방법 논문

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

DOI:

10.3791/57843

⸱

2018년 9월 7일

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

또한 분 비 면역 글로불린 (Ig), B 세포, 체액 성 면역에서 plasmablasts/플라스마 세포 분화 되 나, 항 체는 다양 한 메커니즘을 통해 병원 균 침입에 대 한 강력한 방어를 제공 합니다. 예방 접종의 하나의 주요 목표는 생명을 위협 하는 감염을 방지 하기 위해 보호 항 원 특정 항 체를 유도 하는 것입니다. 모두 thymus-종속 (TD)와 thymus-독립 (TI) 항 강력한 항 원 특정 IgM 응답을 이끌어 낼 수 있습니다 또한 도움으로 메모리 B 세포의 생성 뿐만 아니라 isotype 전환 항 체 (IgG, IgA, ige의)의 생산을 일으킬 수 있다 항 원 제시 세포 (Apc)에 의해 제공. 여기, 우리는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)을 사용 하 여 마우스에 TD 및 TI Ig isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에서 TD와 TI 서 응답은 elicited 쥐에 hapten 활용 모델 항 (졸업생)에 TNP KLH와 (PBS)에 TNP-다 당 류와 복 (i.p.) 예방 접종에 의해 각각. TD 메모리 응답을 유도, 졸업생에 TNP KLH의 부스터 예방 접종 같은 항 원/보조 제와 함께 첫 번째 접종 후 3 주에 제공 됩니다. 예방접종 전후 다른 시간 지점에서 마우스 세라 수확. 총 혈 청 Ig 수준 그리고 TNP 특정 항 체는 이후 각각 Ig isotype-특정 샌드위치 및 간접적인 ELISA를 사용 하 여 계량. 올바르게 각 Ig isotype의 혈 청 농도 측정, 샘플 표준 곡선의 선형 범위에 맞게 적절 하 게 희석 해야 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 지속적으로 얻은 신뢰할 수 있는 결과 높은 특이성 및 감도. Cytometry, 비장 immunohistochemical 및 B 세포의 생체 외에서 문화 다른 상호 보완적인 방법으로 사용 하는 경우 얼룩 (IHC),이 프로토콜을 허용할 것 이다 항 체의 포괄적인 이해를 얻기 위해 연구원 주어진된 실험 설정에 응답 합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B 림프 구 체액 성 면역에 주요한 선수 및 포유류 생산 항 체, 면역 글로불린 (Ig)1,2라고도 할 수 있는 유일한 셀 형식이 있습니다. B 세포에 의해 은닉 하는 항 체 중립화, 보완 활성화, 보호 면역3선도, opsonization 등 다양 한 메커니즘을 통해 병원 균 침입에 대 한 강력한 방어를 제공 합니다. B 세포에 의해 항 체의 분 비는 일반적으로 두 가지 신호3특정 B 세포의 전체 활성화 후만 이루어집니다. 신호 1 B 세포 수용 체 (BCR) 특정 순진한 B 셀3의 표면에 표현 하는 항 원 (Ag)의 직접 바인딩에 의해 릴레이 됩니다. 신호 2의 원본에 따라 B 세포 활성화 thymus (TD) 또는 thymus-독립 (티)3,4로 나눌 수 있습니다. TD 항 응답에서 신호 2는 세포에 의해 활성화 된 동족 CD4 T 도우미 (TH), CD154, co-stimulatory 수용 체 CD40 B 세포1,2,3에 대 한 리간드를 표현 하는 제공 됩니다. TI 항 응답에서 신호 2 수용 체 통행세 같이의 어느 약혼에서 온다 (타입-1의 경우 TLRs TI Ag)는 BCRs의 광범위 한 cross-linking 또는 (2 형의 경우 TI Ag)는 b 세포3,4. 타입-1 티타늄 (TI 1) 항은 TLRs, 세균성 lipopolysaccharides (LPS), 바이러스 성 RNAs 등 미생물 CpG DNA4,5의 미생물 ligands. 2 형 티타늄 (TI-2) 항 원 높은 반복 구조, 있고 장기 및 영구 BCRs4,6의 여러 cross-linking에 의해 B 세포에 신호를 제공할 수 있습니다. TI-2 항의 전형적인 예로 폐 렴 구 균 다 당 류와 다 당 류 hapten 활용6,7있습니다. TD와 TI 항 강력한 항 원 특정 IgM 응답을 이끌어내는 수 고 또한 항 원 제시 세포 (Apc) 모 수석 세포 (DCs)1 에서 제공 하는 도움 isotype 전환 항 체 (IgG, IgA, ige의)의 생산을 일으킬 수 있다 2,3. 또한, TD와 TI 항 APCs의 도움으로 메모리 응답을 유도 하는 것 수 있지만 TD 항 메모리 B 세포 생성3,8유도에 더 효율적입니다.

이 프로토콜에서 TD와 TI 서 응답 TNP-다 당 류 (중립, 높은 분기 hapten 활용 모델 항 원 2,4,6-trinitrophenyl-열쇠 구멍 삿 hemocyanin (TNP KLH)와 복 (i.p.) 예방 접종에 의해 쥐에 elicited는 그리고 높은 질량), 각각9,,1011. TD 항 원 항 체12의 생산을 강화 하는 보조 일반적으로 사용 됩니다. 여기 우리의 프로토콜에 TNP KLH 졸업생, 면역 연구12에 일반적으로 사용 되는 보조로 주사 된다. 사용할 수 있는 adjuvants의 다른 예로 완전 하거나 불완전 한 Freund의 보조 제 (CFA 또는 아일랜드), monophosphoryl-지질 A / 트 레 할 로스 dicorynomycolate ("Ribi" 보조), 및 CpG oligodeoxynucleotides, 등13, 14. 예방 접종, 후 마우스 세라 다른 시간 지점에서 수확 하 고 세라에 TNP 특정 항 체 Ig isotype-특정 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)9,10, 를 사용 하 여 계량은 11.

애 란은 의학에서 진단 도구와 또한 생물 의학 연구15,16분석 도구로 서 널리 사용 되는 접시 기반 분석 결과 이다. 그것은 감지 analytes 항 체, 호르몬, cytokines, 발산, 그리고 다양 한 항 원, 등등을 포함 하 여 계량 하는 데 사용 됩니다. ELISA는 직접, 간접, 샌드위치 및 경쟁적인 ELISA15,16를 포함 하 여 여러 가지 다른 형식에서 수행할 수 있습니다. 일반적으로, 그것은 일반적으로 결정 96 잘 접시, 기본 항 체와 알을 품는 고체 표면에 항 원 동원 정지를 포함 한다. 부 화, 후 언바운드 항 체는 멀리 세척 된다. 직접 ELISA에서 1 차적인 항 체는 효소 (일반적으로 양 고추냉이 과산화 효소 또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소), 신호 검출 악기에 의해 감지와 같은 보이는 색상 변화를 비 기판 쪼개 다 수는에 직접 활용 한 분 광 광도 계15,16. 대조적으로, 효소 연결한 이차 항 체는 1 차 항 체를 바인딩하는 데 사용 됩니다, 다음이 간주 됩니다 간접적인 ELISA15,16. 직접 ELISA 간접적인 ELISA는 더 민감한15,16빠릅니다. 샌드위치 ELISA, 번호판, 샘플에 대 한 관심의 항을 무력화 하는 데 사용 하는 "캡처" 항 체로 코팅 하 고 캡처된 항 원 직접 또는 간접적인 방식으로15, 에 또 다른 "탐지" 항 체에 의해 검출 될 수 있다 16. 샌드위치 ELISA 항 원 antigen의 두 개의 서로 다른 항 체에 의해 감지 되 면 이후 높은 특이성을 제공. 경쟁적인 ELISA에서 경쟁 샘플 항 원 및 주 항 체 바인딩 위한 플레이트-바인딩 항 간에 설정 하 고 샘플에 있는 항 원 농도 기판에서 신호 감소를 측정 하 여 정량은 15 , 16. 경쟁 ELISA 위에서 언급 한 직접 또는 간접 형식을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 및 단지 1 개의 epitope15,16작은 항 원의 검출을 위한 유용.

항 체의 측정에 대 한 대체 기술을 포함 라디오-immunoassay (RIA), electrochemiluminescence (ECL) 분석 결과 및 표면 플라스몬 공명 (SPR) 시험17. 리아 첫 번째 immunoassay 높은 특이성 및 방사선된 약18,19를 사용 하 여 감도 항 원 (항 체)의 존재 그 조치를 개발 했다. 그러나, 방사성 독성, 폐기 비용, 수명 및 방사성 재료와 함께 작동 하도록 특별 한 라이선스 문제로 인해 ELISA는 더 나은 하 고 일반에 대 한 더 편리한 기술20,21을 사용 하 여 키를 누릅니다. ECL은 chemiluminescent 반응 반응성이 매우 높은 종, 전극의 표면에 안정적인 선구자에서 생성 하는 전기를 사용 하 여 시작 되 고 analytes의 양을 측정 하는 데 사용 될 수 있는 매우 중요 한 분석 결과 (항 원 등 또는 항 체)22. 그러나, ECL 특별 한 계기를 요구 하 고 따라서 사용 되지 않습니다으로 광범위 하 게 일 라23. SPR은 직접 분석 결과 ligands의 바인딩은 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 (예., 항 체)를 분자를 움직일 수 (예., 항 원) 센서에 칩 표면24. SPR 매우 구체적으로 실시간으로 상호 작용을 감지 하 고 ELISA로 이라는 시 약의 사용을 요구 하지 않습니다. 그러나, SPR 또한 특별 한 장비를 필요로 하 고 ELISA17보다 낮은 감도 있다. 다른 방법의 한계를 감안할 때, ELISA는이 프로토콜에 우리의 목적을 위해 가장 적합 하 고 편리한 기술 이다. 여기, 우리는 총 Ig isotype 수준 분석 및 항 원 특정 Ig isotypes의 분석에 대 한 간접적인 ELISA의 절차에 대 한 샌드위치 ELISA 사용 하 여를 설명합니다.

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프로토콜

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이 프로토콜의 럿 거 스 대학 기관 동물 실험 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 모든 마우스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 동물 프로토콜에서 NIH 지침에 따라 사용 됩니다.

1. 생쥐와 순진한 마우스 세라의 컬렉션의 준비

  1. 특정 병원 체-무료 동물 시설에에서 예방 접종 실험에 대 한 모든 마우스를 유지.
  2. 사용 하 여 일치 하는 성별, 젊은 성인 (8-12 주 이전) 녹아웃 및 littermate 같은 부모와 면역 연구에 대 한 감 금 소를 공유 하는 마우스 제어.
  3. 예방 접종 및 그림 1에서처럼 혈 청 수집 일정을 계획 합니다.
  4. 예방 접종 하기 전에 7 일 (-7 일)에서 각 마우스의 혈 청 순을 수확. 4 단계에서 아래의 자세한 역 궤도 출혈 및 혈 청 준비 절차를 따릅니다.

2. 준비 TNP-다 당 류 (티 원) TNP KLH (TD 항)

  1. TNP-다 당 류 주식과 TNP KLH 재고 솔루션의 1 mg/mL의 0.5 mg/mL을 철저 하 게 멸 균 PBS (pH 7.4)에 항 원 분말을 디졸브. Aliquot 각 항 0.5 mL/튜브, 살 균 microfuge 관으로 솔루션을 재고 하 고 장기 저장을 위한-80 ° C에는 aliquots를 유지. 여러 동결과 항 원 aliquots의 해 동 하지 마십시오.
  2. 주사 당일 계산 TNP-다 당 류의 볼륨 (50 µ g/100 µ L/마우스) 또는 TNP KLH (100 µ g/100 µ L/마우스) 주입에 쥐의 수에 따라 필요한. 적절 한 수의 상 온 (RT) TNP-다 당 류 또는 TNP KLH aliquots 녹여
  3. TNP KLH 주입을 위해 먼저 10 mg/mL의 최종 농도에 살 균 PBS의 3 볼륨 졸업생 보조 (40 mg/mL)를 희석. 졸업생 보조 제 혼합물은 잘 희석 하기 전에 일시 중단 된 다는 것을 확인 하십시오.
  4. 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 동등한 양의 단계 2.3 및 해 동된 TNP KLH 솔루션 (1 mg/mL)에서 10mg/mL 졸업생 보조 슬러리를 결합, 잘, 혼합 하 고 30 분이 TNP-KLH/졸업생 혼합 주사 전에 갓 준비에 대 한 37 ° C에서 품 어.

3입니다. 마우스의 면역

  1. TNP-다 당 류 또는 TNP-KLH/졸업생 면역 biosafety 내각에 1 mL 인슐린 주사기와 쥐의 복 (i.p.) 주사를 수행 합니다. 내부 장기에 주입을 방지 하기 위해 각 마우스의 더 낮은 오른쪽 사분면에 가급적 이면 약 30 ° 각도로 바늘을 삽입 합니다.
  2. 하루 0 TI Ag 예방 접종 (그림 1A)에 마우스 당 TNP-다 당 류의 i.p. 100 µ L를 주사.
  3. Ag는 TD 예방접종의 날 0 마우스 당 (신선한 단계 2.4에서에서 준비) TNP-KLH/졸업생 믹스의 i.p. 200 µ L를 주사. 메모리 연구 (그림 1B) 부스터 예방 접종으로 하루 21에 같은 주사를 반복 합니다.
  4. 주입, 후의 케이지를 각 마우스를 반환 하 고 특정 병원 체 자유로운 상태에서 모든 삽입 된 생쥐를 유지 합니다.

4. 레트로 궤도 출혈 및 혈 청 준비

  1. 다른 시간 지점에서 마우스 세라 수확:-7-7 (그림 1A); 하루에 마우스 세라 TNP-다 당 류 예방 접종에 대 한 수집 TNP-KLH/졸업생 예방 접종에 대 한 일-7, 7, 14, 28 (그림 1B)에 마우스 세라를 수집 합니다.
  2. 복고풍-궤도 출혈, 각 biosafety 캐비닛25에서 1-2 분 5 %isoflurane 마우스 anesthetize. 각 마우스의 적절 한 마 취를 위해 페달 반사를 수행 합니다.
  3. 집게와 엄지 다시 그렇게 소켓25에서 안구 돌출 안구 주위 피부를 당기고 한 손으로 마 취 마우스를 잡아. 눈알25아래 눈 소켓의 안쪽 모서리에 45 °의 각에서 비 heparinized 파스퇴르 피 펫 또는 모 세관 튜브를 삽입 합니다.
  4. 부드러운 하향 압력을 적용 하 고 피 펫 또는 정 맥에 침입 하 고 150-200 µ L 피 펫 또는 튜브에 혈액의 수집을 부드럽게 튜브를 회전. 즉시 살 균 1.5 mL microfuge 관에 혈액을 전송 하 고 복구할 수 그것의 감 금에 마우스를 반환 합니다.
  5. 혈액 샘플 1-2 h 응고를 위한 RT에 앉아 보자.
  6. 4 ° c.에서 10 분 13000 x g 에서 coagulated 혈액 샘플을 원심 새로운 살 균 1.5 mL microfuge 관에 혈액 응고의 위에 명확한 혈 청을 전송 합니다.
  7. 잔여 혈액 응고를 제거 하 고 명확한 혈 청 수집 단계 4.6 한 번 더 반복 합니다.
  8. 약 50 µ L/튜브, 살 균 1.5 mL microfuge 관으로 혈 청 수-80 ° c.에서 세라를 저장 하 고
  9. 각 눈은 모든 실험에 대 한 최대 두 번 출혈이 있도록 다른 시간 지점에서 출혈에 대 한 눈을 대체. 출혈 하는 터미널에서 안락사 하기 전에 각 마우스에서 최대 1 mL의 혈액을 수집 합니다. 5% CO2 자 궁 경부 전위 뒤 마우스를 안락사.
    참고: 비장 B 세포 흐름 cytometric 분석 및 생체 외에서 문화 연구를 위한 수확 될 수 있습니다. 우리는 또한 각 마우스의 유전자 형을 확인 하기 위해 splenocytes에서 게놈 DNA를 준비 합니다.

5. 마우스 Ig Isotype-특정 ELISA

  1. 버퍼 및 ELISA 하기 전에 솔루션을 준비 합니다.
    1. 500 mL 커플링 버퍼 (PBS, pH 7.4)을 준비 합니다.
    2. 세척 솔루션의 500 mL를 준비 (PBS-T (0.05% 트윈 20), pH 7.4).
    3. 100 mL 차단 버퍼의 준비 (1% BSA PBS, pH 7.4에 4 ° C에 저장).
    4. 1 L 기판 버퍼의 준비 (1 M diethanolamine, pH 9.8 (H2O, pH 10 M HCl을 사용 하 여 조정의 1 L에 diethanolamine의 97 mL)와 0.5 m m MgCl2). 알루미늄 호 일 병을 배치 하 여 빛 으로부터 기판 버퍼를 보호 합니다. 4 ° c.에 게
    5. 정지 솔루션 (3 M NaOH) 100 mL를 준비 합니다.
  2. ELISA 격판덮개 코트:
    1. 총 혈 청 Ig isotype ELISA에 대 한 96-잘 면역 접시 10 µ g/mL isotype-특정 캡처 polyclonal 염소 반대로 마우스 Ig의 코트 (M, g 1은, G2a, G2b, G3, A, 또는 E) Abs에 커플링 버퍼 (PBS)에 100 µ L/잘.
    2. TNP 특정 Ig isotype ELISA, 면역 96 잘 접시 10 µ g/mL의 PBS에 TNP(38)BSA에 100 µ L/잘 코트.
    3. 높은 선호도 TNP 특정 Ig isotype ELISA, 면역 96 잘 접시 10 µ g/mL PBS에 TNP(3)BSA의 100 µ L/잘26코트. 4 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
  3. 코팅 부 화 후 2 번 200 µ L/잘 PBS-t와 접시 세척 워시 버퍼를 삭제 하 고 오 점 각 세척 후 번호판 (종이 타 올의 스택에 각 접시를 거꾸로 탭)를 건조.
  4. 번호판을 차단: 차단의 200 µ L/잘 추가 코팅된 판으로 (PBS에 1 %BSA)를 버퍼링 하 고 실시간에 1 시간에 대 한 번호판을 품 어
  5. 번호판을 차단 하는 동안 Ig isotype 표준 및 별도, 치료 96 잘 접시에 150 µ L/잘 차단 버퍼에서 혈 청 샘플의 희석을 준비 합니다.
    1. 250 ng/mL Ig isotype 표준 시작 표준 농도 (St01)으로 준비 하 고 서 표준의 직렬 희석 1: 2의 7 ~ 10 할 (St02 St07 또는 St10, 그림 2A).
    2. 1: 100 또는 1: 500 희석에 샘플 시작 희석으로 요소 고 3 또는 4 1시 10분의 총 Ig isotype에 대 한 직렬 희석 또는 각 혈 청 샘플 (그림 2A) TNP 특정 Ig isotype에 대 한 1:5 직렬 희석 마우스 혈 청을 준비. IgE ELISA에 대 한 시작 희석으로 1:2 희석 요소에 마우스 혈 청 샘플을 준비 하 고 각 혈 청 샘플의 직렬 희석 1: 5의 3.
  6. 차단, 후 단계 5.4 세 번 200 µ L/PBS-T의 우물에서에서 접시를 세척 하 고 오 점 건조 판 각 세척 후.
  7. 5.6 단계에서 준비 된 접시를 100 µ L/잘 희석 Ig isotype 표준 (캡처 및 탐지 Abs에 대 한 적절 한) 및 희석된 혈 청 샘플 단계 5.5에서에서 전송. 표준 및 4 ° C에서 샘플 접시를 밤새 품 어.
  8. PBS-T의 200 µ L/잘 사용 3 회 접시를 세척 하 고 오 점 건조 판 각 세척 후.
  9. 각 접시에 추가 된 적절 한 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP)의 10 µ g/mL의 100 µ L/잘-활용된 isotype 특정 염소 반대로 마우스 Ig (M, g 1은, G2a, G2b, G3, A, 또는 E) Abs 차단 버퍼에 희석.
  10. 실시간에서 1-2 h에 대 한 AP 활용 된 Abs와 번호판을 품 어 IgE 검출에 대 한 1-2 h 37 ° c.에 대 한 번호판을 품 어
  11. 5 mg 인산 가수분해 효소 기판 기판 버퍼의 10 ml에서의 2 개의 정제를 용 해 하 여 1 mg/mL 기판 솔루션의 준비.
  12. 각 판 5 번 PBS-T의 200 µ L/잘 세척 하 고 오 점 건조 판 각 세척 후.
  13. 100 µ L/잘 기판 솔루션의 각 접시에 추가 합니다. RT는 일반적으로 몇 분만에 개발 하는 반응을 수 있습니다.
  14. 405에 각 접시를 읽고 nm microplate 리더를 사용 하 여 관련된 소프트웨어와 함께.
    1. "Lm1" 파장을 설정 하려면 "설정"을 클릭 "405 nm" "확인"을 클릭 합니다.
    2. "빈" 웰 스, "표준" 우물과 96 잘 접시 설치 프로그램에 "알 수 없는" 우물을 할당 하려면 "서식 파일"을 클릭 합니다.
    3. "표준" 우물 "시리즈" "첫 번째 샘플"로"St01" 설정 "시작"최고", 선택 하 고"복제""2"로 설정을 클릭 하십시오. "샘플 Descriptor"를 확인 하 고 "표준 값"을 입력: ""로"ng/mL단위"를 선택 "250"로 "시작 값", "단계" "2"로 설정. "확인"을 클릭 합니다.
    4. 클릭 하십시오 "읽기" 읽을 접시 가장 집중 표준에 도달 하는 때 ~ 1의 광학 밀도 (OD).
    5. "파일" 메뉴를 클릭 하 고 파일을 저장 하려면 "저장"을 클릭 합니다.
    6. 때 가장 집중된 표준 접근 ~ 1.5, 2, 2.5, OD405 각각 접시를 다시 읽기 "읽기"를 클릭 합니다.
  15. 25 µ L/3 M NaOH의 우물을 추가 하 여 반응을 중지 합니다. 한 번에 한 접시 5.12 5.15 단계를 완료 합니다.
  16. Microplate 리더 소프트웨어를 사용 하 여 ELISA 데이터 분석:
    1. 읽기 파일의 Ig isotype 기준의 OD405 값을 확인 하 고 자세한 데이터 분석을 위한 기준의 좋은 선형 범위와 적절 한 독서를 선택 합니다.
    2. 4-매개 변수 피팅 프로그램 표준 곡선을 플롯을 선택 합니다. Co-효율적인 표준 곡선 (R2) > 0.98 좋은 데이터 품질을 보장 하기 위해 필요를 확인 하십시오.
    3. 각 샘플의 OD405 값 희석 요인 증가 함께 감소 여부를 확인 합니다. "미지수"를 클릭 하 여 모든 희석된 샘플 우물의 농도 검색 합니다.
    4. 농도 계산에 대 한 Ig isotype 표준 곡선의 선형 범위에서 OD405와 각 샘플의 적절 한 음을 선택 합니다.
    5. 계산 하는 수식을 사용 하 여 각 샘플의 Ig isotype 농도 혈 청: 혈 서 농도 = x 희석 요소 선택된 잘 농도.
  17. 그래프를 플롯 하 고 적절 한 소프트웨어9,,1011를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다. 혈 청의 수직 점도 Ig isotype 레벨 비교 같은 시간 지점에서 Ig 응답을 확인 합니다. TD 메모리 응답 연구, 부스터 예방 접종 전후 Ig isotype 응답을 검사 시간 코스 응답 곡선을 확인 합니다. 오차 막대를 사용 하 여 샘플의 각 그룹의 표준 편차 (SD) 표시. Ig isotype 응답 마우스의 두 genotypes 사이 비교, 통계적 의미를 확인 하려면 양측 데이터에 대 한 짝이 없는 t 테스트를 사용 합니다. P 값 < 0.05로 상당히 다른 설정 합니다.

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결과

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우리는 면역 체계, TRAF3, TI 및 TD Ig isotype 응답9,,1011의 중요 한 레 귤 레이 터의 역할을 조사 하기 위해이 프로토콜을 이용 했다. TRAF3 직접 또는 간접적으로 통제 한다 타고 난 및 적응형 면역 수용 체, TNF 수용 체 superfamily를 포함 하 여 다 수의 신호 변환, 수용 체 통행세 같이 그리고 T 세포 수용 체/CD28, 다른 사람의 사이에서27,28. 우리는 TRAF3 항 체 응답 규제 하위 집합 다른 면역 세포에에서 뚜렷한 역할을 재생 가설. 이 가설을 테스트 하기 위해 우리는 Traf3 유전자 B 세포, T 세포, 또는 골수성 세포, ...

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토론

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여기, 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에 TD와 TI Ig isotype 응답 특성에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜의 성공적인 구현에는 표 1, ELISA 분석 실험 접시, 예방접종 Ags, 마우스 Ig isotype-특정 항 체 및 표준에에서 지정 된 재료 사용을 해야 합니다. 애 란에 대 한 치료는 조직 배양 배지를 사용 하지 않도록 주의 해야 합니다. 표준 및 혈 청 샘플의 희석 별도 치료 플레이트 (라운드-하단)에서 수행 하 고 ELISA 격판덮개에 추가 해야 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 지속적으로 얻은 신뢰할 수 있는 결과 높은 특이성 및 감도.

이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 Ag 면역, 복고풍 궤도 출혈, 그리고 Ig isotype-특정 ELISA 포함 됩니다. TD Ag 예방 접종에 대 한 TNP-KLH/졸업생 믹스 철저 하 게 그 정확한 양의 Ag/보조 주입 되도록 resuspended 되어야...

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공개 사항

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저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

감사의 글

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이 연구는 건강 보조금 R01 CA158402의 국가 학회 (P. 시)에 의해 지원 되었다, R21 AI128264 (P. 시), 국방부의 부여 W81XWH-13-1-0242 (P. 시), 조종사 상 암 연구소의 뉴저지에서 보조금 번호 P30CA072720를 통해 국립 암 연구소 (P. 시), 부시 생명 부여 (P. 시), 빅터 Stollar 친교 (A. Lalani)는 앤 B. 그리고 제임스 B. Leathem 친교 (미 주).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
VersaMax 조정 가능한 마이크로플레이트 리더MDS 분석 기술VERSAMAX플레이트 판독 장비
SOFTmax PRO 5.3MDS Analytical TechnologiesSOFTmax PRO 5.3플레이트 리더용 소프트웨어
GraphPad PrismGraphPad및 통계용Prism
TNP-AECM-다당류(FICOLL)Biosearch TechnologiesF-1300-10A 면역용 TI Ag
TNP-KLHBiosearch TechnologiesT-5060-5면역용 A TD Ag
TNP(38)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (접합비: 38)TNP 특이적 ELISA용 코팅 Ag
TNP(3)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (접합비: 3)높은 친화력 TNP 특이적 Ig
Imject 명반을 위한 코팅 Ag피셔 사이언티픽 PI-77161면역 보조제
Falcon 폴리프로필렌 튜브Fisher Scientific 14-959-11ATNP-KLH/alum
BD 인슐린 주사기 14-829-1B마우스
Immuno 96-Well 플레이트Flat-Bottom Fisher Scientific 14-245-61ELISA
미처리 96-Well 마이크로플레이트, 둥근 바닥VWR82050-622표준물질 및 샘플의 연속 희석용
인산가수분해효소 기질, 5mg 정제SigmaS0942-200TABAP 기질
디에탄올아민VWRIC15251690AP 기질 완충액의 구성 요소
염소 안티-마우스 IgMSouthernBiotech1020-01마우스 IgM
염소 안티 마우스 IgG1SouthernBiotech1070-01Capture Ab 마우스 IgG1
염소 안티 마우스 IgG2aSouthernBiotech1080-01Capture Ab 마우스 IgG2a
염소 안티 마우스 IgG2bSouthernBiotech1090-01Capture Ab 마우스 IgG2b
염소 안티 마우스 IgG3SouthernBiotech1100-01캡처 Ab for 마우스 IgG3
염소 안티 마우스 IgASouthernBiotech1040-01마우스 IgA
염소 안티 마우스 IgESouthernBiotech1110-01마우스 IgE
AP-Goat 안티 마우스 IgMSouthernBiotech1020-04마우스 IgM
AP-Goat 안티 마우스 IgG1SouthernBiotech1070-04마우스 IgG1 Detection Ab
AP-Goat 안티 마우스 IgG2aSouthernBiotech1080-04마우스 IgG2a
AP-Goat 안티 마우스 IgG2bSouthernBiotech1090-04마우스 IgG2b
AP-Goat 안티 마우스 IgG3SouthernBiotech1100-04감지 Ab 마우스 IgG3
AP-Goat 안티 마우스 IgASouthernBiotech1040-04감지 Ab 마우스 IgA
AP-Goat anti-mouse IgESouthernBiotech1110-04Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standardBD Biosciences553472TNP 특정 IgM, Clone  G155-228
마우스 IgG1 표준BD Biosciences554054TNP 특정 IgG1, 클론  107.3
마우스 IgG2a 표준BD Biosciences556651TNP 특정 IgG2a, 클론  G155-178
마우스 IgG2b 표준BD Biosciences554055TNP 특정 IgG2b, 클론  49.2
마우스 IgG3 표준BD Biosciences553486 KLH 특정 IgG3, 클론  A112-3
마우스 IgA 표준BD Biosciences550924미네랄 오일 유도 IgA, 클론  MOPC-320
마우스 IgE 표준BD Biosciences557079TNP 특이적 IgE, 클론  C38-2
그래프 소프트웨어 Fisher Scientific의 인큐베이션용의 i.p. 주입용, 용 Capture Ab (영문)

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