분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

요약

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

초록

Immunophenotypic 특성 및 분자 분석이 윤곽을 그리 다 뚜렷한 세포 인구를 정의 하 오랫동안 사용 되어 왔습니다. 그러나 FACS은 본질적으로 단일 세포 분석 실험, 분자 분석 하기 전에, 대상 셀은 종종 prospectively 절연 되어 대량, 따라서 단일 셀 해상도 잃고. 단일 셀 유전자 표정 분석 이종 세포 인구에 있는 개별 셀 사이의 분자 차이 이해 하는 수단을 제공 합니다. 대량 세포 분석에서 고유한 셀 형식의 overrepresentation 생물 학적 중요성으로 편견 및 희소 한 세포에서 신호 않기에 결과. FACS 인덱스 정렬 단일 셀 유전자 표정 분석을 결합 하 여 인구 조사 수 단일 셀 해상도의 손실 없이 중간 세포 표면 마커 식 세포 또한 점령 하 고, 하는 동안 평가 활성화 연속 표면 마커 식의 관련성입니다. 여기, 우리는 단일 셀 반전 녹음 방송 결합 하는 접근 방식을 설명 정량 PCR (RT-정량) 및 FACS 색인 동시에 분자의 특성을 정렬 하 고 셀 인구 내의 immunophenotypic이.

단일 셀 RNA 시퀀싱 방법, 달리 특정 대상 증폭 정량 Pcr 사용 하 여 동안 수 있습니다 적은 낙후, 낮은 풍부 성적표의 강력한 측정 셀 변화에 읽기에 관련 된 문제에 의해 혼동 하지는 깊이입니다. 또한,에 의해 직접 인덱스 정렬 단일-세포 세포의 용 해로,이 방법은 버퍼 수 있게 cDNA 합성 및 특정 대상 사전 증폭 세포 표면 분자 서명 이후에 파생된의 상관 관계 뿐만 아니라 한 단계에서 수행할 수 표식 식입니다. 기술된 접근, 조 혈 단일 세포를 조사 하지만 또한 다른 세포 유형에 성공적으로 사용 되었습니다 개발 되었습니다.

끝으로, 여기에 설명 된 접근 분자로 별개 부분 모집단의 후속 예비 격리 프로토콜을 개발 하 패널에 대 한 가능성과 함께 미리 선택 된 유전자의 mRNA 표현의 중요 한 측정에 대 한 수 있습니다.

서론

각 개별 혈액 세포 어디 줄기 세포 형성 결국 말기 특정 들고 최종 효과 기 세포로 분화 하는 점점 더 최선을 다하고 중간 창시자의 시리즈 위에 정점 세포 계층 구조에서 것으로 생각 됩니다. 생물 학적 기능¹. 줄기 세포 시스템 구성 방식에 대 한 지식을 많이 크게 능력을 고도로 농축 줄기 세포 또는 다양 한 창시자^{2 가지 조 혈 인구 prospectively 분리 때문에 조 혈 시스템에 생성 된} FACS 정렬. 이 분석 기능 또는 분자로, 주로 유전자 발현 프로 파일링^3,4를 통해 이러한 인구의 많은 수 있다. 그러나 때 대량 인구 개별 차이 세포의 유전자 발현을 분석은 평균 밖으로 하 고⁵를 잃었다. 따라서, 이기종 셀 분수 내 셀 변화를 감지 하는 무능 경우 셀의 작은 하위 집합 그 인구⁶,^{의 유추 생물 학적 기능에 대 한 중요 한 생물 학적 과정에 대 한 우리의 이해 혼동 수 있습니다. 7}. 반대로, 유전자 식 서명 단일 셀 해상도 조사가 윤곽을 그리 다 셀⁸overrepresented 하위 집합에서가 영향을 회피 하는 가능성을 제공.

현재까지 단일 셀 유전자 표정 분석을 위한 많은 프로토콜 개발 되었습니다; 각 접근 자체 주의 데. 가장 이른 방법은 이었다 RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기), 한 번에 제한 된 수의 성적을 측정 하지만 독특한 RNA 지역화^9,11의 조사에 대 한 수 있습니다. 단일 또는 거의 기록 했다 또한 감지를 PCR과 정량 Pcr를 사용 하 여 초기 방법 개발¹². 그러나,이 요즘 대체 되었습니다 동시에 정량 셀의 수백에 셀 당 증명서의 수백의 식을 분석 하 고 따라서 높은 차원이 분석을 사용 하 여 허용 수 있는 마이크로-기반 방법으로 사전 결정 유전자 패널^10,13. 최근 RNA 시퀀싱 기반 기술을 널리 사용이 될 단일 세포 분석을 위해 이러한 이론적으로 수 셀의 전체 transcriptome 측정 하 고 그로 인하여 추가 답사 차원이 분석^{10, 14}. Multiplexed 정량 분석 및 단일 셀 RNA 시퀀싱 다른 기능을가지고, 따라서 방법 중 하나를 사용 하 여에 대 한 근거는 타깃 셀의 수 뿐만 아니라 질문에 따라 달라 집니다. 높은 처리량 및 단일 셀 RNA 시퀀싱의 편견, 탐구 특성 함께 셀 당 저가 알 수 없는 셀 또는 큰 인구 조사 때 바람직한. 그러나, 단일 셀 RNA 시퀀싱은 또한 낮은 풍부와 성적 증명서는 중단 하는 경향이 높은 풍부한 성적표를 더 자주 시퀀싱으로 편 파. 이 종종 미묘한 또는 기술적인 잡음¹⁵에 숨겨진 중요 한 분자 신호를 공개 bioinformatic 분석에 높은 수요를 상당히 복잡 한 데이터 발생할 수 있습니다. 따라서, 잘 특징이 조직에 대 한 단일 셀 정량 분석을 사용 하 여 미리 결정 뇌관 패널 기능적으로 중요 한 유전자 또는 분자 마커 선택의 질을 결정 하는 민감한, 간단한 접근 될 수 있는 인구입니다. 그러나, 주목 해야 한다 그에 비해 단일 셀 RNA-seq, 셀 당 비용은 단일 셀 정량 방법에 대 한 일반적으로 더 높은. 여기, 우리가 결합 하 여 단일 셀 실시간 정량 Pcr (Teles J. 그 외 여러분 에서 수정 하는 방법 설명 ¹⁶), FACS 인덱스 인구 내에서 분자와 immunophenotypic이 특징에¹⁷ 및 생물 정보학 분석¹⁸ 를 동시에 정렬.

이 방법에서는, 관심사의 세포 인구, 스테인드 그리고 단일 세포 세포의 용 해 버퍼 96 잘 PCR 접시에서에 직접 FACS에 의해 정렬 됩니다. 동시에, 세포 표면 마커 추가 집합 식 수준의 FACS 라고 인덱스 정렬 방법-정렬, 하는 동안 각 단일 셀에 대 한 기록 됩니다. Lysed 세포 물자는 연속적으로 증폭 하 고 실시간 정량, 미세 플랫폼을 사용 하 여 선택된 된 유전자의 유전자 발현 분석. 이 전략에는 각 개별 셀의 세포 표면 마커 식의 정렬 된 단일 셀으로 동시 특성화의 분자 분석 수 있습니다. 직접 인덱스 정렬 된 표시자의 식 세포의 분자로 고유 하위 집합을 매핑하여,를 모집단 그들의 잠재 격리에 대 한 사용할 수 있는 특정 immunophenotype에 연결할 수 있습니다. 메서드를 설명 하는 그림 1에서 단계적으로. 미리 정해진된 유전자 패널 더 미묘한 유전자 식 신호를 가리고 그렇지 않으면 수 없는 풍부한 유전자의 측정 circumvents 이후 타겟된 유전자 발현의 높은 해상도에 기여 한다. 또한, 특정 대상 확대, 한 단계 반전 녹음 방송, 그리고 증폭 녹음 방송 요인 또는 비 폴 리 adenylated RNAs 같은 낮은 표현된 성적표의 강력한 측정에 대 한 수 있습니다. 중요 한 것은, 정량 방법에서 특정 악성 질병¹⁹를 조사할 때 중요 한 융해 단백질 mRNA의 측정에 대 한 수 있습니다. 마지막으로, 유전자의 집중된 수 조사, 낮은 드롭 아웃 요금, 및 제한 된 셀 확인이이 방법은 쉽게 분석 기술 차이 단일 셀 RNA-이 같은 높은 차원 방법에 비해 프로토콜에 따라, 전체 실험 수행할 수 있습니다, 정렬 셀 분석된 결과를 3 일 이내 중요 한, 높은 처리량 단일 셀 유전자 표정 분석에 대 한 단순 하 고 빠른 방법 만들기에서.

프로토콜

1입니다. 세포 접시의 준비

1. 390 µ L nuclease 무료 물, 10%의 17 µ L를 혼합 하 여 10% 추가, 96 웰 스에 대 한 충분 한 세포의 용 해 버퍼 준비 RNA/DNA 무료 벤치를 사용 하 여 NP-40, 2.8 µ L 10 mM dNTP, 10 µ L 0.1 M DTT와 5.3 µ L RNAse 억제제 ( 재료의 표참조). 와 동 그리고 아래로 회전입니다.
2. 96 잘 PCR 플레이트의 각 음에 세포의 용 해 버퍼의 4 µ L 고 접착 필름으로 접시를 봉인. 접시의 바닥에 액체를 수집 하는 튜브 아래로 회전 합니다. 셀 정렬 (최대 24 시간)까지 얼음에 플레이트를 유지.

2입니다. 셀 정렬 셀의 준비

1. 적절 한 수의 실험에 대 한 (여기, CD34 풍부한 조 혈 줄기와 조상 세포) 셀 동 1 x 10⁶ 세포는 약 3 96 잘 접시 컨트롤에 포함 된 단일 셀의 정렬 적합 합니다.
2. 15 mL 원뿔 튜브에 해 동된 셀을 전송 하 고 1 mL FBS 모든 30 추가 s 8 mL의 총 볼륨에 도달할 때까지. 셀 4 ° C에서 10 분 동안 350 x g 에서 원심 분리기에서 회전 하 고 상쾌한을 제거 합니다.
3. Resuspend 8 mL 버퍼 얼룩에 셀 (PBS 2 %FBS) 4 ° C에서 10 분 동안 350 x g 에서 원심과 상쾌한 제거.
4. 200 µ L 얼룩에서 resuspend 셀 버퍼링 하 고 셀 제어 얼룩을 제거.
5. 50에 세포의 일부분을 얼룩에 의해 한 컨트롤 (FMOs) 각 fluorophore 마이너스 형광을 확인 µ L 버퍼 얼룩. 이 예제에서 20000 셀 6 microcentrifuge 튜브는 FMOSs로 사용 됩니다. 참고 셀의 수는 인구 조사에 따라 조정 되어야 한다. 각 튜브를 하나 제외 샘플 얼룩 처럼 동일한 농도에서 모든 항 체를 추가 합니다.
6. 각 fluorophore 사용에 대 한 50 µ L 버퍼에 셀의 일부를 착 색 하 여 각 fluorophore에 대 한 하나의 얼룩을 확인 합니다. 이 예제에서 20000 셀 6 microcentrifuge 튜브 사용 됩니다. 참고 각 항 체에 대 한 대상 컨트롤에 사용 되는 세포에 의해 표현 될 필요가. 개별 튜브에서 샘플 얼룩 처럼 동일한 농도에서 각 항 체를 추가 합니다. 또한 흠 없는 컨트롤로 50 µ L에 20000 흠 없는 셀을 계속.
7. 셀 샘플을 그들의 적절 한 농도에서 항 체를 추가 합니다. 사용 1/100 농도, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 및 혈통 믹스에서 CD34-FITC 운항: CD3-PECy5 1/50, c d 2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, 및 CD235a-PECy5 1/1000입니다.
8. 어둠 속에서 얼음에 30 분을 위한 항 체와 세포를 품 어.
9. 셀 3 mL 버퍼 얼룩이 씻어. 4 ° C에서 10 분 동안 350 x g 에서 세포를 원심 고 상쾌한을 제거 합니다.
10. Resuspend 셀 고 2.9 단계를 반복 합니다.
11. 500 µ L에서 샘플 및 100에서 FMOs resuspend µ L 버퍼 1/100 7AAD 및 필터 세포를 단일 세포 현 탁 액을 50 µ m 필터를 통해 얼룩.

3. 셀 정렬

1. FACS 기계 설정 되어 있는지 확인 드롭 지연 및 cytometer 설치 및 추적 (중부 표준시) 적절 한 셀 정렬 있도록 제조업체의 지침에 따라 수행 되었습니다 최근 그와 제대로. 조 혈 모 세포에 대 한 4의 85 미크론 노즐과 최대 속도의 사용은 권장, 최적의 이벤트 속도가 800 및 2000 이벤트/s 사이.
2. 형광 보상을 수행 하 여 스펙트럼 중첩에 대 한 수정 하 고 게이츠 FMO 컨트롤 또는 내부 부정적인 컨트롤 설정.
3. 대상 인구의 해도 얼룩 버퍼의 100 µ L 가진 새로운 microcentrifuge 관으로 적어도 100 대상 셀을 정렬 하 여 수행 합니다. FACS 정렬된 셀 정렬된 샘플을 기록 하 여 분석 하 고 그들은 정렬 게이트에서 결국 다는 것을 확인 한다.
4. 설정 단일 셀 플레이트 96 잘 접시에 잘 A1 드롭 중심으로 정렬. 중심은 50-100 6 µ m 입자 모든 우물 우물 모든 셀의 각 센터에 얻을 것 이다 있도록 빈 96 잘 접시의 가장자리 주위에 정렬 됩니다.
5. 만약에 가능 하다 면, 가능한 셀 정렬 되도록 추가 제어 생체 외에 성장에 대 한 단일 셀을 정렬 하 여 추가할 수 있습니다. Haematopoietic 셀 FLT3L, TPO, SCF 1% 페니실린 스, 100 ng/mL로 100 µ l SFEM에서에서 U-하단 96 잘 접시에서 자란 수 있습니다. 3 일 후에 문화는 현미경을 사용 하 여 셀 식민지를 위한 각 잘 분석.
6. 플레이트에서 접착 필름을 제거 합니다. 96 웰 스에서 92에 (여기에 린-CD34 + CD38-세포)의 단일 셀 정렬 각 단일 셀에 대 한 (여기 CD45RA, CD49f, 및 CD90) 다른 표식에 대 한 immunophenotypic 프로필을 저장 하는 소프트웨어를 정렬 FACS에 인덱스 정렬 활성화 합니다.
7. 10 및 20 각각 선형성 컨트롤 PCR 증폭에 대 한 세포와 2 개의 우물을 정렬 합니다. 웰 스 h 1과 h 2 일반적으로 사용 됩니다.
8. 아니오-템플릿 컨트롤, 일반적으로 우물 H3 및 H4 셀 없이 2 개의 우물을 유지.
9. 명확한 접착제 필름으로 접시를 봉인 하 고 스냅 드라이 아이스에 냉동 하기 전에 1 분 동안 300 x g 에서 접시를 회전.
10. -80 ° c.에 냉동된 번호판을 저장
    참고: 안전 정지 지점입니다. 정렬 및 lysed 세포는 장기 저장을 위한-80 ° C에 보관 수 있습니다.

4. 반전 전사 및 특정 대상 확대

1. 등 내부 관리 유전자 뇌관 뇌관 제어용 아군에서 RNA, RNA/DNA 무료 벤치에 RNAse 무료 튜브 1.5 mL에 각 뇌관 쌍의 2 µ L을 추가 하 여 모든 96 유전자 표적을 위해 뇌관 믹스를 준비 합니다. 미만 96 뇌관을 사용 하 여, nuclease 무료 물 없는 뇌관에 대 한 해당 볼륨을 추가 합니다. 프라이 머는 별도로 원하는 유전자 패널에 맞게 정렬 됩니다.
2. 반전 녹음 방송 및 혼합 반응 혼합 x 632.5 µ L 2, 101.2 µ L을 추가 함으로써 특정 대상 확대 Taq/SuperscriptIII, 151.8 µ L 뇌관 믹스, 그리고 0.7 µ L 제어 RNA에에서 아군. 이 단계는 DNA 무료 벤치에 예비적 형성. Vortexing와 수집 튜브의 하단에 있는 액체 아래로 회전 급강하에 의해 혼합. 샘플에 추가 될 때까지 얼음에 계속.
3. 반응 혼합 x 2의 27.5 µ L, Taq 효소의 1.76 µ L, 뇌관 믹스의 6.6 µ L, nuclease 무료 물 2.64 µ L를 혼합 하 여 4 개의 우물에 대 한 만들기 없음 반전 전사 제어 믹스. 제어 RNA에에서 스파이크. DNA 무료 벤치에이 단계를 수행 합니다. 와 동 그리고 샘플 수집 튜브 및 추가까지 얼음에 계속의 하단에 있는 액체 아래로 회전.
4. Lysate 번호판 얼음에 녹여 92 웰 스, 선형성 및 아니오-템플릿 컨트롤을 포함 하 여 이전에 준비 된 반전 녹음 방송 및 특정 대상 확대 믹스 8.75 µ L를 추가 합니다. 4 나머지 우물을 아니 반전 전사 제어 믹스의 8.75 µ L를 추가 합니다. 명확한 접착제 필름 및 수집 액체 접시의 바닥에 아래로 회전 접시를 봉인.
5. 반전 녹음 방송 및 특정 대상 증폭 앰프 프로그램;에 따라 PCR 기계에서 접시를 실행 하 여 예비적 형성 단계 1시 50분 ° C 60 분, 2 분 동안 2: 95 ° C 단계, 단계 3: 95 ° C 15에 대 한 s, 단계 4: 60 ° C 4 분, 반복 단계 3-4 24 시간 및 마지막으로 영원히 5: 8 ° C 단계.
6. PCR를 완료 한 후 단기 저장을 위해 8 ° C 및 장기 저장을 위한-20 ° C에서 접시를 유지.
   참고: 안전 정지 지점입니다. 단기 저장을 위해 8 ° C에 그리고 장기 저장을 위한-20 ° C에서 증폭 된 자료를 보관할 수 있습니다.

5. 다중 미세 유전자 표정 분석에 대 한 샘플 및 시험 접시의 준비

1. 분석 결과 pipetting 3 접시를 로드 준비 µ L 분석 결과 로딩 시 약 96 잘 접시의 각 음에. 플레이트 로드 분석 결과에서 개별 우물에 각 뇌관의 3 µ L를 추가 합니다.
2. 접착 필름 및 플레이트의 하단에 수집 액체 아래로 회전 접시를 봉인.
3. 준비 희석 플레이트 nuclease의 pipetting 8 µ L에 의해 무료 물 96 잘 접시의 모든 우물에. 1: 5의 최종 희석 하는 희석 접시에 증폭 된 샘플의 2 µ L를 추가 합니다.
4. 접착 필름 판 인감, 10 vortexing 격판덮개에 의해 혼합 s, 그리고 마지막으로 수집 액체 접시의 바닥에 아래로 회전.
5. 샘플 로드 믹스 마스터 믹스의 352 µ L의 샘플 로딩 시 약 35.2 µ L 신중 하 게 혼합 하 여 준비 합니다. Aliquoting 3.3 µ L 로드 96 잘 접시의 각 잘 혼합 하 여 샘플 로드 접시를 준비 합니다.
6. 접시를 로딩 하는 샘플의 각 음에 희석된 샘플에서 2.7 µ L를 추가 합니다.
7. 접착 필름 및 플레이트의 하단에 수집 액체 아래로 회전 접시를 봉인.

6. 미세 칩의 로드

1. 새로운 96 x 96 미세 칩을 가져가 라. 파고 그들 모자와 주사기에 이동 될 수 있다 다는 것을 확인 하 여 후미를 준비 합니다.
2. 주사기에서 거품을 제거 합니다. 기울이기 칩 45도 하면서 밸브를 누르고 각 밸브를 주사기의 전체 볼륨을 추가 합니다. IFC 컨트롤러 칩을 프라임.
3. 플레이트 로드 분석 결과에서 우물의 각에서 각 분석 결과 입구 4.25 µ L로를 로드 합니다. 거품을 하지 마십시오. 거품에는 잘 표시, 피 펫 팁 그들을 제거 합니다.
4. 플레이트 로드 샘플에 우물의 각에서 각 샘플 입구 4.25 µ L로 로드 continue, 거품을 방지 하 고 거품 표시, 피 펫 팁 그들을 제거.
5. IFC 컨트롤러 칩을 로드 합니다.
6. 칩도 외모와 모든 챔버 로드 된 확인 하십시오. 테이프와 그것으로 칩 표면에서 먼지를 제거 합니다. 멀티플렉스 미세 유전자 식 플랫폼에 칩을 실행 합니다.

7. 다중 미세 유전자 식 플랫폼에 칩 실행

1. 멀티플렉스 미세 유전자 식 플랫폼으로 칩을 로드 한 후 샘플을 이름을 지정 합니다.
2. 이용한 수동 염료로 설정 합니다. 형광으로 단일 프로브 및 팸-MGB를 설정 합니다. 96 x 96 표준 v 2를 사용 하 여 프로토콜. 실행 시작.
3. 제거 칩 실행 하면 완료 됩니다.

8. 예비 분석 칩 실행의

1. 실시간 PCR 분석 소프트웨어에 데이터를 로드 합니다.
2. 세포 및 유전자 레이아웃 탭으로 구분 된 파일에서 풀 칠해서 유전자 이름 및 셀 이름을 로드 합니다.
3. 이미지 보기를 열고 고 염료를 이용한 선택 합니다. 모든 웰 스를 이용한 수동 염료 있다면 확인 하십시오.
4. 모든 증폭 플롯 확인 ( 그림 3E비슷합니다) 없이 스파이크와 부드러운 증폭 곡선으로 본다면 조사.
5. 모든 단일 세포 아군에 제어 모두 제대로 로드는 다는 것을 확인 하는 RNA의 식을 확인 합니다.
6. 모든 셀 내부 관리 유전자 발현 있고 따라서 제대로 정렬 된 것을 확인 합니다.
7. 10 및 20 셀 선형성 제어 선형 증폭을 확인 하기 위해 약 1 CT 차이가 있는지 확인 합니다.
8. NoRT 컨트롤 샘플 식 인지 확인 합니다. 식을 noRT에 감지 되 면 후속 실행에 대 한 게놈 DNA를 검색 하지 않습니다 프로브에 프로브를 변경 하는 것이 좋습니다.
9. 추가 분석을 위해 csv 파일에서 데이터를 내보냅니다.

9. 단일 세포 분석 SCExV를 사용 하 여

참고: 입문 영화 존재²⁰ 도구를 소개 하는. 여기, 프로토콜에 도입 하는 컨트롤을 사용 하 여 분석을 수행 하는 방법의 짧은 추천 제공 됩니다.

1. SCexV 웹사이트²⁰에 연결 합니다.
2. 내보낸된 CSV 파일을 업로드.
3. 긍정적인 통제로 제어 RNA에서 아군을 선택 했다. 25 위 제어 RNA CT는 모든 셀을 제거 합니다. 중간 식 제어 RNA의 데이터를 정상화.
4. "다 여기-> 분석"을 클릭 합니다. 제외 셀 옵션에서 noRT, notemplate, 10 및 20 셀 컨트롤을 제거 합니다.
5. 클러스터의 예상된 번호 선택의 클러스터링 방법으로 클러스터 셀. 분석된 값을 내보냅니다.

10. 인덱스 정렬 분석

1. FACS 분석 소프트웨어 열고 인덱싱된 샘플을 로드 합니다.
2. 스크립트 편집기를 열고 퀸 제이 외 에서 사용할 수 있는 스크립트를 실행 ²¹
3. FACS 분석 소프트웨어 단일 셀의 각 게이트를 만든 해야, 레이아웃 편집기를 열고 고 ("Sample_complete_Data.xls" 라는 파일에서 사용할 수 있는) SCexV에서 그룹화에 따라 셀 색.

결과

설명 하는 프로토콜은 빠르고 쉽게 수행 하 고 신뢰할 수 있는. 실험 설정에 대 한 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 전체 프로토콜 특정 대상 확대, 유전자 식 측정 및 예비 분석 단일 셀의 정렬에서 3 일 동안에서 수행할 수 있습니다. 96 뇌관 및 만성 골수성 백혈병 (CML) 환자에서 96 셀 이나 건강 세 일치에서 96 셀을 사용 하 여 단일 셀 유전자 표정 분석에서 예비 분석 된 데이터를 나타내는 열 지도 형태로 분석된 결과의 예 제어는 그림 2에 표시 됩니다. 계층적 클러스터링을 사용 하 여, 분석 된 세포는 그들의 유전자 식 서명 기반 4 개의 하위 그룹으로 나눌 수 있습니다. 열 지도 시각화 분석 (예를 들어, 제어 우물)에서 제외 해야 하는 웰 스에 대 한 제어로 뿐만 아니라 데이터에 대 한 개요를 얻을 수 있는 편리한 방법입니다. <...

토론

최근 몇 년 동안, 단일 셀 유전자 표정 분석은 다양 한 세포 인구²³의 정의에 가치 추가 되었다. 그러나 이러한 메서드는 셀 시퀀싱 깊이 탈락에 의해 복잡 하 게 RNA 시퀀싱 기술의 출현 이론적으로 셀의 전체 transcriptome 측정 하는 가능성을 제공 합니다. 단일 셀 정량 제공 중요 한 유전자에 있는 모든 세포의 수백의 식의 과민 하 고 강력한 분석 기술 노이즈 감소 마찬가지로 처리 됩니다. 성적 증명서의 제한 된 수의 집중된 분석 또한 매우 표현된 유전자에서 간섭 없이 단순화 된 분석을 위해 수 있습니다.

만 셀에 표현 하는 유전자의 하위 집합을 조사 하는 접근 그것 이므로 매우 유전자 패널을 설계 할 때 유전자의 정확한 세트를 선택 하는 것이 중요. 유전자의 선택; 여러 가지 방법으로 할 수 있습니다. 통해 문학, 대량 분석 및 공개적으로 사용 가능한 데이터의 생물 정보학 분석에 의해 이전 연구 결과. 이것은 간단 합니다...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CD14 PECY5	eBioscience	15-0149-42	클론: 61D3
CD16 PECY5	Biolegend	302010	클론: 3G8
CD56 PECY5	Biolegend	304608	클론: MEM-188
CD19 PECY5	Biolegend	302210	클론: HIB19
CD2 PECY5	Biolegend	300210	클론: RPA-2.10
CD3 PECY5	Biolegend	300310	클론: HIT3a
CD123 PECY5	Biolegend	306008	클론: 6H6
CD235A PECY5	BD Pharma	559944	클론 GAR2
CD34 FITC	Biolegend	343604	클론: 561
CD38 APC	Biolegend	303510	클론: Hit2
CD90 PE	Biolegend	328110	클론: 5E10
CD45RA BV421	BD bioscience	560362	클론: HI100
CD49f Pecy7	eBioscience	25-0495-82	클론: eBioGOH3
FBS	HyClone	SV30160.3
PBS	HyClone	SH30028.02
96-well u-바닥 플레이트	VWR	10861-564
SFEM	줄기 세포 기술	9650
페니실린 스트렙토마이신	HyClone	SV30010
TPO	Peprotech	300-18
SCF	Peprotech	300-07
FLT3L	Peprotech	300-19
Falcon Tube 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Eppendorph tube	Sarstedt	72.690.001
CST beads	BD
Accudrop 비즈	BD	345249	6 µ M 입자
접착 필름 Clear	Thermo scientific	AB-1170
접착 필름 호일	Thermo scientific	AB-0626
96 웰 PCR 플레이트	Axygen	PCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL 튜브	Axygen	MCT-150-L-C
T100 PCR cycler	BioRad	186-1096
10% NP40	Thermo scientific	85124
10 mM dNTP	Takara	4030
0.1 M DTT	Invitrogen	P2325
RNAsout	Invitrogen	10777-019	RNAse inhibitor
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen	11753-100
		from CellsDirect	kit
2x	CellsDirect 키트의	반응 혼합물 Invitrogen	11753-100
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	CellsDirect 키트	Invitrogen	11753-100
; 타크  DNA 중합효소	Invitrogen	10966026
TaqMan 세포-CT 제어 키트	Invitrogen	4386995
Xeno RNA Control		TaqMan Cells-to-CT Control Kit
Cells-to-CT Control Kit		RNA Control Kit 20x Xeno RNA Control TaqMan Gene Expression Assay	Invitrogen
10개의 IFC	Fluidigm	BMK-M10-96.96
2x 분석 로딩 시약	Fluidigm		From 96.96 샘플/로딩 키트
20x GE 샘플 로딩 시약	Fluidigm		From 96.96 샘플/로딩 키트
제어 라인 유체	96.96 샘플/로딩 키트의	Fluidigm
TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스	Applied Biosystems	4369016
BioMark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD
96.96 동적 어레이 IFC	Fluidigm	BMK-M10-96.96GT
Excel	Microsoft	Microsoft
FlowJo V10	TreeStar TreeStar
플루이다임 실시간 PCR 분석	플루이다임	이디
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