관련 프로세스에 대 한 중요 한 단계 이다. 주목할 만한, 압력가 마로 소독 젤라틴 우리가 실시 하는 시험에서 느리게 젤 만든 고 속성을 변경 합니다. 따라서, 우리는 노출을 통해 UV alginate와 젤라틴 전원 살 균. UV 빛의 아주 한정 된 침투 능력으로 인해 매우 얇은 층 (< 0.5 m m)를 사용 해야 합니다. ³²기계 및 생물 학적 속성 조정 하 alginate과 젤라틴의 농도 임의로 바뀔 수 있다. 현재 작업에서 우리 A3G7, 및 30 일 실험을 통해 높은 안정성을 제공 하는 가교 된 하이드로 겔의 인쇄 창 동안 바람직한 전이성 제공 하므로 선택. 젤라틴의 liquefication를 강화 하.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
알긴산 나트륨	FMC 바이오폴리머	CAS-No: 9005-38-3	Protanal LF 10/60 FT
젤라틴	시그마-알드리치	G9391	소 가죽에서 추출한 B형 젤라틴
Dubelcco의 인산염 완충 식염수(DPBS 1X)	Gibco	LS14190136	1×, 칼슘 없음, 마그네슘
없음 마그네틱 핫플레이트	Corning	N/A	교반기/핫 플레이트 모델 PC-420
50 mL 원심분리기 튜브	Corning	352098	Falcon®reg; 50mL 고선명도 PP 원심분리기 튜브, 원뿔형 바닥, 멸균
원심분리기	GMI	N/A	Sorvall RT6000D, GMI, USA
염화칼슘 무수	Sigma-Aldrich	C1016
MilliQ water	Millipore	N/A
밀리포어 0.22 &마이크로; m 필터	Millipore	SLGS033SB	Millex-GS 주사기 필터 유닛, 0.22  &마이크로; M, 혼합 셀룰로오스 에스테르, 33  mm, 에틸렌 옥사이드 멸균
진동 유변계 MCR 302	Anton Paar	N/A
유변계 측정 도구 CP25	Anton Paar	79038	유변계용 원추형 플레이트 형상
RheoCompass	Anton Paar	해당 없음	유변계 제어 소프트웨어 MCR 302
주사 전자 현미경	Hitachi	N/A	SEM, 히타치 SU-3500 가변 압력
파라포름알데히드, 96%, 엑스트라 퓨어	Acros Organics	416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11965092
항생제/항진균 용액(100X) 안정화	Sigma	A5955
Fetal bovine serum	Wisent Bioproducts	080-150
세포 배양 T-75 플라스크	Sigma-Aldrich	CLS430641	75 cm2 TC 처리 표면 처리
3D 바이오프린터 BioScaffolder 3.1	GeSiM	해당 사항 없음
GeSim 소프트웨어 GeSiM		해당 사항 없음	BioScaffolder 3.1
10cc 카트리지 UV 레지	제어 소프트웨어 EFD Nordson	7012126
엔드 캡	EFD Nordson	7014472
팁 캡	EFD Nordson
피스톤	EFD Nordson	7012182
스테인리스 노즐 G25	EFD Nordson	7018345
수조	VWR	N/A
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	바이오시약, 분자생물학
Costar 6-웰 플레이트	Corning	3516	TC 처리된 다중 웰 플레이트, 개별 포장, 멸균
컨포칼 회전 디스크 도립 현미경	Olympus Life Science	N/A	Olympus IX83
MTS 분석 키트	Promega	G3582	CellTiter 96® Q어우러운  One Solution 세포 증식 분석
Live/Dead viability cytotoxicity kit	Molecular Probes,ThermoFisher Scientific	L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X	Gibco	25200-072
Corning 96-well plate	Corning	3595	Clear Flat Bottom 폴리스티렌 TC-Treated Microplate, 개별 포장, 저증발 뚜껑, Sterile
Autoclave Tuttnauer	Heidolph Brinkmann	N/A	Heidolph Tuttnauer 2540E 오토클레이브 살균기 전자 모델, 4개의 스테인레스 스틸 트레이, 23L 용량
Trypan blue	Invitrogen	T10282	0.4% 용액
에탄올	상업용 알코올	P016EA95	그린필드 특수 알코올
CO2 인큐베이터	Panasonic	N/A	MCO 19AIC-PA
동결건조기	SP Scientific	해당 없음	Virtis Sentry 2.0
SolidWorks	Dassault Systems	해당 없음	데모스트러티브 프로펠러와 같은 모델을 만드는 데 사용되는 CAD 소프트웨어
MATLAB	The MathWorks	해당 없음	BioScaffolder 3.1의 G-코드를 생성하는 데 사용되는 프로그래밍 소프트웨어