대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.
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이 논문에서
요약
초록
Immunophenotypic 특성 및 분자 분석이 윤곽을 그리 다 뚜렷한 세포 인구를 정의 하 오랫동안 사용 되어 왔습니다. 그러나 FACS은 본질적으로 단일 세포 분석 실험, 분자 분석 하기 전에, 대상 셀은 종종 prospectively 절연 되어 대량, 따라서 단일 셀 해상도 잃고. 단일 셀 유전자 표정 분석 이종 세포 인구에 있는 개별 셀 사이의 분자 차이 이해 하는 수단을 제공 합니다. 대량 세포 분석에서 고유한 셀 형식의 overrepresentation 생물 학적 중요성으로 편견 및 희소 한 세포에서 신호 않기에 결과. FACS 인덱스 정렬 단일 셀 유전자 표정 분석을 결합 하 여 인구 조사 수 단일 셀 해상도의 손실 없이 중간 세포 표면 마커 식 세포 또한 점령 하 고, 하는 동안 평가 활성화 연속 표면 마커 식의 관련성입니다. 여기, 우리는 단일 셀 반전 녹음 방송 결합 하는 접근 방식을 설명 정량 PCR (RT-정량) 및 FACS 색인 동시에 분자의 특성을 정렬 하 고 셀 인구 내의 immunophenotypic이.
단일 셀 RNA 시퀀싱 방법, 달리 특정 대상 증폭 정량 Pcr 사용 하 여 동안 수 있습니다 적은 낙후, 낮은 풍부 성적표의 강력한 측정 셀 변화에 읽기에 관련 된 문제에 의해 혼동 하지는 깊이입니다. 또한,에 의해 직접 인덱스 정렬 단일-세포 세포의 용 해로,이 방법은 버퍼 수 있게 cDNA 합성 및 특정 대상 사전 증폭 세포 표면 분자 서명 이후에 파생된의 상관 관계 뿐만 아니라 한 단계에서 수행할 수 표식 식입니다. 기술된 접근, 조 혈 단일 세포를 조사 하지만 또한 다른 세포 유형에 성공적으로 사용 되었습니다 개발 되었습니다.
끝으로, 여기에 설명 된 접근 분자로 별개 부분 모집단의 후속 예비 격리 프로토콜을 개발 하 패널에 대 한 가능성과 함께 미리 선택 된 유전자의 mRNA 표현의 중요 한 측정에 대 한 수 있습니다.
서론
각 개별 혈액 세포 어디 줄기 세포 형성 결국 말기 특정 들고 최종 효과 기 세포로 분화 하는 점점 더 최선을 다하고 중간 창시자의 시리즈 위에 정점 세포 계층 구조에서 것으로 생각 됩니다. 생물 학적 기능1. 줄기 세포 시스템 구성 방식에 대 한 지식을 많이 크게 능력을 고도로 농축 줄기 세포 또는 다양 한 창시자2 가지 조 혈 인구 prospectively 분리 때문에 조 혈 시스템에 생성 된 FACS 정렬. 이 분석 기능 또는 분자로, 주로 유전자 발현 프로 파일링3,4를 통해 이러한 인구의 많은 수 있다. 그러나 때 대량 인구 개별 차이 세포의 유전자 발현을 분석은 평균 밖으로 하 고5를 잃었다. 따라서, 이기종 셀 분수 내 셀 변화를 감지 하는 무능 경우 셀의 작은 하위 집합 그 인구6,의 유추 생물 학적 기능에 대 한 중요 한 생물 학적 과정에 대 한 우리의 이해 혼동 수 있습니다. 7. 반대로, 유전자 식 서명 단일 셀 해상도 조사가 윤곽을 그리 다 셀8overrepresented 하위 집합에서가 영향을 회피 하는 가능성을 제공.
현재까지 단일 셀 유전자 표정 분석을 위한 많은 프로토콜 개발 되었습니다; 각 접근 자체 주의 데. 가장 이른 방법은 이었다 RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기), 한 번에 제한 된 수의 성적을 측정 하지만 독특한 RNA 지역화9,11의 조사에 대 한 수 있습니다. 단일 또는 거의 기록 했다 또한 감지를 PCR과 정량 Pcr를 사용 하 여 초기 방법 개발12. 그러나,이 요즘 대체 되었습니다 동시에 정량 셀의 수백에 셀 당 증명서의 수백의 식을 분석 하 고 따라서 높은 차원이 분석을 사용 하 여 허용 수 있는 마이크로-기반 방법으로 사전 결정 유전자 패널10,13. 최근 RNA 시퀀싱 기반 기술을 널리 사용이 될 단일 세포 분석을 위해 이러한 이론적으로 수 셀의 전체 transcriptome 측정 하 고 그로 인하여 추가 답사 차원이 분석10, 14. Multiplexed 정량 분석 및 단일 셀 RNA 시퀀싱 다른 기능을가지고, 따라서 방법 중 하나를 사용 하 여에 대 한 근거는 타깃 셀의 수 뿐만 아니라 질문에 따라 달라 집니다. 높은 처리량 및 단일 셀 RNA 시퀀싱의 편견, 탐구 특성 함께 셀 당 저가 알 수 없는 셀 또는 큰 인구 조사 때 바람직한. 그러나, 단일 셀 RNA 시퀀싱은 또한 낮은 풍부와 성적 증명서는 중단 하는 경향이 높은 풍부한 성적표를 더 자주 시퀀싱으로 편 파. 이 종종 미묘한 또는 기술적인 잡음15에 숨겨진 중요 한 분자 신호를 공개 bioinformatic 분석에 높은 수요를 상당히 복잡 한 데이터 발생할 수 있습니다. 따라서, 잘 특징이 조직에 대 한 단일 셀 정량 분석을 사용 하 여 미리 결정 뇌관 패널 기능적으로 중요 한 유전자 또는 분자 마커 선택의 질을 결정 하는 민감한, 간단한 접근 될 수 있는 인구입니다. 그러나, 주목 해야 한다 그에 비해 단일 셀 RNA-seq, 셀 당 비용은 단일 셀 정량 방법에 대 한 일반적으로 더 높은. 여기, 우리가 결합 하 여 단일 셀 실시간 정량 Pcr (Teles J. 그 외 여러분 에서 수정 하는 방법 설명 16), FACS 인덱스 인구 내에서 분자와 immunophenotypic이 특징에17 및 생물 정보학 분석18 를 동시에 정렬.
이 방법에서는, 관심사의 세포 인구, 스테인드 그리고 단일 세포 세포의 용 해 버퍼 96 잘 PCR 접시에서에 직접 FACS에 의해 정렬 됩니다. 동시에, 세포 표면 마커 추가 집합 식 수준의 FACS 라고 인덱스 정렬 방법-정렬, 하는 동안 각 단일 셀에 대 한 기록 됩니다. Lysed 세포 물자는 연속적으로 증폭 하 고 실시간 정량, 미세 플랫폼을 사용 하 여 선택된 된 유전자의 유전자 발현 분석. 이 전략에는 각 개별 셀의 세포 표면 마커 식의 정렬 된 단일 셀으로 동시 특성화의 분자 분석 수 있습니다. 직접 인덱스 정렬 된 표시자의 식 세포의 분자로 고유 하위 집합을 매핑하여,를 모집단 그들의 잠재 격리에 대 한 사용할 수 있는 특정 immunophenotype에 연결할 수 있습니다. 메서드를 설명 하는 그림 1에서 단계적으로. 미리 정해진된 유전자 패널 더 미묘한 유전자 식 신호를 가리고 그렇지 않으면 수 없는 풍부한 유전자의 측정 circumvents 이후 타겟된 유전자 발현의 높은 해상도에 기여 한다. 또한, 특정 대상 확대, 한 단계 반전 녹음 방송, 그리고 증폭 녹음 방송 요인 또는 비 폴 리 adenylated RNAs 같은 낮은 표현된 성적표의 강력한 측정에 대 한 수 있습니다. 중요 한 것은, 정량 방법에서 특정 악성 질병19를 조사할 때 중요 한 융해 단백질 mRNA의 측정에 대 한 수 있습니다. 마지막으로, 유전자의 집중된 수 조사, 낮은 드롭 아웃 요금, 및 제한 된 셀 확인이이 방법은 쉽게 분석 기술 차이 단일 셀 RNA-이 같은 높은 차원 방법에 비해 프로토콜에 따라, 전체 실험 수행할 수 있습니다, 정렬 셀 분석된 결과를 3 일 이내 중요 한, 높은 처리량 단일 셀 유전자 표정 분석에 대 한 단순 하 고 빠른 방법 만들기에서.
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프로토콜
1입니다. 세포 접시의 준비
- 390 µ L nuclease 무료 물, 10%의 17 µ L를 혼합 하 여 10% 추가, 96 웰 스에 대 한 충분 한 세포의 용 해 버퍼 준비 RNA/DNA 무료 벤치를 사용 하 여 NP-40, 2.8 µ L 10 mM dNTP, 10 µ L 0.1 M DTT와 5.3 µ L RNAse 억제제 ( 재료의 표참조). 와 동 그리고 아래로 회전입니다.
- 96 잘 PCR 플레이트의 각 음에 세포의 용 해 버퍼의 4 µ L 고 접착 필름으로 접시를 봉인. 접시의 바닥에 액체를 수집 하는 튜브 아래로 회전 합니다. 셀 정렬 (최대 24 시간)까지 얼음에 플레이트를 유지.
2입니다. 셀 정렬 셀의 준비
- 적절 한 수의 실험에 대 한 (여기, CD34 풍부한 조 혈 줄기와 조상 세포) 셀 동 1 x 106 세포는 약 3 96 잘 접시 컨트롤에 포함 된 단일 셀의 정렬 적합 합니다.
- 15 mL 원뿔 튜브에 해 동된 셀을 전송 하 고 1 mL FBS 모든 30 추가 s 8 mL의 총 볼륨에 도달할 때까지. 셀 4 ° C에서 10 분 동안 350 x g 에서 원심 분리기에서 회전 하 고 상쾌한을 제거 합니다.
- Resuspend 8 mL 버퍼 얼룩에 셀 (PBS 2 %FBS) 4 ° C에서 10 분 동안 350 x g 에서 원심과 상쾌한 제거.
- 200 µ L 얼룩에서 resuspend 셀 버퍼링 하 고 셀 제어 얼룩을 제거.
- 50에 세포의 일부분을 얼룩에 의해 한 컨트롤 (FMOs) 각 fluorophore 마이너스 형광을 확인 µ L 버퍼 얼룩. 이 예제에서 20000 셀 6 microcentrifuge 튜브는 FMOSs로 사용 됩니다. 참고 셀의 수는 인구 조사에 따라 조정 되어야 한다. 각 튜브를 하나 제외 샘플 얼룩 처럼 동일한 농도에서 모든 항 체를 추가 합니다.
- 각 fluorophore 사용에 대 한 50 µ L 버퍼에 셀의 일부를 착 색 하 여 각 fluorophore에 대 한 하나의 얼룩을 확인 합니다. 이 예제에서 20000 셀 6 microcentrifuge 튜브 사용 됩니다. 참고 각 항 체에 대 한 대상 컨트롤에 사용 되는 세포에 의해 표현 될 필요가. 개별 튜브에서 샘플 얼룩 처럼 동일한 농도에서 각 항 체를 추가 합니다. 또한 흠 없는 컨트롤로 50 µ L에 20000 흠 없는 셀을 계속.
- 셀 샘플을 그들의 적절 한 농도에서 항 체를 추가 합니다. 사용 1/100 농도, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 및 혈통 믹스에서 CD34-FITC 운항: CD3-PECy5 1/50, c d 2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, 및 CD235a-PECy5 1/1000입니다.
- 어둠 속에서 얼음에 30 분을 위한 항 체와 세포를 품 어.
- 셀 3 mL 버퍼 얼룩이 씻어. 4 ° C에서 10 분 동안 350 x g 에서 세포를 원심 고 상쾌한을 제거 합니다.
- Resuspend 셀 고 2.9 단계를 반복 합니다.
- 500 µ L에서 샘플 및 100에서 FMOs resuspend µ L 버퍼 1/100 7AAD 및 필터 세포를 단일 세포 현 탁 액을 50 µ m 필터를 통해 얼룩.
3. 셀 정렬
- FACS 기계 설정 되어 있는지 확인 드롭 지연 및 cytometer 설치 및 추적 (중부 표준시) 적절 한 셀 정렬 있도록 제조업체의 지침에 따라 수행 되었습니다 최근 그와 제대로. 조 혈 모 세포에 대 한 4의 85 미크론 노즐과 최대 속도의 사용은 권장, 최적의 이벤트 속도가 800 및 2000 이벤트/s 사이.
- 형광 보상을 수행 하 여 스펙트럼 중첩에 대 한 수정 하 고 게이츠 FMO 컨트롤 또는 내부 부정적인 컨트롤 설정.
- 대상 인구의 해도 얼룩 버퍼의 100 µ L 가진 새로운 microcentrifuge 관으로 적어도 100 대상 셀을 정렬 하 여 수행 합니다. FACS 정렬된 셀 정렬된 샘플을 기록 하 여 분석 하 고 그들은 정렬 게이트에서 결국 다는 것을 확인 한다.
- 설정 단일 셀 플레이트 96 잘 접시에 잘 A1 드롭 중심으로 정렬. 중심은 50-100 6 µ m 입자 모든 우물 우물 모든 셀의 각 센터에 얻을 것 이다 있도록 빈 96 잘 접시의 가장자리 주위에 정렬 됩니다.
- 만약에 가능 하다 면, 가능한 셀 정렬 되도록 추가 제어 생체 외에 성장에 대 한 단일 셀을 정렬 하 여 추가할 수 있습니다. Haematopoietic 셀 FLT3L, TPO, SCF 1% 페니실린 스, 100 ng/mL로 100 µ l SFEM에서에서 U-하단 96 잘 접시에서 자란 수 있습니다. 3 일 후에 문화는 현미경을 사용 하 여 셀 식민지를 위한 각 잘 분석.
- 플레이트에서 접착 필름을 제거 합니다. 96 웰 스에서 92에 (여기에 린-CD34 + CD38-세포)의 단일 셀 정렬 각 단일 셀에 대 한 (여기 CD45RA, CD49f, 및 CD90) 다른 표식에 대 한 immunophenotypic 프로필을 저장 하는 소프트웨어를 정렬 FACS에 인덱스 정렬 활성화 합니다.
- 10 및 20 각각 선형성 컨트롤 PCR 증폭에 대 한 세포와 2 개의 우물을 정렬 합니다. 웰 스 h 1과 h 2 일반적으로 사용 됩니다.
- 아니오-템플릿 컨트롤, 일반적으로 우물 H3 및 H4 셀 없이 2 개의 우물을 유지.
- 명확한 접착제 필름으로 접시를 봉인 하 고 스냅 드라이 아이스에 냉동 하기 전에 1 분 동안 300 x g 에서 접시를 회전.
- -80 ° c.에 냉동된 번호판을 저장
참고: 안전 정지 지점입니다. 정렬 및 lysed 세포는 장기 저장을 위한-80 ° C에 보관 수 있습니다.
4. 반전 전사 및 특정 대상 확대
- 등 내부 관리 유전자 뇌관 뇌관 제어용 아군에서 RNA, RNA/DNA 무료 벤치에 RNAse 무료 튜브 1.5 mL에 각 뇌관 쌍의 2 µ L을 추가 하 여 모든 96 유전자 표적을 위해 뇌관 믹스를 준비 합니다. 미만 96 뇌관을 사용 하 여, nuclease 무료 물 없는 뇌관에 대 한 해당 볼륨을 추가 합니다. 프라이 머는 별도로 원하는 유전자 패널에 맞게 정렬 됩니다.
- 반전 녹음 방송 및 혼합 반응 혼합 x 632.5 µ L 2, 101.2 µ L을 추가 함으로써 특정 대상 확대 Taq/SuperscriptIII, 151.8 µ L 뇌관 믹스, 그리고 0.7 µ L 제어 RNA에에서 아군. 이 단계는 DNA 무료 벤치에 예비적 형성. Vortexing와 수집 튜브의 하단에 있는 액체 아래로 회전 급강하에 의해 혼합. 샘플에 추가 될 때까지 얼음에 계속.
- 반응 혼합 x 2의 27.5 µ L, Taq 효소의 1.76 µ L, 뇌관 믹스의 6.6 µ L, nuclease 무료 물 2.64 µ L를 혼합 하 여 4 개의 우물에 대 한 만들기 없음 반전 전사 제어 믹스. 제어 RNA에에서 스파이크. DNA 무료 벤치에이 단계를 수행 합니다. 와 동 그리고 샘플 수집 튜브 및 추가까지 얼음에 계속의 하단에 있는 액체 아래로 회전.
- Lysate 번호판 얼음에 녹여 92 웰 스, 선형성 및 아니오-템플릿 컨트롤을 포함 하 여 이전에 준비 된 반전 녹음 방송 및 특정 대상 확대 믹스 8.75 µ L를 추가 합니다. 4 나머지 우물을 아니 반전 전사 제어 믹스의 8.75 µ L를 추가 합니다. 명확한 접착제 필름 및 수집 액체 접시의 바닥에 아래로 회전 접시를 봉인.
- 반전 녹음 방송 및 특정 대상 증폭 앰프 프로그램;에 따라 PCR 기계에서 접시를 실행 하 여 예비적 형성 단계 1시 50분 ° C 60 분, 2 분 동안 2: 95 ° C 단계, 단계 3: 95 ° C 15에 대 한 s, 단계 4: 60 ° C 4 분, 반복 단계 3-4 24 시간 및 마지막으로 영원히 5: 8 ° C 단계.
- PCR를 완료 한 후 단기 저장을 위해 8 ° C 및 장기 저장을 위한-20 ° C에서 접시를 유지.
참고: 안전 정지 지점입니다. 단기 저장을 위해 8 ° C에 그리고 장기 저장을 위한-20 ° C에서 증폭 된 자료를 보관할 수 있습니다.
5. 다중 미세 유전자 표정 분석에 대 한 샘플 및 시험 접시의 준비
- 분석 결과 pipetting 3 접시를 로드 준비 µ L 분석 결과 로딩 시 약 96 잘 접시의 각 음에. 플레이트 로드 분석 결과에서 개별 우물에 각 뇌관의 3 µ L를 추가 합니다.
- 접착 필름 및 플레이트의 하단에 수집 액체 아래로 회전 접시를 봉인.
- 준비 희석 플레이트 nuclease의 pipetting 8 µ L에 의해 무료 물 96 잘 접시의 모든 우물에. 1: 5의 최종 희석 하는 희석 접시에 증폭 된 샘플의 2 µ L를 추가 합니다.
- 접착 필름 판 인감, 10 vortexing 격판덮개에 의해 혼합 s, 그리고 마지막으로 수집 액체 접시의 바닥에 아래로 회전.
- 샘플 로드 믹스 마스터 믹스의 352 µ L의 샘플 로딩 시 약 35.2 µ L 신중 하 게 혼합 하 여 준비 합니다. Aliquoting 3.3 µ L 로드 96 잘 접시의 각 잘 혼합 하 여 샘플 로드 접시를 준비 합니다.
- 접시를 로딩 하는 샘플의 각 음에 희석된 샘플에서 2.7 µ L를 추가 합니다.
- 접착 필름 및 플레이트의 하단에 수집 액체 아래로 회전 접시를 봉인.
6. 미세 칩의 로드
- 새로운 96 x 96 미세 칩을 가져가 라. 파고 그들 모자와 주사기에 이동 될 수 있다 다는 것을 확인 하 여 후미를 준비 합니다.
- 주사기에서 거품을 제거 합니다. 기울이기 칩 45도 하면서 밸브를 누르고 각 밸브를 주사기의 전체 볼륨을 추가 합니다. IFC 컨트롤러 칩을 프라임.
- 플레이트 로드 분석 결과에서 우물의 각에서 각 분석 결과 입구 4.25 µ L로를 로드 합니다. 거품을 하지 마십시오. 거품에는 잘 표시, 피 펫 팁 그들을 제거 합니다.
- 플레이트 로드 샘플에 우물의 각에서 각 샘플 입구 4.25 µ L로 로드 continue, 거품을 방지 하 고 거품 표시, 피 펫 팁 그들을 제거.
- IFC 컨트롤러 칩을 로드 합니다.
- 칩도 외모와 모든 챔버 로드 된 확인 하십시오. 테이프와 그것으로 칩 표면에서 먼지를 제거 합니다. 멀티플렉스 미세 유전자 식 플랫폼에 칩을 실행 합니다.
7. 다중 미세 유전자 식 플랫폼에 칩 실행
- 멀티플렉스 미세 유전자 식 플랫폼으로 칩을 로드 한 후 샘플을 이름을 지정 합니다.
- 이용한 수동 염료로 설정 합니다. 형광으로 단일 프로브 및 팸-MGB를 설정 합니다. 96 x 96 표준 v 2를 사용 하 여 프로토콜. 실행 시작.
- 제거 칩 실행 하면 완료 됩니다.
8. 예비 분석 칩 실행의
- 실시간 PCR 분석 소프트웨어에 데이터를 로드 합니다.
- 세포 및 유전자 레이아웃 탭으로 구분 된 파일에서 풀 칠해서 유전자 이름 및 셀 이름을 로드 합니다.
- 이미지 보기를 열고 고 염료를 이용한 선택 합니다. 모든 웰 스를 이용한 수동 염료 있다면 확인 하십시오.
- 모든 증폭 플롯 확인 ( 그림 3E비슷합니다) 없이 스파이크와 부드러운 증폭 곡선으로 본다면 조사.
- 모든 단일 세포 아군에 제어 모두 제대로 로드는 다는 것을 확인 하는 RNA의 식을 확인 합니다.
- 모든 셀 내부 관리 유전자 발현 있고 따라서 제대로 정렬 된 것을 확인 합니다.
- 10 및 20 셀 선형성 제어 선형 증폭을 확인 하기 위해 약 1 CT 차이가 있는지 확인 합니다.
- NoRT 컨트롤 샘플 식 인지 확인 합니다. 식을 noRT에 감지 되 면 후속 실행에 대 한 게놈 DNA를 검색 하지 않습니다 프로브에 프로브를 변경 하는 것이 좋습니다.
- 추가 분석을 위해 csv 파일에서 데이터를 내보냅니다.
9. 단일 세포 분석 SCExV를 사용 하 여
참고: 입문 영화 존재20 도구를 소개 하는. 여기, 프로토콜에 도입 하는 컨트롤을 사용 하 여 분석을 수행 하는 방법의 짧은 추천 제공 됩니다.
- SCexV 웹사이트20에 연결 합니다.
- 내보낸된 CSV 파일을 업로드.
- 긍정적인 통제로 제어 RNA에서 아군을 선택 했다. 25 위 제어 RNA CT는 모든 셀을 제거 합니다. 중간 식 제어 RNA의 데이터를 정상화.
- "다 여기-> 분석"을 클릭 합니다. 제외 셀 옵션에서 noRT, notemplate, 10 및 20 셀 컨트롤을 제거 합니다.
- 클러스터의 예상된 번호 선택의 클러스터링 방법으로 클러스터 셀. 분석된 값을 내보냅니다.
10. 인덱스 정렬 분석
- FACS 분석 소프트웨어 열고 인덱싱된 샘플을 로드 합니다.
- 스크립트 편집기를 열고 퀸 제이 외 에서 사용할 수 있는 스크립트를 실행 21
- FACS 분석 소프트웨어 단일 셀의 각 게이트를 만든 해야, 레이아웃 편집기를 열고 고 ("Sample_complete_Data.xls" 라는 파일에서 사용할 수 있는) SCexV에서 그룹화에 따라 셀 색.
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결과
설명 하는 프로토콜은 빠르고 쉽게 수행 하 고 신뢰할 수 있는. 실험 설정에 대 한 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 전체 프로토콜 특정 대상 확대, 유전자 식 측정 및 예비 분석 단일 셀의 정렬에서 3 일 동안에서 수행할 수 있습니다. 96 뇌관 및 만성 골수성 백혈병 (CML) 환자에서 96 셀 이나 건강 세 일치에서 96 셀을 사용 하 여 단일 셀 유전자 표정 분석에서 예비 분석 된 데이터를 나타내는 열 지도 형태로 분석된 결과의 예 제어는 그림 2에 표시 됩니다. 계층적 클러스터링을 사용 하 여, 분석 된 세포는 그들의 유전자 식 서명 기반 4 개의 하위 그룹으로 나눌 수 있습니다. 열 지도 시각화 분석 (예를 들어, 제어 우물)에서 제외 해야 하는 웰 스에 대 한 제어로 뿐만 아니라 데이터에 대 한 개요를 얻을 수 있는 편리한 방법입니다. <...
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토론
최근 몇 년 동안, 단일 셀 유전자 표정 분석은 다양 한 세포 인구23의 정의에 가치 추가 되었다. 그러나 이러한 메서드는 셀 시퀀싱 깊이 탈락에 의해 복잡 하 게 RNA 시퀀싱 기술의 출현 이론적으로 셀의 전체 transcriptome 측정 하는 가능성을 제공 합니다. 단일 셀 정량 제공 중요 한 유전자에 있는 모든 세포의 수백의 식의 과민 하 고 강력한 분석 기술 노이즈 감소 마찬가지로 처리 됩니다. 성적 증명서의 제한 된 수의 집중된 분석 또한 매우 표현된 유전자에서 간섭 없이 단순화 된 분석을 위해 수 있습니다.
만 셀에 표현 하는 유전자의 하위 집합을 조사 하는 접근 그것 이므로 매우 유전자 패널을 설계 할 때 유전자의 정확한 세트를 선택 하는 것이 중요. 유전자의 선택; 여러 가지 방법으로 할 수 있습니다. 통해 문학, 대량 분석 및 공개적으로 사용 가능한 데이터의 생물 정보학 분석에 의해 이전 연구 결과. 이것은 간단 합니다...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 의료 연구, 스웨덴어 유년기 암 재단, 라 그 나 Söderberg 재단, 그리고는 크누트와 앨리스 발 렌 버그 재단에 대 한 스웨덴의 암 사회, 스웨덴 연구 위원회, 스웨덴의 사회에서 교부 금에 의해 지원
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | 클론: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | 클론: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | 클론: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | 클론: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | 클론: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | 클론: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | 클론: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | 클론 GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | 클론: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | 클론: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | 클론: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | 클론: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | 클론: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-바닥 플레이트 | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | 줄기 세포 기술 | 9650 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | ||
| Accudrop 비즈 | BD | 345249 | 6 µ M 입자 |
| 접착 필름 Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| 접착 필름 호일 | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 웰 PCR 플레이트 | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL 튜브 | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10 mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1 M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| from CellsDirect | kit | ||
| 2x | CellsDirect 키트의 | 반응 혼합물 Invitrogen | 11753-100 |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | CellsDirect 키트 | Invitrogen | 11753-100 |
| ; 타크 DNA 중합효소 | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan 세포-CT 제어 키트 | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | TaqMan Cells-to-CT Control Kit | ||
| Cells-to-CT Control Kit | RNA Control Kit 20x Xeno RNA Control TaqMan Gene Expression Assay | Invitrogen | |
| 10개의 IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2x 분석 로딩 시약 | Fluidigm | From 96.96 샘플/로딩 키트 | |
| 20x GE 샘플 로딩 시약 | Fluidigm | From 96.96 샘플/로딩 키트 | |
| 제어 라인 유체 | 96.96 샘플/로딩 키트의 | Fluidigm | |
| TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 동적 어레이 IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar TreeStar | ||
| 플루이다임 실시간 PCR 분석 | 플루이다임 | 이디 | |
| CD179a.VPREB1 | 써모피셔 과학 | Hs00356766_g1 | |
| ACE | 써모피셔 사이언티픽 | Hs00174179_m1 | |
| AHR | 써모피셔 사이언티픽 | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | 써모피셔 사이언티픽 | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher 과학 | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher 과학 | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher 과학 | Hs01890924_s1 | |
| CD10. MME | Thermofisher 과학 | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher 과학 | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher 과학 | Hs00174217_m1 | |
| CD123. IL3RA | 써모피셔 과학 | Hs00608141_m1 | |
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| CD151 | 써모피셔 사이언티픽 | Hs00911635_g1 | |
| CD220. INSR | 써모피셔 과학 | Hs00961554_m1 | |
| CD24. HSA | Thermofisher 과학 | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher 과학 | Hs01094540_m1 | |
| CD26. DPP4 | 써모피셔 사이언티픽 | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | 써모피셔 사이언티픽 | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | 써모피셔 사이언티픽 | Hs00987207_m1 | |
| CD32. FCGR2B | 써모피셔 사이언티픽 | Hs01634996_s1 | |
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| CD352. SLAMF6 | 써모피셔 사이언티픽 | Hs01559920_m1 | |
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| CD56. NCAM1 | 써모피셔 사이언티픽 | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | 써모피셔 사이언티픽 | Hs00233521_m1 | |
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| CDKN1A | 써모피셔 과학 | Hs00355782_m1 | |
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| CSF1r | Thermofisher 과학 | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher 과학 | ||
| CSF3RA | 써모피셔 과학 | Hs01114427_m1 | |
| E2A. TCF3 | Thermofisher 과학 | Hs00413032_m1 | |
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| GAPDH | Thermofisher 과학 | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher 과학 | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher 과학 | ||
| GATA3 | Thermofisher 과학 | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher 과학 | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher 과학 | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher 과학 | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher 과학 | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher 과학 | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher 과학 | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher 과학 | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher 과학 | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher 과학 | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | ||
| Lin28B | Thermofisher 과학 | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher 과학 | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher 과학 | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher 과학 | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher 과학 | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher 과학 | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher 과학 | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher 과학 | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher 과학 | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher 과학 | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher 과학 | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher 과학 | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher 과학 | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher 과학 | Hs00169795_m1 |
참고문헌
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