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방법 논문

메뚜기 벨 Sensilla Basiconica에 대 한 단일 Sensillum 녹음

8.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57863

⸱

2018년 6월 23일

 ,  , 
1Department of Entomology, China Agricultural University, 2Bio-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences

이 논문에서

요약

이 종이에 곤충 mouthparts의 palps sensilla basiconica에서 단일 sensillum 기록에 대 한 상세 하 고 매우 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

초록

메뚜기 mouthparts의 palps 기존의 미각 기관 (이전 라는 터미널 sensilla sensilla chaetica 통해 비 휘발성 화학 신호의 탐지를 위해 특히 메뚜기의 식품 선택에 중요 한 역할을 재생 하는 것으로 간주 됩니다. 또는 볏된 sensilla)입니다. 이제 증거는 후 각 기능을가지고 하는 이러한 palps 증가입니다. Odorant 수용 체 (LmigOR2)와 odorant 의무적인 단백질 (LmigOBP1)는 되었습니다 지역화 신경 및 액세서리 셀에 각각,는 palps sensilla basiconica에서. 단일 sensillum (SSR) 녹음 사용 됩니다 odorant 수용 체 신경의 응답을 기록 심사 특정 odorant 수용 체에 활성 ligands를 위한 효과적인 방법입니다. SSR 벨 sensilla에 odorant 수용 체의 기능 연구에 사용 됩니다. palps의 돔에 있는 sensilla basiconica의 구조는 안테나에 그들의 구조에서 약간 다릅니다. 따라서, odorants에 의해 elicited는 SSR을 수행할 때 몇 가지 구체적인 조언을 최적의 결과 얻기 위해 유용할 수 있습니다. 이 문서에는 SSR 곤충 벨 sensilla basiconica에서에 대 한 상세 하 고 매우 효과적인 프로토콜 도입 되었습니다.

서론

동물 외 인 화학 신호를 감지 하는 chemosensory 기관의 범위를 진화 했다. 곤충, 가장 중요 한 chemosensory 기관에서는 안테나와는 palps 있습니다. 이러한 기관에 chemosensory sensilla 라는 chemosensory 머리카락의 여러 종류 머리카락 내 chemosensory 뉴런 (CSNs) 의해 innervated 있습니다. CSNs chemosensory sensilla에 특정 화학 신호는 중앙 신경 시스템1,2,3 이후에 전송 되는 전기 잠재력에 화학 자극에서 신호 변환 통해 인식 .

CSNs 익스프레스 다양 한 chemosensory 수용 체 [예를 들어, odorant 수용 체 (ORs)], ionotropic 수용 체 (국세청), 그리고 chemosensation 의 다른 종류와 관련 된 외 인 화학 신호를 인코딩하는 그들의 세포 막에 미각 수용 체 (GRs) 4,,56. CSNs의 특성 곤충 chemoreception의 세포 및 분자 메커니즘의 해명에 열쇠 이다. 이제 단일 sensillum 기록 (SSR)은 널리 사용 되는 기술 등 많은 곤충의 더듬이 sensilla에 곤충 CSNs 특성 파리7, 나 방8,9, aphids10, 메뚜기11, 딱정벌레 그리고 개미12. 그러나, 몇 가지 연구에 적용 된는 SSR 곤충 palps13,14,15,,1617, 때문에 그들의 sensilla의 특정 구조를 electrophysiological 녹음 어려운18.

메뚜기 메뚜기 (메뚜기목)의 심각한 작물 피해 및 경제적 손실19에 종종 발생할. palps 메뚜기20,,2122,,2324의 식품 선택에 중요 한 역할을 추정 된다. 두 가지 유형의 chemosensory sensilla 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 의해 조사 됩니다. 일반적으로, 350 sensilla chaetica와 7-8 sensilla basiconica 메뚜기 palps18의 각 돔에서 관찰 된다. Sensilla chaetica는 비 휘발성 화학 신호를 감지 하는 미각 sensilla sensilla basiconica 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 기능을가지고 반면.

메뚜기 palps sensilla basiconica (ca. 12 µ m)의 머리 소켓의 직경 sensilla chaetica의 그들 보다는 훨씬 더는 (ca. 8 µ m)18,25. 에 palps sensilla basiconica의 cuticular 벽은 더듬이 sensilla18의 그것 보다 훨씬 두꺼운. 또한,는 벨의 돔 매우 유연한 표 피 내에서 액체 내용이 있다. 이러한 특성 의미는 microelectrode와 좋은 electrophysiological 신호 취득 침투 더듬이 sensilla 보다 더 어려운. 이 논문에서는, 메뚜기 벨 sensilla basiconica에 대 한 상세 하 고 매우 효과적인 SSR 프로토콜 비디오와 함께 제공 됩니다.

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프로토콜

1입니다. 악기와 곤충의 준비

  1. 텅스텐 전극 및 자극 솔루션 준비
    1. 새로운 텅스텐 와이어 (0.125 m m의 직경, 길이 75 m m)는 micromanipulator로 해결 하 고 stereomicroscope (40 배 확대)에서 약 1 분 동안 전원 공급 장치에서 제공 하는 V 10에서 주사기에 10% (w/v) 나트륨 질산염 (나노2) 솔루션에 선명 하 게.
    2. 10% 나노2 솔루션, < 1 분 (그림 1A)에서 5 V에서 약 4 mm로 반복적으로 날카롭게 텅스텐 와이어를 찍어.
    3. 때까지 충분히 잘 메뚜기 벨 후 각 sensillum (그림 1B)의 표 피를 관통 하는 stereomicroscope에서 자주 날카롭게 텅스텐 팁의 직경을 검사 합니다.
    4. 자극 솔루션을 준비 합니다. 미네랄 오일의 화학 자극 물질의 각각 희석. 1-nonanol 및 nonanoic 산 10% 희석에 희석. E-2-hexenal, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5에서 hexanal 희석.
    5. 파스퇴르는 자극을 운반 하는 튜브 준비: 파스퇴르 튜브 필터 종이 스트립 (2 cm의 길이, 0.5 c m의 폭)를 삽입, 필터 종이 스트립에 희석된 자극 솔루션 (각 10 µ l)를 추가 하 고 다음 파스퇴르 피 펫 팁 (1 ml) 튜브를 연결.
  2. 곤충을 준비
    1. 60%의 상대 습도, 28-30 ° C의 온도 및 18:6 h (빛: 다크) photoperiod 붐비는 조건 하에서 신선한 밀 묘와 후면 메뚜기 (Locusta migratoria). 선택 1을 3-하루-오래 된 5번째 메뚜기 님프 탈피 하 고 기록할 때 어떤 방해를 피하기 위해 좋은 위 안테나를 제거.
  3. 메뚜기 상 악 벨 홀더를 준비
    1. 유리 슬라이드 (25 x 75 mm)를 사용 하 여 상 악 벨 홀더 (MPH)의 기반으로. 양면 접착 테이프를 가진 유리 슬라이드의 모서리에 플라스틱 조각 (높이, 길이 35 m m, 폭에서 10 m m 1 m m)를 부착 하 고 마지막으로 양면 접착 테이프를 가진 플라스틱 조각 위에 커버 글라스 (18 x 18 mm)을 수정. 비-슬립 층으로 커버 유리에 빨간 고무 테이프의 작은 조각을 놓습니다. 커버 유리와 플라스틱 조각 메뚜기 벨에 대 한 플랫폼을 구성합니다. 플랫폼의 높이 약 1.5 m m 이다.
    2. 텅스텐 와이어 (0.125 m m의 직경, 36 m m의 길이) 안쪽에 평행 하 게 1.5 m m의 거리에 설치 플랫폼의 가장자리. 양면 접착 테이프를 가진 플랫폼에 철사의 2 개의 끝을 수정 합니다.

2입니다. 메뚜기 상 악 Palps의 준비

  1. 원심 분리기 튜브 (1.5 ml) 세로로 반으로 잘라내어 바닥을 잘라. 준비 된 관으로 메뚜기를 놓습니다. 복 부 지역 및 노출 메뚜기의 머리를 두고. 양면 접착 테이프 (그림 2A)와 유리 슬라이드에 어셈블리를 수정 합니다.
  2. 플랫폼에 오른쪽 상 악 벨을 당겨.
  3. 벨의 4 세그먼트에 텅스텐 와이어를 넣어. 텅스텐 와이어, 상 악 벨 (그림 2A 와 2B)에서 약 2 mm의 양쪽에 접착제 퍼 티를 배치 합니다.

3. 단일 Sensillum 녹음

  1. 저 배율 (100 배)에서 현미경으로 메뚜기 상 악 벨 준비를 놓습니다. 벨 기록 전극 (그림 3A)에 수직 될 때까지 준비의 위치를 조정 합니다.
  2. micromanipulator를 사용 하 여 메뚜기 눈에 참조 전극 (텅스텐 전극)를 삽입 합니다. (그림 3B 와 3c) micromanipulator와 상 악 벨 가까이 기록 전극 (텅스텐 전극)를 이동 합니다.
  3. 상 악 벨 (그림 3B)에서 약 1 cm 냄새 배달 장치를 조정 합니다.
  4. 레코딩 소프트웨어를 자동 스파이크 32를 엽니다. 녹음 매개 변수를 다음과 같이 설정: 녹음 규모 500 µ V; 300 Hz, 200 Hz;에 낮은 컷오프에 필터의 높은 컷오프 그리고 10에 pretrigger s.
  5. 보편적인 ac/DC 증폭기 x 10를 기록 전극을 연결 합니다.
  6. (500 X) 높은 확대에 현미경을 전환 합니다. 상 악 벨에 basiconic sensillum의 기록 전극 삽입 하 고 섬세 하 게 기록 전극 좋은 자연 스파이크 (그림 3D)를 조정 합니다.
  7. 20 ml에 지속적인 공기 흐름을 제공 하는 자극 컨트롤러/s. 10 1 미 기록 신호 자극 시간 설정 시작 10 s s 자극 펄스의 발병 하기 전에.
  8. 10 x 보편적인 ac/DC 증폭기를 사용 하 여 신호를 증폭 하는. IDAC 4에 신호를 피드. 자동 스파이크 32 소프트웨어와 신호를 분석 합니다. AC 신호는 대역 통과 필터링 200 ~ 300 Hz. 사이 사용 자동 스파이크 32 소음에서 피크--물마루 진폭을 구별할 수 있다. 자연 주파수에 활동 전위 주파수 (초당 스파이크)에 증가 하는 만큼 신경의 응답을 계산 합니다. GraphPad Prism 7를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다.

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결과

메뚜기 상 악 벨에 두 sensilla 하위 (pb1 및 pb2) 화학 odorants (10 %1 nonanol 및 10 %nonanoic 산)에 다른 응답 역학에 따라 식별 됩니다. Pb1에 있는 신경 세포 생산 1-nonanol 보다 pb2에 신경 동안 nonanoic 산에 상당히 적은 1-nonanol nonanoic 산 (그림 4)와 비교 하 여 활성화에 훨씬 더 많은 스파이크. Hexanal 및 E-2-Hexenal 응답 (POR)26여 메뚜기 벨을 보여주고 수 있습니다. Hexanal는 풍부한 호스트 녹색 식물 잎 휘발성 음식 소스26추가 확인에 기여할 수 있는 이다. Pb1 뉴런에 마지막 elicited 스파이크 pb2 그들은 E-2-hexenal (그림 4)에 의해...

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토론

곤충 음식 냄새를 감지 하는 palps에 의존 하 고 그들의 palps speciation13,27에 중요 한 역할을 것으로 추정 된다. palps 간단한 후 각 장기 고는 neuromolecular의 탐험에 대 한 매력적인 모델 네트워크 기본 chemosensation28로 증가 관심을 받고 있다.

Labellar 곤충 및 벨 SSRs 성공적으로 수행 되었습니다 초파리 melanogaster, Anopheles gambiae, 및 Culex quinquefasciatus13,,1415,

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (No.31472037)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 상호 또는이 문서에서 상용 제품의 언급만을 목적으로 특정 정보를 제공 하 고 추천을 의미 하지는 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
텅스텐 와이어어드벤트W559504전극을 만들고 palp
NaNO2aldrich563218-25G텅스텐 와이어
AC 전원 공급 장치SyntechA2-70텅스텐 와이어
StereoscopeMoticSMZ-163. 텅스텐 와이어의 샤프닝
현미경올림푸스W-51메뚜기 상악 손바닥에서 센실라를 관찰하는 데 사용
지능형 데이터 수집 컨트롤러SyntechIDAC-4기록 전과 기록 중 모든 신호의 실시간 화면 표시
자극 컨트롤러SyntechCS-55자극 응용 프로그램
전자 제어에 사용 micromanipulatorC.M.D.TCFT-8301D기록 전극의 미세한 움직임에 사용
MicromanipulatorNarishigeMN-151기준 전극의 미세한 움직임에 사용
스피커EDIFIERR101T06IDAC-4와 연결되어 신호에 소리를 제공
Magnetic basePDOKPD-101전극 및 자극 전달 튜브를 고정하는 데 사용됩니다.
진동 절연 테이블TianHeHAP-100-1208장비에서 진동을 분리하는 데 사용
유리 슬라이드CITOGLASZBP-407의 기초를 만드는 데 사용
텅스텐 와이어
고정 파스퇴르 튜브YAREWITEG자극 자극 용액을 포함하는 여과지 배치
을 연마하는 데 사용됩니다. 을 연마하는 데 전압을 제공하는 데 사용됩니다 MPH Blu-tack Bostik Blu-tack-45g

참고문헌

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