3 차원 (3D)-배열 하는 높은 처리량 Zebrafish 태아에 대 한 서식 파일을 인쇄

요약

여기, 우리 디자인 하 고 서식 파일, 높은 처리량 zebrafish 태아 96 잘 접시에 배열에 대 한 같은 서식 파일의 사용에 자세한 절차 뒤 개 zebrafish 태아 조작 프로토콜을 제시.

초록

제 브라는 세계적으로 인정된 민물 유기 체 자주 사용 개발 생물학, 환경 독성, 그리고 인간의 질병에 관련된 연구 분야 이다. 큰 통치, 배아 반투명, 빠르고 동시 개발, 등, 등의 독특한 기능 zebrafish 태아는 종종 대규모 화학 물질의 독성 평가 및 사용 약물/화합물 심사. 일반적인 심사 절차 포함 성인 zebrafish 산란, 배아 선택, 다 잘 판에 배아를 개. 거기에서 태아 노출 및 화학 물질, 독성을 복종 된다 또는 마약/화합물의 효과 phenotypic 관측에 따라 상대적으로 신속 하 게 평가할 수 있습니다. 이러한 프로세스 중 개 배아 처리량 수준을 제한 하는 가장 시간이 많이 걸리는 하 고 노동 집약적인 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜에서 선물이 3D 인쇄 arraying 서식 파일의 사용과 결합 하 게 진공 속도이 힘 드는 단계를 조작 하는 혁신적인 접근 방식. 본 프로토콜 arraying 템플릿, 상세한 실험 설정 및 대표 결과 다음 단계별 절차의 전반적인 디자인을 설명 합니다. 구현 될 때,이 방법은 테스트 과목으로 zebrafish 태아를 사용 하 여 연구 응용 프로그램의 다양 한에서 도움이 증명 해야 합니다.

서론

인기 모델 생물으로 zebrafish 의학 및 독극물^1,2,,34의 분야에서 널리 사용 됩니다. 생체 외에서 플랫폼에 비해, zebrafish 제공 훨씬 더 큰 생물 복잡 하나 또는 2 개의 세포 유형 제공 하지 못했습니다. 모델, zebrafish의 큰 통치, 빠르고 동시 배아 개발 및 높은 기관 전체 유기 체 외 반투명 대규모 독성 또는 약/화합물⁵를 심사에 사용 될이 모델 독특한 이점을 주었다. 매주 성인 zebrafish의 한 쌍에 의해 생성 하는 배아의 수백 다른 모든 동물 모델을 능가 하 고 높은 처리량 검열을 위해 적당 한 만든.

제 브라를 사용 하 여 일반적인 심사 절차 많은 성인 zebrafish 산란, 태아 선택, 그리고 그들이 물 침수를 통해 노출 대상이 되 적당 한 용기에 배아를 개 같은 수동 작업이 포함 됩니다. 태아의 개발은 모니터링 및 사망률, hatchability 등 비정상적인 관찰 끝점 자주 수동으로 평가 화학 물질의 독성 또는의 효과의 표시의 예비 식별으로 사용 약 또는 화합물입니다. 속도 심사 절차를, 자동화 된 이미징 및 컴퓨터 기반 이미지 분석 등 접근은 이전 탐험 되었습니다 있다. 예를 들어 현미경 이미징 기능 높은 콘텐츠로 384 분의 96 잘 접시⁶에서 다양 한 발달 단계에서 자동화 된 밝은 필드 또는 형광 이미징 zebrafish 태아에 수행 적응 되었습니다. 현미경과 함께 미세 장치는 뇌 뉴런⁷의 이미징에 대 한 현재 조작을 통해 zebrafish 애벌레를 사용 되었다. 이러한 접근 수 크게 전통적인 수동 작업에 비해 이미지 취득의 효율성을 향상 시킵니다. 또한, 생성 되는 이미지의 큰 숫자, 이미지 분석 도구 또한 개발 되었습니다 속도 데이터 처리를 같이 리 외 와 화 외. ^{8 , 9}.

이미징 및 이미지 분석의 처리량 수준을 증가, 심사에 대 한 속도 제한 단계 96-또는 384-잘 접시에 배열 하는 일반적으로 의미 노출 zebrafish 태아를 준비 하는 과정은 취소 되었습니다. 이 병목 단계를 해결 하기 위해 비전 가이드 로봇 Mandrell 외. 에 의해 개발 되었다 ¹⁰ 와 미국 수동 처리 하지만 악기를 대체 하는 이전¹¹ 꽤 되었고 이러한 기술을 구현 하는 깊은 학습 곡선입니다. 따라서, 사용 하기 쉬운 접근 된다 더 zebrafish 심사 처리량 수준을 개선 하는 하나의 중요 한 요소 이며이 작품의 주요 목적은 제공 하기.

이 작품에서는, 우리는 설계 및 3D 인쇄 하 여 서식 파일을 배열 하는 배아를 조작. 이러한 arraying 서식 파일 표준 96 잘 접시와 맞는 우물으로 zebrafish 태아를 모 함 하도록 설계 되었습니다. 배아를 선택 하 고 개별 음 하나 하나에 그들을 배열, 대신 하나를 수행할 수 배아 함정 및 배열 모든 96 배아 multiwall 격판덮개로 한 번에. 이 서식 파일 및 다음 프로토콜을 사용 하 여, 하나 크게 어느 것이 기간 부스트 심사 용량 적어도 열 배, 수동 조작에 비해 multiwall 접시에 배아를 배열의 효율성을 증가할 수 있었다. 프로토콜 아래에 설명 된 템플릿, zebrafish 산란, 배아 수집, 배열 및 배열에 대 한 전반적인 디자인을 포함 한다. 그림 1 에서는 arraying 서식 파일의 전반적인 디자인. 그림 2 는 부품 3 및 4에 설명 된 서식 파일을 사용 하 여 단계별 프로토콜에 대 한 개요를 보여 줍니다.

프로토콜

1. 디자인 및 템플릿 개 Zebrafish 태아의 제조

1. 8에서 12, 96-잘 레이아웃을 표준 96 잘 접시를 맞는 arraying 서식 파일을 디자인 합니다. 크기는 위 태아 함정 챔버에 대 한 그림 1A 에 나열 된 사용 (보조 파일 참조).
   1. 함정에 대 한 잘 그림 1B 및 1 D 에 표시 된 크기를 사용 합니다.
   2. 그림 1C 의 크기를 사용 하 여 바닥 진공 챔버에 대 한.
   3. 그림 1B 에서 치수를 사용 하 여에 어에 대 한 / 콘센트.
2. (0.1 m m 정밀도)로 3D 프린터를 사용 하 여 인쇄 서식 파일; 인쇄에 사용할 권장된 수 지에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
   참고: 0.1 m m 정밀 3D 프린터 arraying 서식 파일의 제작에 대 한 권장 ( 재료의 표참조). 서식 파일의 표면에 대 한 제안 된 색상은 어두운 회색 또는 검은색.

2. Zebrafish 태아 산란

1. 두 켤레 상자 1 일 산란 전에 짝짓기 당 남성과 여성의 물고기를 놓습니다. 별도 남성 그리고 투명 한 플라스틱 분배기에 의해 여성.
2. 벗을 디바이 더 아침에 남성과 여성의 생선을 혼합.
3. 남성과 여성의 물고기를 제거 하 고 zebrafish 태아 파인 메쉬 스 트레이너를 사용 하 여 수집 합니다. 세척 배아를 250 mL 계란 물 ( 재료의 표참조).
4. 접시 (직경 90 mm) Holtfreter의 솔루션에 수집 된 배아를 전송 ( 재료의 표참조) 죽음과 unfertilized 배아는 stereomicroscope를 사용 하 여 제거.
5. 28.5 ° C 인큐베이터에 배아를 놓습니다. 게시물 수정 (hpf)에서 4 h, 배아 관찰 하 고 모든 죽은 건강에 해로운 배아를 제거. 배아는 다음 단계에 대 한 준비가 지금입니다.

3입니다. 개 서식 파일의 준비

1. 템플릿 2-3 시간 500 mL 이온을 제거 된 물으로 세척 하 고 5 분 동안 건조 오븐 (45 ℃)에 넣어.
2. 테이프 씰링 필름 (그림 21 단계)의 조각으로 하단 챔버.
3. 서식 파일의 아래쪽에 공기 출구를 통해 진공 펌프를 연결 합니다.
   참고: 권장된 최대 진공 진공 펌프에 대 한 0.1 Mpa 이다. 사용 하는 진공의 강도 알고 있어야 합니다. 부정적인 압력 너무 강한 경우에, 압력을 낮은 씰링 필름에 있는 십자가 모양의 구멍을 잘라.

4. 96 잘 접시에 Zebrafish 태아 개

1. 그림 2, 2 단계에서에서와 같이 약 150 배아는 서식 파일에 장소 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여.
2. 3.3 단계에서 씰링 필름에 의해 봉인 챔버에 부정적인 압력 생성 하 공기 출구에 진공 펌프를 연결 합니다.
3. 각 잘 한 배아 속은 (그림 2, 3 단계) 때까지 가로 전체 템플릿 흔들.
   참고: 경우에 Holtfreter의 솔루션은 배아 각 우물에 갇혀 있다 전에 마르면, 함정 챔버에 추가 Holtfreter의 솔루션을 추가 하 고이 단계를 반복.
4. 여분의 Holtfreter 솔루션 및 웰 스 (그림 2, 4 단계)에 침투 하지 배아 폐기.
5. 해제을 진공 펌프를 분리 합니다.
6. (그림 2, 5 단계) 서식 파일에 대 한 표준 96 잘 접시를 거꾸로 배치 하 고 (그림 2, 6 단계) 동시에 회전.
7. 서식 파일의 아래쪽을 누르거나 공기 연결 콘센트 압축된 가스 뿌리에 96 잘 접시 (그림 2, 6 단계)에 서식 파일에서 모든 갇힌된 배아를 전송 할 수 있는.
8. 4.1 4.8 추가 멀티 잘 접시 준비 단계를 반복 합니다.
9. 씰링 필름을 제거 하 고 차후 사용을 위해 500 mL 이온된 물으로 아래로 위에서 3 번 템플릿 세척.
   참고: 서식 파일 청소 같은 에탄올, 어떤 유기 용 매를 사용 하지 마십시오.

결과

그림 3 은 전형적인 3D 인쇄 arraying 템플릿을 보여준다. 이 감광 성 수 지 원료로 사용 하 여 템플릿과 3D 프린터;에 의해 만들어진 블랙 페인트의 레이어 배아의 색상에 더 나은 대조를 제공 하기 위해 적용 되었습니다. 96 웰 스 (8으로 12)의 위치는 표준 96 잘 접시와 맞게 설계 되었다. 마찬가지로, 384 (16 24) 잘 서식 파일 또한 디자인 될 수 하 고 동일한 방법을 사용 하 여 조작 합니다. 거꾸로 챔버는 더 나은 적합을 제공 하기 위해 표준 96 잘 접시 보다 약간 더 큰. 홈 또한 배열 하는 동안 여분의 배아를 개최 하도록 설계 되었습니다.

겸손 한 속도로 20 접시만 2 ~ 3 접시 수동으로 준비 될 수 있는 하는 동안 30 분 이내 3D 인쇄 arraying 서식 파일을 ...

토론

3D 인쇄 템플릿 개 zebrafish 태아의 성공적인 구현에 대 한 세심 한 관심을 필요로 하는이 프로토콜에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다.

Arraying 서식 파일의 디자인에서 가장 중요 한 요소는 함정을 잘 이다. 확실 하 게 하는 단 하나의 배아 각 우물에 갇혀, 하나 지름과 함정 우물의 깊이 통해 구멍의 지름에 세심 한 관심을 기울여야 한다. 권장된 직경 내에서 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 1.5 ~ 2 배입니다. 잘 함정의 깊이 이어야 한다 내 2 시간 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 같은 우물에서 배아의 스태킹 피하기 위해. 통해 구멍의 지름을 이어야 한다 약 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 절반을 배아는 구멍을 통해 부정적인 압력에 의해 압력을 받고 피하기 위해. 디자인의 복잡성 때문에 3D 인쇄 기술은 arraying 서식 파일의 제작에 대 한는 것이 좋습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
얼룩말 시설	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.	Z-A-S5
짝지어주는 상자	상해 Haisheng Biotech Co., 주식 회사.
세척 병, 500 ml	Sangon Biotech	F505001-0001
염화나트륨	Vetec	V900058-500G
염화 칼륨	시약 Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd	10016318
염화	칼슘 Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd	20011160
중탄산 나트륨	Vetec	v900182-500G
메틸렌 블루 수화물	TCI	M0501
염산	Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd	10011008
바다 소금	인스턴트 오션	SS15-10
Pipetter	Fisherbrand	13-675M
제어 드롭 파스퇴르 Pipet	Fisherbrand	13-678-30
현미경	OLYMPUS	SZ61
생화학 인큐베이터	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	LRH-250
3D 프린터	UnionTech	Lite600
감광성 수지	UnionTech	UTR9000
진공 펌프	Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.	SHB-IIIA
접착제 PCR 플레이트 씰	Solarbio	YA0245
96 웰 플레이트	Costar	3599
멀티 8 채널 피펫 30-300 μ l	Eppendorf	3122000.051
압축 가스 살포기	Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.	ST1005
DI 물	Thermo	GenPure Pro UV/UF
건조 오븐	상하이 Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	BPG-9106A
시설 내 물 시스템 물			s 워터 시스템
계란 물			희석 60mg " 인스턴트 오션" 바다 소금 및 0.25 mg/L 메틸렌 블루 1 L DI 물
Holtfreter' s 용액			7.0g 염화나트륨 (NaCl), 0.4g 중탄산 나트륨 (NaHCO3< / sub>), 0.1g 염화칼륨 (KCl), 0.235g 염화칼슘 (CaCl2.2H2O)를 1.9L DI 물에 용해시킵니다. HCl을 사용하여 pH를 7로 조정하고 Di water를 사용하여 부피를 2L로 조정합니다