표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

요약

이온 채널의 정화는 종종 도전, 하지만 일단 달성, 그것은 잠재적으로 수 체 외에서 조사 기능 및 채널의 구조. 여기, 표현과 포유류 bestrophin 단백질, 캘리포니아^{2 +}의 가족의 정화에 대 한 단계적 절차 설명-Cl^- 채널을 활성화.

초록

인간 게놈 4 bestrophin paralogs를, 즉 BEST1, BEST2, BEST3, 및 BEST4 인코딩합니다. BEST1, BEST1 유전자에 의해 부호화는 캘리포니아^{2 +}-Cl^- 채널 (CaCC) 주로 망막 안료 상피 (RPE) 표시를 활성화. BEST1의 생리 및 병 적인 의미 BEST1 유전자에서 200 개 이상의 독특한 돌연변이 최고의 vitelliform 등 적어도 5 망막 퇴행 성 장애의 스펙트럼에 유전자 연결 되었다는 사실에 의해 강조 표시 됩니다. 황 반 영양 장애 (최고의 질병) 따라서, bestrophin 채널을 단일 분자 수준에서의 물리학을 이해 엄청난 의미를 보유 하고있다. 그러나, 순화 된 포유류 이온 채널을 얻는 것은 종종 어려운 작업입니다. 여기, 우리는 BacMam 잠재 유전자 전달 시스템 및 친 화력과 크기 배제 크로마토그래피에 의해 그들의 정화와 포유류 bestrophin 단백질의 표현에 대 한 프로토콜을 보고합니다. 순화 된 단백질 지질 bilayers에 결정학 electrophysiological 녹음 등 후속 기능 및 구조 분석에 활용 될 가능성이 있다. 중요 한 것은,이 파이프라인 함수 및 다른 이온 채널의 구조 연구에 적용할 수 있습니다.

서론

Bestrophins은 박테리아에서 인 간에¹다양 한 종족을 통해 보존 하는 이온 채널의 가족 이다. 인간에서는, BEST1 유전자, 염색체 11q12.3에 있는 막 단백질 Bestrophin-1 (BEST1) 주로 눈^{2,3 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 basolateral 막에 표현 되 인코딩 ,4}. 585 아미노산의 첫 번째 ~ 350 높은 종 중 보존 하 고는 막 횡단 영역을 포함, 구성 BEST1 인간^1,,56CaCC 역할을 합니다. 또한, 닭에 BEST1 homologs와 Klebsiella 균 으로 작동 homopentamers^7,8, 진화를 통해 환경 보호의 높은 수준을 제안.

인간에서는, 200 개 이상의 돌연변이....

프로토콜

1. 생산 BacMam 식 Baculoviruses

1. BacMam 벡터 GFP 10 다음 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소 인식 순서¹⁸ 못에 원하는 포유류 bestrophin 단백질의 코딩 시퀀스를 삽입 그의 태그는 단백질의 C-말단에 x.
2. 접착제 HEK293 세포^{19,20,21,,2223}에 식 플라스 미드를 transfect 정도. 10 배 또는 20 배 확대, 488 nm 여기 소스와 510 nm 방출 필터 (그림 1A) 형광 현미경 GFP 융해 단백질의 식을 확인 합니다.
   참고: 고분자에 기초를 둔 transfection HEK293 세포의 35 m m 음식에 대 한 플라스 미드 DNA의 1 μ g 정기적으로 수행 됩니다.
3. 앞에서 설명한^16,17

결과

뚜렷이 페 접착제 HEK293 세포 (그림 1A)의 형광 강도 서 스 펜 션 F HEK293 세포 (그림 1B)에 예상된 단백질 표정 수준에 대 한 좋은 지표입니다. 대상 단백질은 잘 표현 또는 과도 transfection 후 HEK293 세포에서 잘못 지역화, 것이 좋습니다 고려 식 구조를 수정 하는 (예., GFP 태그의 위치를 변경 또는 돌연변이/잘림 에 대상 단백질). 작은 HEK293 F 현 탁 액 문화 (예를 들어, 25 mL 문화)는 단백질 표정, 중 감염 나 배양 온도 되었습니다 이전 경험에서 가장 중요 한 조건을 최적화 하는 데 사용 됩니다.

성공적인 정화 단일 주요 피크 크기 배제 크로마토그래피 (

토론

이 프로토콜 표현과 미래 생체 외에서 분석에 사용할 포유류 bestrophin 이온 채널의 정화에 대 한 유용한 파이프라인을 설명 합니다. FPLC 장치는 크기 배제 크로마토그래피에 대 한 필요, 주사기 펌프는 친화성 크로마토그래피 바인딩 하 고, 세척, 하 고, 방출 하는 등의 모든 단계에 대 한 충분 한 이다. 푸시 솔루션 (주사기)에 열을 통해 주사기 펌프를 사용할 때는 열에 공기 방울을 밀어 피하기 위해 봄 측면 아래에 배치 필수적 이다. 친화성 크로마토그래피 후 단백질의 순도, 후속 실험에 대 한 충분 한 이미 경우 FPLC 장치 되지 않을 수 있습니다 필요한 모든 있도록 크기 배제 크로마토그래피를 생략할 수 있습니다.

PBacMam 플라스 미드에서 baculoviruses를 만들기 위해 약 2 주 걸립니다, 효율을 품행 단백질 homologs에 대 한 초기 화면 실시 될 수 있습니다 정도 transfected HEK293 세포를 수확 하 여 (예.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HEPES	피셔 사이언티픽	AC327265000
NaCl	Fisher Scientific	AC446212500
글리세롤	Fisher Scientific	G33-500
이미다졸	Fisher Scientific	AC301870010
MgCl2	Fisher Scientific	AC197530010
TCEP	피셔 사이언티픽	AA4058704
아프로티닌	피셔 사이언티픽	AAJ63039MA
루펩틴	피셔 사이언티픽	AAJ61188MB
펩스타틴 A	피셔 사이언티픽	AAJ20037MB
페닐메틸설포닐 플루오라이드	피셔 사이언티픽	AC215740050
DDM 솔 그레이	드 아나트레이스	D310S
DDM 아나	그레이드 아나트레이스	D310
SF-900 II SFM	ThermoFisher	10902179
프리스타일 매체	ThermoFisher	12338018
NanoDrop 분광 광도계	ThermoFisher	ND-2000
고압 균질화 장치	Avestin	Emulsiflex-C5
HisTrap 컬럼	GE	17-5248-01
Superdex-200 컬럼	GE	28990944
AKTA Pure	GE	29018224
Ultra-15 원심 필터 장치	Millipore	UFC910024
Ultra-4 원심 필터 장치	Millipore	UFC810024
Ultra-0.5 원심 필터 장치	Millipore	UFC505024
Optima XE-90 초원심분리기	Beckman Coulter	A94471
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658004
Mini-PROTEAN 프리캐스트 겔	Bio-Rad	4561084
T100 Thermal Cycler,	Bio-Rad	1861096
PolyJet 트랜스펙션 시약	SignaGen	SL100688
pEG BacMam 벡터			Vollum Institute의 Gouaux 실험실에서 획득

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