막 단백질 구조 분석 및 Ab 론 적 모델링 작은 각 중성자 산란 실험에서 일치 하는 대비 세제

요약

이 프로토콜에는 저해상도 ab initio 모델 및 대비 세제의 일치와 작은 각 중성자 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 세제 solubilized 막 단백질의 구조 정보를 가져오는 방법을 보여 줍니다.

초록

높은 유출 동위 원소 반응 기의 오크 리 지 국립 연구소에서 생물 학적 작은 각 중성자 뿌리기 악기는 생물 자료, 처리, 바이오 연료 및 바이오 영감 자료 취재를 나노미터의 수사에 전념 마이크로미터 길이 가늠 자. 막 단백질의 물리적 특성 (즉, 크기와 모양) 조사에 대 한 여기에 제시 된 방법 (여기, MmIAP, Methanoculleus marisnigri에서 intramembrane aspartyl 프로 테아 제) 솔루션 micelle을 형성의 세제는 다른 사람의 사이에서이 작은 각 중성자 뿌리기 악기에 대 한 잘 적합 한 다른 생물 특성화 기법 단백질 세제의 복잡 한 구조에 세제 기여를 해결 하기 위해 그들의 무 능력에 의해 방해 된다. 또한, 바이오 Deuteration 실험실에 대 한 액세스는 대규모 경작을 준비 하 고 표현 하는 중수소 표시 된 단백질 단백질에서 향상 된 산란 신호에 대 한 독특한 기능을 제공 합니다. 이 기술은 고해상도에서 구조 세부 정보를 제공 하지 않습니다, 막 단백질에 대 한 구조적 지식 격차 근처 원자 해상도 필요 없이 연구의 많은 주소 지정 가능 영역을 포함. 예를 들어이 지역 섭 동, 그리고 접는 펼쳐진 이벤트 동안 oligomeric 상태, 복잡 한 구조적 변경의 결정을 포함합니다. 이러한 조사는이 방법의 응용 프로그램을 통해 쉽게 수행할 수 있습니다.

서론

막 단백질은 모든 유전자¹ 의 약된 30%에 의해 인코딩되고 현대의 약 약물에 대 한 대상의 강한 대다수를 나타냅니다. ² 이 단백질의 중요 한 세포 기능,³ 하지만 그들의 풍요로 움과 중요성에도 불구 하 고 다양 한 수행-총 구조 연구 Collaboratory 구조 생물 정보학 (RCSB) 단백질에의 약 1%만 대표 데이터 은행입니다. ⁴ 그들의 부분적으로 소수 성 특성으로 인해 막-바인딩 단백질의 구조 결정이 되었습니다 매우 도전. ^{5 , 6 , 7}

많은 생물 기술, 측정을 위한 솔루션에 단 분산 입자를 요구 네이티브 막에서 막 단백질을 분리 하 고 기본 세포 막의 수용 성 모방에이 단백질 안정화 되었습니다 연구의 활성 영역에서 최근 수 십년입니다. ^{8 , 9 ,}

프로토콜

1. 준비 및 중성자 시설 빔 시간과 악기 제안 제출

1. 중성자 산란 시설 일반 사용자 중성자 빔 시간 액세스, 오크 리 지 국립 연구소 (ORNL) 등을 제공 하는 식별 하는 온라인 리소스를 참조 하십시오. 중성자 시설 및 전세계 중성자 연구에 대 한 정보 지도 온라인. ⁴⁶ 이 시설 일반적으로 제안;에 대 한 일반 전화는 알고 있어야 이 때 다음 빔에 사용할 수 있을 것입니다 결정 합니다. 중성자는 다양 한 애플 리 케이 션;에 사용 작은 각 중성자 산란 (SANS) 악기, 특히 그 생물 학적 샘플에 대 한 기능에 대 한 검색.
2. 중성자 시설에서 제공 하는 리소스를 사용 하 여 중성자 빔 시간 제안 제출 프로세스를 탐색 하는 데 도움이. 으로 중성자 산란 과학자 (NSS) 적용 됩니다 악기와 관련 된 문의. 중성자 시설 제안 전화, 마감, 및 제출물에 대 한 조언에 대 한 현재 정보를 검토 오크 리 지에 대 한 이것은 사용할 수 온라인입니다. ⁴⁷ 성공적인 제출에 대 한 모든 지침에 따라 빔 시간 제안을 제출 합니다.
3. Deuterated 단백질 필요 (2.2 참조) 인 경우에, 중성자 산란 시설 종종 deuterated 재료의 생산에 전념 하는 지식과 실험....

결과

빔 시간과 악기 제안 명확 하 게 제안 된 실험의 유효한 평가 될 수 있도록 검토 위원회에 필요한 모든 정보를 전달 한다. NSS와 통신 매우 경험이 사용자에 대 한 제안 했다. 초기 타당성 및 가이드 제안 제출 타당성, 안전 및 높은-영향 과학에 대 한 잠재력을 강조 하는 NSS 평가할 수 있습니다. 제안에서 제공 하는 정보는 배경 정보 및 연구;의 중요성에 대 한 컨텍스트 포함 되어야 합니다. 주어질 것으로 예상 되는 지식 및 과학;의 관련된 분야에서 현재 이해에 미치는이 설명 작업, 샘플, 방법, 및 절차를 사용할 것입니다; 그리고, 해당 되는 경우 관련 간행물 및 결과 포함 하 여 시설에서 팀의 이전 생산성. 제안 템플릿 및 제안, 준비 사항 등 유용한 자원, 중성자 과학 사용자 포털 (neutrons.ornl.gov/users)를 통해 사용자에 게 사용할 수 있습니다.

토론

구조 생물학 연구 솔루션 분산 솔루션에서 생체에서 생화학 및 구조 정보 (예: 전체 크기 및 모양)를 같은 보완 구조 기술을 활용 합니다. SAN은 낮은 해상도 막 단백질의 구조, 현대 구조 생물학 및 생화학의 핵심 초점을 결정 하기 위한 특히 매력적인 기술입니다. SAN의 순화 된 단백질 결정학 실험 (1 mg/샘플)의 비교를 요구 한다. 고 순도 deuterated 세제 관련 막 단백질 연구의 최근 확장 상업적인 가용성은 액세스할 수 있습니다이 수소/중수소 막 단백질-세제 단지의 실험 SAN에 대 한 콘텐츠를 조작 하는 수단 직접 기록 단백질 신호를 허용 합니다. 성공 하면 ab initio 모델 분자 봉투는 단지 몇 시간 동안 수집 된 데이터에서 계산할 수 있습니다. 따라서, 막 단백질 생화학, biophysicists, 및 구조상 생물학 쉽게 활용할 수 탐 낼된 초기 3D 모델의 솔루션에서 막 단백질, 파트너 또는 기질, 그리고 얻은 모델 바인딩 복잡 한 구조를 얻기 위해 SAN SAN에 의해 회절 데이터.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Amicon Ultra MWCO 50KDa 농축기	EMD Millipore	UFC905096	실험기구
구연산 암모늄 이염기	성 Fisher Scientific	A663	중간 성분
황산 암모늄	EMD Millipore	2150	중간 성분
Bioflo 310 생물 반응기 시스템	Eppendorf	M1287-2110	장비
염화칼슘 이수화물	Acros	423525000	중간 성분
Carbenicillin	IBI Scientific	IB02025	항생제
Chloramphenicol	EMD Millipore	3130	항생제
코발트 (II) 염화	Acros	AC21413-0050	중간 구성
요소 구리 (II) 황산	Acros	AC19771-1000	중간 구성 요소
중수소산화물	시그마-알드리치	756822	중간 성분
드라이라이트 가스 청정기	WA Hammond Drierite Co., Ltd.	27068
EDTA, 디소듐, 이수화물	EMD Millipore	4010	중간 구성 요소
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	장비
및 Auml; kta 퓨리파이어 UPC100	GE 헬스케어		장비
글리세롤	Sigma-Aldrich	G5516	중간 구성
요소 HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼	GE Healthcare
이미다졸	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
염화철(III) 육수화물	MP 생화학 ICN19404590		중간 성분
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425-2
황산마그네슘 헵타하이드레이트	VWR	97062-134	중간 성분
망간(II) 황산염 일수화물	Acros	AC20590-5000	중간 구성 요소
MaxQ 6000 인큐베이팅/냉장 쉐이커	Thermo Scientific	SHKE6000-7	설비
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310A
인산칼륨 monobasic	VWR	97062-346	중간 구성 요소
RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	장비
SIGMAFAST 프로테아제 억제제 칵테일 정제, EDTA 무료	시그마-알드리치	S8830
염화나트륨	시그마-알드리치	S3014
수산화나트륨	그마-알드리치	795429
인산나트륨 이염기성	시그마-알드리치	S7907	중간 구성 요소
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0.2µ가 있는 멸균 일회용 병 상단 필터; m PES 멤브레인	Thermo Scientific	596-4520	실험기구
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Superose-12 10/300 GL 컬럼	GE 헬스케어
Ultrospec 10 세포 밀도	GE Healthcare	80211630	장비
황산 아연 수화물	Acros	AC38980-2500	중간 구성 요소