막 단백질 구조 분석 및 Ab 론 적 모델링 작은 각 중성자 산란 실험에서 일치 하는 대비 세제

요약

이 프로토콜에는 저해상도 ab initio 모델 및 대비 세제의 일치와 작은 각 중성자 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 세제 solubilized 막 단백질의 구조 정보를 가져오는 방법을 보여 줍니다.

초록

높은 유출 동위 원소 반응 기의 오크 리 지 국립 연구소에서 생물 학적 작은 각 중성자 뿌리기 악기는 생물 자료, 처리, 바이오 연료 및 바이오 영감 자료 취재를 나노미터의 수사에 전념 마이크로미터 길이 가늠 자. 막 단백질의 물리적 특성 (즉, 크기와 모양) 조사에 대 한 여기에 제시 된 방법 (여기, MmIAP, Methanoculleus marisnigri에서 intramembrane aspartyl 프로 테아 제) 솔루션 micelle을 형성의 세제는 다른 사람의 사이에서이 작은 각 중성자 뿌리기 악기에 대 한 잘 적합 한 다른 생물 특성화 기법 단백질 세제의 복잡 한 구조에 세제 기여를 해결 하기 위해 그들의 무 능력에 의해 방해 된다. 또한, 바이오 Deuteration 실험실에 대 한 액세스는 대규모 경작을 준비 하 고 표현 하는 중수소 표시 된 단백질 단백질에서 향상 된 산란 신호에 대 한 독특한 기능을 제공 합니다. 이 기술은 고해상도에서 구조 세부 정보를 제공 하지 않습니다, 막 단백질에 대 한 구조적 지식 격차 근처 원자 해상도 필요 없이 연구의 많은 주소 지정 가능 영역을 포함. 예를 들어이 지역 섭 동, 그리고 접는 펼쳐진 이벤트 동안 oligomeric 상태, 복잡 한 구조적 변경의 결정을 포함합니다. 이러한 조사는이 방법의 응용 프로그램을 통해 쉽게 수행할 수 있습니다.

서론

막 단백질은 모든 유전자¹ 의 약된 30%에 의해 인코딩되고 현대의 약 약물에 대 한 대상의 강한 대다수를 나타냅니다. ² 이 단백질의 중요 한 세포 기능,³ 하지만 그들의 풍요로 움과 중요성에도 불구 하 고 다양 한 수행-총 구조 연구 Collaboratory 구조 생물 정보학 (RCSB) 단백질에의 약 1%만 대표 데이터 은행입니다. ⁴ 그들의 부분적으로 소수 성 특성으로 인해 막-바인딩 단백질의 구조 결정이 되었습니다 매우 도전. ^{5 , 6 , 7}

많은 생물 기술, 측정을 위한 솔루션에 단 분산 입자를 요구 네이티브 막에서 막 단백질을 분리 하 고 기본 세포 막의 수용 성 모방에이 단백질 안정화 되었습니다 연구의 활성 영역에서 최근 수 십년입니다. ^{8 , 9 , 10} 이러한 조사 이끌어 많은 소설 amphiphilic 어셈블리의 개발을 solubilize 막 단백질, nanodiscs,^,1112,13 bicelles,^{14,15 등} 및 amphipols. ^{16 , 그러나 17} , 세제 micelles 사용 하 여 주어진된 단백질의 가용성 요구 사항 만족을 위한 가장 일반적이 고 간단한 방법 중 하나 남아 있습니다. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} 불행 하 게도, 아니 단일 세제 또는 세제의 마법의 혼합 현재 존재 만족 모든 막 단백질; 따라서, 이러한 조건 각 단백질의 고유한 요구 사항에 대 한 경험적으로 상영 될 해야 합니다. ^{26 , 27}

세제는 솔루션 그들의 임계 micelle 농도 이상에서 micelles 이라는 형태로 집계 구조 자기 조립. Micelles (일반적으로 20-200에서 배열 하는) 많은 세제 단위체 micelle 코어 수성 용 매에 직면 micelle 쉘 계층에 배열 하는 친수성 머리 그룹을 형성 하는 소수 성의 알 킬 체인으로 구성 됩니다. 세제 및 micelle 형성의 동작 고전적인 찰스 Tanford의 소수 성 효과,²⁸ 및 크기에 의해 설명 하고있다 고 막 단백질 연구에 일반적으로 사용 되 세제에서 micelles의 모양 작은 각 뿌리기를 사용 하 여 특징. ^{29 , 30} 세제 조직 막 단백질에 대 한 공부도 했다 고 깔끔한 세제 유사한 배열에서 단백질을 둘러싼 세제 분자와 단백질 세제 단지 (Pdc)의 형성 예상 micelles입니다. ³¹

하나 추가 세제를 사용 하 여 장점은 다른 세제를 통합 하 여 결과 micelle 속성을 조작할 수 있습니다. 많은 세제 전시 이상적인 혼합 하 고 혼합된 micelles의 선택 속성 구성 요소와 혼합의 비율에서 예측도 있습니다. ^{그러나 22} , 세제의 존재 수 여전히 도전을 제시 생물 characterizations 위한 전체 신호에 기여 함으로써. 예를 들어, x 선 및 산란 기법, PDC에 세제에서 신호 단백질에서 실제적으로 구별할 수 아니다. ³² 단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)와 조사 일반적으로 의존 갇혀 (냉동된) 입자; 단백질의 구조 정보는 여전히 특정 세제 또는 배경에 추가 세제의 높은 농도 의해 왜곡 됩니다. ³³ (세제 포함) 전체 PDC 구조 해석으로 대체 방법 특정된 막 단백질 주위 세제를 재구성 하기 위해 노력 하는 계산 방법을 통해 되었습니다. ³⁴

중성자 산란의 경우는 micelle에서 세제의 코어-쉘 배열 관찰된 산란에 기여 하는 폼 팩터를 생성 합니다. 다행히, 그들은 그물 관찰된 산란에 기여 하지 않는 그런 솔루션 구성 요소를 변경할 수 있습니다. 이 "일치 대조" 프로세스 산란 길이 조밀도 (버퍼) 배경의 일치를 달성 하기 위해 수소 중수소를 대체 하 여 이루어집니다. (사용 가능한 deuterated 대응)와 세제의 현명한 선택과 혼합의 그들의 비율을 고려 되어야 한다. 세제 micelles에 대 한 이러한 대체 deuterated 알 킬 체인 (d-h-꼬리 대신 꼬리) 하지만 같은 머리 그룹으로는 세제를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 세제는 잘 혼합, 이후³⁵ 그들의 집계 해야한다 가중치 두더지 분수 산란 길이 조밀도 두 가지 구성 요소 (h-꼬리와 d-꼬리)의 평균. 이 평균 대비 머리 그룹의 일치 때 유니폼 집계 구조 관찰된 산란에 모든 기여를 제거 하려면 완전히 일치할 수 있습니다.

선물이 여기 세제 micelles의 중성자 대비 화학적으로 동일한 세제 분자 중수소 라고 표시 된 알 킬 체인을 통합 하 여 조작 하는 프로토콜. ^{19 , 36 , 37} 이 micelle 코어와 쉘, 중성자 산란의 고유 능력은 일치 하는 완전 한 동시 대비 수 있습니다. ^{35 , 38} 이 상당히 세련 된 세부 수준 대비 일치 사용할 수 있습니다 그렇지 않으면 unfeasible 막 단백질 구조 연구. 또한,이 일치 하는 대비 접근 세제, 폴리머 교환 반응³⁹ 와 기름-물 dispersants,⁴⁰ , bicelles,⁴¹ 등 다른 solubilizing 에이전트 등 관련 된 다른 시스템을 확장할 수 있습니다. nanodiscs,⁴² 또는 블록 공중 합체. ⁴³ A 유사한 접근이이 원고, 하지만 알 킬 체인 또는 머리 그룹에 부분 중수소 대체와 단일 세제 종 채용 개요 최근에 출판 되었다. ³⁷ 이 수소와 중수소는 세제를 통해 임의의 분포를 개선 하기 위해 예상 될 수 있다 하는 동안 여기, 접근에 비해 대체 하 고 2 단계에 대 한 세제에 사용할 수 있는 위치 제한 수 합성 세제는 고려에 대 한 포즈 추가 과제를 필요합니다.

1 단계와 2 단계 아래 자주 상세한 프로토콜의 중복 때문에 초기 실험 계획 품질 제안서를 제출 할 수 있어야 합니다. 그러나 제안 제출으로 간주 하는, 중성자 실험 임박이 프로세스를 시작 해야 하는 것을 강조 하기 위해 첫 단계로 여기. 그것은 또한 제안에 의해 증명 한다, 필수 단계 중성자 연구에 대 한 필요성을 지 원하는 샘플의 생 화 학적 및 물리적 특성 (를 포함 하 여 순도 안정성)을가지고 하는 것입니다 주목 해야한다. 작은 각 중성자 산란 (SANS)에 대 한 일반적인 논의이 문서의 범위를 벗어납니다. 간단한 지만 철저 한 소개 Kaufmann,⁴⁴ 및 포괄적인 교과서에 초점 맞춘된 생물 작은 각도 솔루션 비 산 재료의 특성은 최근 게시 되었습니다 참조 작업에 제공 됩니다. ⁴⁵ 추가 권장된 독서 토론 섹션에서 제공 됩니다. 작은 각도 산란 산란 과정을 설명 하는 중앙 수량으로 소위 산란 벡터 Q를 사용 합니다. 이 문서 Q 널리 수용 되는 정의 사용 하 여 4π 죄악 (θ) = λ θ가 들어오고 흩어져 빔과 λ 사이의 절반 각도 옹스트롬의 중성자 방사선의 파장 /. 다른 정의 존재 사용 다른 기호 등의 ' 산란 벡터, 그리고 요인 2 π 또는 나노미터 Angstrom 대신를 사용 하 여 다 수 있습니다 ( 그림 10의 내용 참조).

프로토콜

1. 준비 및 중성자 시설 빔 시간과 악기 제안 제출

1. 중성자 산란 시설 일반 사용자 중성자 빔 시간 액세스, 오크 리 지 국립 연구소 (ORNL) 등을 제공 하는 식별 하는 온라인 리소스를 참조 하십시오. 중성자 시설 및 전세계 중성자 연구에 대 한 정보 지도 온라인. ⁴⁶ 이 시설 일반적으로 제안;에 대 한 일반 전화는 알고 있어야 이 때 다음 빔에 사용할 수 있을 것입니다 결정 합니다. 중성자는 다양 한 애플 리 케이 션;에 사용 작은 각 중성자 산란 (SANS) 악기, 특히 그 생물 학적 샘플에 대 한 기능에 대 한 검색.
2. 중성자 시설에서 제공 하는 리소스를 사용 하 여 중성자 빔 시간 제안 제출 프로세스를 탐색 하는 데 도움이. 으로 중성자 산란 과학자 (NSS) 적용 됩니다 악기와 관련 된 문의. 중성자 시설 제안 전화, 마감, 및 제출물에 대 한 조언에 대 한 현재 정보를 검토 오크 리 지에 대 한 이것은 사용할 수 온라인입니다. ⁴⁷ 성공적인 제출에 대 한 모든 지침에 따라 빔 시간 제안을 제출 합니다.
3. Deuterated 단백질 필요 (2.2 참조) 인 경우에, 중성자 산란 시설 종종 deuterated 재료의 생산에 전념 하는 지식과 실험실에 의해 지원 됩니다. ORNL에 바이오 Deuteration 연구소 (BDL)에 대 한 액세스를 요청 하려면 제안 시스템에 두 번째 계기 BDL을 선택 합니다. SAN 제안 타당성 및 과학적 검토 위원회에 의해 검토, 동안 BDL 요청 타당성에 대 한 상영만. 돕기 위해 BDL 타당성 검토, 제출 완료 정보 요청 양식⁴⁸ 단백질 표정 프로토콜 및 예상된 수익률 (사용 가능한 온라인).
4. 성공적인 피어-검토 후 빔 시간 제안 실험 사전 빔 시간 수 여 날짜를 확인 합니다. 모든 샘플 및 버퍼 내용과 수식 나열 되어 있는지 올바르게 적절 한 검토를 위해 제안에서 확인 하십시오. 샘플 및 버퍼 구성에 변화를 포함 하 여 제안 된 실험 계획 변경 알림 시설 필요.
   참고: 변화 할당 된 NSS와 최대한 빨리 토론 되어야 한다.

2. 단백질 측정을 위한 중성자 대비 일치 점과 필요한 대비를 결정

1. (공급 업체의 제품 정보, 온라인 데이터베이스, 게시 된 값, 등)에서 정보를 수집 원자 작곡 및 대비 일치 세제 시스템 구성 요소에 대 한 볼륨에 관련 된. 이 정보는 중성자 산란 길이 조밀도 (SLDs)를 결정 하 고 따라서 대조 일치 포인트 (CMPs) 솔루션, 품질 데이터 구조 정보 막 단백질에 대 한 관심의 맥락에서의 산 세를 얻는 것이 중요 한 PDC입니다. 막 단백질의 생물 연구에 일반적으로 사용 되는 세제에 대 한 물리적 속성 및 대비 일치 포인트 요약 표 (표 1) 포함.
2. 웹 응용 프로그램 뿌리 덮개를 사용 하 여 중성자 된 결정: 모듈은 분석의 대비 유사 데이터에 대 한⁴⁹ (사용 가능한 온라인⁵⁰ 의 무료). 사용자 설명서에 대 한 링크는 홈 페이지에 있습니다. 웹 사이트에 액세스 하 고 함께 제공 된 설명서를 참조. 그림 1 과 그림 2 두 관련된 예제에 대 한 대비 모듈 입력 및 출력에 대 한 개요를 제공합니다.
   참고: 계산 된 다른 웹사이트 중성자 연구에 대 한 기준과 기술 (NIST) 센터의 국립 연구소에 의해 유지 하는 것과 같은 사용할 수 있습니다. ⁵¹
   1. 왼쪽된 탐색 창에 있는 ' 명암 대비'를 클릭 하 여 대비 모듈을 엽니다. 프로젝트 제목에 대 한 텍스트를 제공 하 고로 두 가지 구성 요소 (예: 세제 머리 그룹 및 꼬리)에 대 한 아래 정보를 입력 ' 소 단위 1'과 ' 소 단위 2'.
   2. '수식' 텍스트 상자에 각 구성 요소에 대 한 분자 수식을 입력 합니다.
      참고: 라디오 버튼 있어요 ' ' 물질 형식 '에서 분자 수식을 입력을 선택 해야 합니다. 또한, 수식에서 문자 'X'를 사용 하 여 쉽게 교환 수소 원자를 나타냅니다. 만약 단백질, RNA, 또는 DNA 시퀀스를 입력할 수 있습니다 해당 'P', 'R', 또는 했다 ' 라디오 버튼 선택. 소 단위 내에서 구성 요소 복사본을 여러 개 있으면 'Nmolecules'에 대 한 값을 적절 하 게 변경할 수 있습니다. 실용적인 예제는 여기 한 꼬리 Nmolecules 2와 같은 입력을 위한 수 있도록 두 개의 동일한 꼬리를 포함 하는 지질 같은 세제에 관한.
   3. '볼륨 (ų)' 아래 상자에 각 구성 요소에 대 한 입방 옹스트롬에서 볼륨을 입력 합니다. 길이 n, V_꼬리 의 알 킬 사슬에 대 한 Tanford의 수식²⁸ 을 사용 하 여 = 27.4 + n * 26.9, 대략적인 꼬리 볼륨을 계산 하거나 제품 정보에서 분자 볼륨을 얻을 제공 또는 값에 게시 문학입니다.
   4. 버퍼 구성 요소에 대 한 세부 정보를 입력 합니다. '수 해산 종 용 매에 ' 변경 드롭다운 메뉴를 사용 하 여 각 버퍼 구성 요소에 대 한 행 추가 또는 제거를. Micelle을 형성 하는 경우 세제, 세제의 임계 micelle 농도 (CMC)에서 별도 버퍼 구성 요소 무료 세제 단위체 포함.
   5. 중성자 대비 계산을 수행 하 고 산란 길이 조밀도 및 대비 일치 포인트 D₂O에서의 어떤 주어진된 비율에 이러한 매개 변수를 결정 하기 위한 공식의 테이블을 제공 하는 결과 페이지를 생성 하려면 ' 제출'을 클릭합니다 버퍼입니다. 구성 요소 CMPs에 특정 관심으로 분산 매개 변수를 검토 합니다. 매치 포인트 (10% D₂O) 이내 비슷합니다 및 무료 micelle 농도 낮은, 경우 평균 CMP 수 사용 대비 일치 세제 기여. 대부분의 경우, 세제 머리 그룹 및 꼬리의 CMP SAN 데이터를 직접 수집 혼자 단백질에서 산란 신호를 난독 처리에서 코어-쉘 형태 요소 생산 10-15% 이상 달라질 것 이다.
3. 세제 머리 그룹와 꼬리 사이의 대비를 평가 합니다. 때 세제 머리 그룹 및 알 킬 체인 꼬리 CMPs 잘 일치 하지 않습니다, 가용성과 중수소 대체 세제의 허용할 수 있습니다 선택 구성 요소를 조작할 수의 길이 밀도 비 산. 대부분의 경우,이 중수소 대체 알 킬 사슬으로 동일한 세제의 설립을 통해 혼합된 micelle을 형성 필요 합니다. 중수소의 알 킬 체인 꼬리에 의해 형성 된 코어의 산란 길이 조밀도를 발생 시킵니다. 원하는 끝점,이 경우에 머리 그룹 쉘 CMP 및 알 킬 체인 코어 CMP 약 값이 동일한.
   1. H-꼬리와 d-꼬리 머리 그룹과 일치 하는 완전 한 대비를 한다 사이 혼합의 적절 한 비율을 결정 함으로써 머리 그룹 포탄의 CMP에 약 같은 것으로 세제 micelle 코어의 CMP를 올립니다. 이 결정에 대 한 전제 조건이 이다 중수소 대체 알 킬 체인 꼬리 CMP의 지식. N-라우릴 β-D-maltoside (DDM)를 상업적으로 사용할 수 있는 대응 모든 알 킬 체인 수소 중수소 (d25-DDM) 교체와 함께 제공 됩니다. 반복 했다 꼬리에 대 한 단계 2.1에에서 명시 된 대비 계산 ' 대신 ' h-꼬리 '.
   2. D-꼬리 머리 그룹 CMP와 대비 일치에 필요한 h-꼬리의 몰 비율을 계산 합니다. 다음 수식을이 결정 해 드립니다.
      CMP_머리 CMP_h-꼬리 = * χ_{h 꼬리} + CMP_d-꼬리 * χ_d-꼬리
      CMP 산란 길이 조밀도 그리고 χ가 세제 머리, h-꼬리, 또는 d-꼬리 구성 요소에 대 한 볼륨 분수입니다. DDM의 버퍼 솔루션에 대 한 44% 중수소 대체 알 킬 체인 d25-DDM으로 전체 세제의 무게 두더지 (43%)의 48.5% D₂O 머리와 꼬리 모두 구성 요소에 대 한 단일 CMP를 생성합니다.
4. 막 단백질에 대 한 중수소 대체의 정도를 고려 하십시오. 단백질에서 충분 한 산란 신호를 측정 하는 단백질에 대 한 CMP 적어도 15% D₂O 솔루션 세제 CMP에서, 측정 조건 이어야 한다. 신호가 % 차이의 제곱으로 증가 한다. 레이블이 없는 단백질의 CMP ~ 42% D₂O 솔루션 (CMP와 유사한 많은 세제 머리 그룹)에서 일반적으로 발생 하는 때문에, 중수소는 단백질의 라벨 필요성 거의 항상 이다. ⁵²

3. 표현 하 고 관심의 막 단백질 정화

1. 파운드 (lysogeny 국물) 매체를 준비 하 고 대장균 성장 (E. 콜라가) 대상 단백질 시퀀스에 대 한 식을 유도할 수 있는 벡터를 은닉 하는 세포.
   1. 최소한의 미디어를 준비 합니다. H₂O 또는 D₂O에서 해산 7.0 g/L (NH₄)₂이렇게₄, 5.25 g/L Na₂HPO₄, 1.6 g/L KH₂포₄, 0.50 g/L diammonium 수소 시트르산, 5.0 g/L 글리세롤, 1.0 mL/L 20 %w / v MgSO ₄·7H₂O, 및 1.0 mL/L 홈 추적 금속 (0.50 g/L CaCl₂·2H₂O, 0.098 g/L CoCl₂, 0.102 g/L CuSO₄, 16.7 g/L FeCl₃·6H₂O, 0.114 g/L MnSO₄· H₂O, 22.3 g/L₂나 EDTA·2H₂O, 그리고 0.112 g/L ZnSO₄· H₂O)입니다. ^{53 , 54}
   2. H₂O 또는 D₂o.를 사용 하 여 적절 한 항생제 재고 솔루션을 준비
   3. H₂O 또는 D₂o.를 사용 하 여이 소 프로필-β-D-1-thiogalactopyranoside 재고 솔루션을 준비
   4. 멸 균 필터에 모든 솔루션 건조, 살 균 컨테이너 병 최고 진공을 사용 하 여 및 0.22 미크론 기 공 크기와 필터 주사기.
2. 대장균 세포 중수소 라는 중간 이전 규모 업 deuterated 단백질의 overexpression에 적응.
   1. Lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배지에서 고립 된 식민지 또는 냉동된 글리세롤 재고에서 셀 파운드 매체의 3 mL 접종 250 RPM에서 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 성장 또는 하룻밤 잠복기 때 문화의 전면에 자라 난을 피하기 위해 온도 30 ° C 또는 그 아래를 감소 시킨다.
      참고: 적응 절차 변화 될 수 있다. ^{55 , 56 , 57}
   2. 일단 파운드 문화 600에서 광학 밀도를 성장 했다 (OD₆₀₀) ~ 1, 1:20 H₂O 최소 매체의 3 mL에 희석 및 OD₆₀₀ ~ 1의 성장. 반복 1시 20분 오 (또는 원하는 D₂O 비율) 50, 75 및 100% D₂를 포함 하는 최소한의 매체를 사용 하 여 희석.
      참고: D로₂O 콘텐츠 증가, 성장률 저하 됩니다. 단백질에서 성장 미디어와 중수소 대체에서 D₂O 비율 사이 관계는 문학에서 보고 되었습니다. ^{58 , 59 , 60}
   3. 계속 성장 deuterated 세포 질량 (그림 3)의 수익률을 높이기 위해 생물에 문화.
      참고: 생물 반응 기 작업에 대 한 단계별 절차는 다른 검토 되었습니다 했습니다. ^{61 , 62 , 63 , 64}
3. 수확 및 막의 추출 및 단백질 정화에 대 한 대장균 세포를 lyse
   1. 30 ~ 45 ~ 6000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 4 ° c.에 분
   2. ~ 30 분 동안 얼음에 버퍼에 몸을 담글 하 여 셀 펠 릿을 부드럽게. 그런 다음, 부드럽게 resuspend 셀 펠 릿 버퍼에 부드럽게 serological 피펫으로 또는 부드러운 ~ 1 g 젖은 셀 질량/10 mL 버퍼의 최종 농도에 2D 로커에 락 pipetting으로.
      참고: 예를 들어 버퍼는 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산), pH 7.5, 200 mM NaCl 보충 protease 억제제 태블릿.
   3. 유출 장난 하는 동안 10000 psi에 고압 균질 화기를 통해 3 개의 패스 resuspended 세포를 lyse.
      참고: 필요한 규모에 따라 다른 세포의 용 해 방법 사용 (예를 들어, 프랑스 언론 또는 쥡니다) 있을 수 있습니다.
   4. 4 ° c.에서 15 분 ~ 4000-5000 x g에서 원심 분리 하 여 펠 릿 세포 파편 이 단계를 반복 하는 상쾌한 명확히.
   5. Ultracentrifuge (30-45 분 ~ 150000 x g)는 녹는 포함 하는 사전 단계에서 막 분수 상쾌한. Ultracentrifugation 후 펠 릿 막 분수를 포함 되어 있습니다.
   6. 큰 Dounce 균질 화기에 막 펠 릿을 resuspend 하 고 ultracentrifugation (3.3.5 단계)에 의해 다시 막 일부를 분리. 느슨하게 바인딩된 단백질 제거를 한 번 이상이 단계를 반복 합니다.
   7. 부드러운 락을 정화에 적합 한 세제를 포함 하는 버퍼에 4 ° C에서 ~ 30 분으로 막을 solubilize. 가용 화 때 정지 구름에서 투명 하 게 명백 하다. Ultracentrifugation (30-45 분 ~ 150000 x g)에 의해 불용 성 물질을 제거 합니다.
      참고: 예를 들어 버퍼 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 20mm 이미 및 4% (w/v) DDM Ni^{2 +} 친화성 크로마토그래피에 의해 정화에 대 한입니다.
4. 이전 protonated 양식 용으로 개발 된 프로토콜에 따라 단백질 정화.
   참고: Naing 외. 태그 hexahistidine M. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl 효소 (d MmIAP)에 대 한 예제 정화 프로토콜을 참조 하십시오. ⁶⁵ 마지막 항복 했다 ~ 1 mg의 5 L deuterated 세포 문화 성장, 모두는 사용 되었다에서 deuterated SAN 실험 (그림 4)에서.
5. 대비 일치에 대 한 "최종 교환 버퍼"으로 순화 된 단백질을 교환 합니다.
   1. 준비의 "마지막 Exchange 버퍼" 대비 일치, 예를 들어,20 mM HEPES, pH 7.5에 대 한 정확한 혼합물을 포함 하는 200 mL, 250 mM NaCl, 그리고 0.05% 49% D₂오 DDM (0.028 %DDM 0.022 %d25-DDM)를 총
   2. 크기 배제 열 equilibrate > 2 열 (CV)의 볼륨 "최종 교환 버퍼" 3.5.1 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템을 사용 하 여에서.
   3. 샘플을 주입 후 열을 실행 하 고 관심사의 단백질에 해당 하는 분수를 분리 합니다.
   4. 원하는 최종 농도 (2-5 mg/mL)에 단백질에 집중.
      참고: ~ 300 μ의 볼륨 SAN 사용 1 mm 원통형 석 영 cuvette을 채우기 위해 필요 합니다.
   5. 배경 빼기 SAN에 대 한 일치 버퍼의 약 수를 보유 합니다.
      참고: 준비 된 버퍼에서 직접 또는 FPLC 실행의 끝에 깨끗 한 차입 분수에서 이상적으로 약 수를 취할 수 있습니다.

4. 빔 시간 및 SAN 데이터 수집을 위한 최종 준비를 하 게

1. 제안을 수락 하 고 사이트 액세스를 승인, 후 할당 된 빔 시간에 앞서 필요한 모든 훈련을 완료 합니다. Prearrival, 웹 기반 현장 방사능, 실험실 및 악기 관련 교육 훈련 포함 됩니다.
   참고: 교육 요구 사항을 처음 사용자를 위한 사전 도착을 지시할 수 있습니다. 자세한 정보는 온라인. ⁶⁶
2. 샘플 및 데이터 수집에 대 한 버퍼를 로드 합니다.
   참고: 생물 학적 작은 각 중성자 뿌리기의 개요 (바이오-SAN) 악기 샘플 환경 영역 그림 5에 표시 됩니다.
   1. 석 영 셀에 샘플 및 버퍼를 로드 합니다. 석 영 셀 악기 과학자 또는 시설에서 사용할 수 있습니다. 대부분 샘플 셀의 좁은 개통을 젤 로드 팁을 사용 합니다.
   2. 빔 셔터 폐쇄 확인, 다음 샘플 환경 영역을 접근 하 고 샘플 교환기에 석 영 셀을 배치. 각 샘플 셀에 샘플 체인저 위치를 기록 합니다.
   3. 지역을 확인 빔 경로가 방해에서 무료로 확인 다음 샘플 환경 영역을 두고 고 빔 셔터를 엽니다.
      참고: 신중 하 게 모든 시설 규칙 및 규정을 준수 하 고 모든 게시물, 순종 하 고, 악기 과학자의 조언. 샘플 하지 빔에서 제거 하 고 다음과 같은 특별 한 조치 없이 빔에 노출 된 후 조작할 수 있습니다. 이러한 절차에 앞서 방사능 제어 기술자 (RCT)와 함께 참조 하십시오.
3. 자동화 된 데이터 컬렉션에 대 한 테이블 스캔을 실행
   1. 사용자 지정 컨트롤 LabVIEW 기반 소프트웨어 분석기 악기 제어 환경 (스파이스)을 통해 악기를 작동 합니다. 중성자 산란 과학자를 제공한 계기 작업에 대 한 지침을 따르십시오. 테이블 스캔 작업 창에 대 한 개요는 그림 6에서 제공 됩니다.
   2. 적절 한 영역에서 필요한 정보를 입력 한 후 테이블 스캔을 실행 하 고 자동된 데이터 수집 프로세스가 시작 됩니다. ' 테이블 스캔 상태 ' 탭을 통해 진행 상황을 모니터링 합니다.

5. 데이터 SAN에서 줄일 2D 이미지 1 D 플롯

1. 기록된 검색 숫자에서 각 샘플 및 버퍼 데이터 파일을 식별 합니다. 각 측정 독특한 스캔 수를 지정 됩니다. 이 정보는 각 해당 샘플 및 버퍼 쌍을 식별 하기 위해 데이터 감소 하는 동안 도움이.
2. MantidPlot 소프트웨어 및 Python 스크립트를 사용 하 여 감소를 위한
   1. 중성자 산란 사용자 계정 세부 사항을 원격 분석 클러스터에 데이터에 액세스할 수와 함께 제공 됩니다. ⁶⁷ 원격 분석 클러스터에 로그인 하 고 커맨드 라인에서 "MantidPlot"를 실행 합니다. 그림 7 과 그림 8 은 이러한 단계를 지원 하기 위해 제공 됩니다.
   2. 중성자 산란 과학자 (이것은 일반적으로 발생 실험 기간 동안);에서 사용자 감소 스크립트를 얻기 이 스크립트는 파이썬 기반 하 고 모든 필요한 교정 및 산란 각도, I(Q)의 기능으로 흩어져 농도의 1 D 플롯으로 2D 산란 이미지를 줄이기 위해 배율 조정 포함 됩니다.
   3. MantidPlot에 제공 된 사용자 감소 스크립트를 열고 적절 한 목록에 해당 스캔 번호 또는 샘플 및 버퍼 쌍에 대 한 id를 배치 합니다.
   4. 4 열 텍스트 파일로 감소 데이터를 생성 하는 스크립트를 실행 (열 순서는 Q, I(Q), I(Q) 오류, Q 오류) 지정된 된 위치에. MantidPlot에서 적절 한 작업 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 하 고 "플롯 오류..." 산란 프로필의 초기 검사에 대 한 선택 합니다.

6. 산란 입자의 구조 매개 변수에 대 한 데이터 분석

1. FTP 파일 전송 보안을 사용 하 여 로컬 컴퓨터에 분석 서버에서 감소 된 데이터 파일을 전송. 이 FileZilla 또는 CyberDuck 같은 소프트웨어를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 추가 지침 및 분석 서버 파일 시스템에 연결에 대 한 세부 정보는 analysis.sns.gov 로그인 페이지에 제공 됩니다.
2. 다운로드는 ATSAS 소프트웨어 스위트^65,68 (전체 ATSAS 제품군). ⁶⁹ 개별 프로그램⁷⁰ 도 있습니다 온라인 SAN 데이터, 즉 결정 구조 매개 변수 및 ab initio 모델 분석에 대 한.
   참고: 많은 옵션 데이터 분석 biomacromolecules의 SAN을 사용할 수 있습니다. ⁴⁵
3. 프리머스⁷¹ 를 사용 하 여 데이터 플롯, 스케일링 및 빼기, 및 Guinier 분석 버퍼.
   1. ATSAS ' SAS 데이터 분석 ' 시작 응용 프로그램 및 부하 감소 데이터 파일에 해당 하는 샘플 및 버퍼 쌍.
      1. 버퍼를 제대로 조절 높은 Q에서 데이터 범위 선택 (Q > 0.5 Å^-1) 두 프로필은 유사 하 고 평면, 고 '작업' 아래에 있는 '규모' 버튼을 클릭 합니다 탭. 배율 인수는이 두 개의 평면 영역 중첩 해야 버퍼에 적용 됩니다. 주의: 확장 샘플에 맞게 버퍼 강도 정당화 하는 그럴듯한 물리적 이유 이어야 한다. 차이가 큰 경우에, 유효한 접근 배경 빼기를 위해 악기 과학자를 참조 하십시오. ^{44 , 45 , 72}
      2. 모든 포인트를 볼 데이터 범위를 증가. '빼기'이 작업을 수행 하려면 클릭 합니다. 범례에서 버퍼 뺀 데이터 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 하 고 후속 분석을 위해이 파일을 저장 합니다. 그림 9 는 '작업' 탭의 사용을 설명합니다.
   2. ' SAS 데이터 분석 ' 응용 프로그램의 '분석' 탭을 사용 하 여 버퍼 뺀 샘플 데이터의 Guinier 분석을 수행 합니다.
      1. 목록에서 적절 한 파일을 선택 해야 하 고 ' 선회 반경 '을 클릭 합니다. 맞는 Guinier 수행 자동화 하려고 'Autorg' 버튼을 클릭 하 여 제공 됩니다.
      2. 낮은 Q 데이터를 모두 포함 하 고는 Qmax까지 하이-Q 포인트를 데리고 하 여 데이터 범위를 좁히는 시작 하는 데 사용 하는 데이터의 범위를 확장 * R_g 도 1.3 아래입니다. 오차의 줄거리를 사용 하 여 데이터 선형 적합된 범위에 있는지 확인 합니다. 맞는 Guinier 대략적인 R_g 와₀ 산란 입자에 대 한 생성 합니다.
      3. 맞는 지역에 작은 조정을 하 고는 적합에 사용 되는 데이터의 범위에이 값의 감도 모니터링 합니다. 그림 10A 에서는 ' 선회 반경 ' 도구를 사용 하 여 보여 줍니다.
4. 구하는 확률 분포 함수 (GNOM에 P(r)). ⁷³ 여기에 생성 된 출력 파일 사용 됩니다 입력으로는 ab initio 모델링 프로세스에 대 한.
   1. 취득 데이터에 잘 맞는 '분석' 탭에서 거리 배포 마법사 시작 품질 모델을 얻기 위해 필수적 이다. 에 대 한 자세한 내용은 정확한 적합을 얻기, 참조 하십시오 푸 트, 그 외 여러분 에 의해 검토⁷⁴
      참고:이 GNOM 프로그램 거리 배포 마법사 넘어 적합에 대 한 추가 정보를 제공 합니다. 그림 10B ' 거리 배포 ' 도구의 적절 한 사용 및 고 그림 11 발생 일반적인 오류 중 일부를 보여 줍니다.
   2. Dmax, 분자 내에서 원자 최대 거리를 결정 합니다.
      1. Rmax를 상자를 선택 취소 하면 Dmax에 대 한 값을 추정 = 0 및 Dmax 큰 값을 입력 (150 Å, 예를 들면). P(r)의 작의에 있는 첫 번째 x 절편 생성이 예상 합니다.
      2. 증분 변경 Dmax 값이 사용 되는 데이터의 범위 또는 GNOM 데이터와 결과 P(r) 곡선에 맞게 최적화 하는 맞춤에 사용 하는 포인트의 수를.
   3. 계속 GNOM 맞춤을 수정 하 고 후속 ab initio 에 대 한 좋은 맞는 매개 변수 모델링 단계 GNOM 출력 파일을 저장 합니다.
5. CRYSON 프로그램을 사용 하 여 높은 해상도 PDB 모델에서 프로필 SAN 시뮬레이션 합니다. ⁷⁵
   1. '0' 옵션을 선택 하 고 프로그램을 엽니다. 팝업 파일 브라우저에 PDB 파일 이름을 선택 합니다. 적절 한 대비 매개 변수를 달성 하는 용 매에 체인 deuteration 분수와 D₂O의 일부분을 지정을 제외 하 고 기본 설정을 적용 하려면 enter 키를 누릅니다.
   2. 'Y'를 입력 하 고 팝업 파일 브라우저에서 데이터 파일을 선택 하 여 실험 데이터 집합을 모델에 맞게. 나머지 기본값을 적용 하 고 출력 파일의 PDB 파일 위치에 기록 됩니다. '.Fit' 파일에는 고해상도 3D 모델에서 예측된 산란 프로 파일에 대 한 정보가 포함 되어 있습니다.

7. Ab 론 적 모델에서 생성 된 데이터 SAN.

참고: DAMMIF⁷⁶ 그리고⁷⁷ ATSAS 소프트웨어 제품군 내에서 DAMMIN GNOM 출력, P(r) 데이터, 또는 확률에 대 한 정보를 포함 하는 시뮬레이션 된 어 닐 링 프로세스를 사용 하 여 더미 원자 모델 (댐)를 재구성 하는 데 사용은 또는 분산 입자 내의 원자 거리의 주파수입니다. 일괄 처리 모드에서 또는 ATSAS 온라인 웹 서버에서이 프로그램을 실행할 수 있습니다.

1. ' SAS 데이터 분석 ', '분석' 탭에서 'Dammif' 버튼에서 프리머스 모양 마법사를 시작 하 고 수동으로 다양 한 매개 변수를 사용 하 여. 마법사에 대 한 입력은 그림 12에 나와 있습니다.
   1. 맞는 (단계 6.3.2)에서 Guinier 범위를 정의 하 고 탐색 단추를 사용 하 여 다음 단계를 수행 하십시오. P(r) 줄거리 (단계 6.4)에서 맞춤된 값을 정의 하 고 단계를 수행 하십시오.
   2. ab initio 모델링 프로세스에 대 한 매개 변수를 제공 합니다. 모델 출력 파일 (예: SANSEnvelope)에 대 한 접두사를 입력, 선택 중 하나 '빨리' 또는 '느린' 모드 모델링, 모델 (17 통계적 의미에 대 한 권장)의 수에 대 한 값을 입력, 입자 대칭에 대 한 사용 가능한 옵션에서 선택 anisometry, 그리고 각도 비율 (알려진 경우). 상자 DAMAVER 평균 모델을 확인 하 고 DAMMIN와 최종 모델 수정 확인 하십시오.
   3. '커밋' 버튼을 사용 하 여 프로세스를 시작 합니다. 프로세스가 완료 되 면 확인 하 고 작업 디렉터리를 저장 합니다.
      참고: 단일에 대 한 일반적인 모델링 과정, 작은 단백질 일반적인 개인용 컴퓨터와 함께 몇 시간을 최대 걸릴 수 있습니다. 파일 저장할 때까지 임시 디렉터리에 저장 됩니다.
2. 오버레이 및 최종 입력 해 관련 고해상도 모델 ATSAS에서 SUPCOMB를 사용 하 여 봉투에 산 세. 작업 디렉터리에 SAN 봉투에 맞게 고해상도 PDB 모델의 복사본을 배치 합니다. 명령줄에서 SUPCOMB를 실행 먼저 나열 된 서식 파일 구조와 두 개의 인수로 PDB 파일을 사용 하 여: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
   참고: 나열 된 두 번째 파일은 중첩 서식 파일 구조에 대 한 최종 고 새 좌표에 추가 "r" 새 파일로 다시 작성 됩니다.
3. PyMOL (pymol.org), 3 차원 분자 그래픽 보기 프로그램을 사용 하 여 ab initio 모델 결과 시각화 한다. 그림 13 PyMOL 작업의 개요를 제공합니다.
   참고: 솔루션에서 생체에서 작은 각도 분산 데이터 구조 모델링에 대 한 게시 지침을 확인 하 고 있습니다. ⁷⁸
   1. PyMOL 응용 프로그램을 시작 하 고 봉투와 SUPCOMB 정렬 고해상도 구조 없이 3d를 볼 수에 해당 하는.pdb 파일을 엽니다.
   2. 표면으로이 모델을 대표 하 여 SAN 봉투를 시각화 합니다. 클릭 s ' 모델 및 선택 버튼 ' 쇼:로: 표면 '.
   3. 만화로이 모델을 대표 하 여 고해상도 단백질 등뼈 구조를 시각화. 선택 s ' 선택한이 모델 옆 버튼 ' 쇼:로: 만화 '. 'C' 버튼을 선택 하 여 무지개에서 N-에 C-말단으로 체인을 표시 하 고 '에 의해 체인: Chainbows'.
   4. 선명도 대 한 표면 표시의 투명도 수정 합니다. '설정' 메뉴 모음에서 선택 ' 투명성» 표면» 40% '.
   5. 배경 흰색과 불투명 하지 않은 확인 합니다. '표시' 메뉴 모음에서 선택 ' 배경»' 고 '불투명'이 옵션을 '화이트' 배경에 대 한이 색 표시 선택을 취소 하려면 선택 합니다.
      참고: 추가 작업과 PyMOL 사용 PyMolWiki.org에서 찾을 수 있습니다.

결과

빔 시간과 악기 제안 명확 하 게 제안 된 실험의 유효한 평가 될 수 있도록 검토 위원회에 필요한 모든 정보를 전달 한다. NSS와 통신 매우 경험이 사용자에 대 한 제안 했다. 초기 타당성 및 가이드 제안 제출 타당성, 안전 및 높은-영향 과학에 대 한 잠재력을 강조 하는 NSS 평가할 수 있습니다. 제안에서 제공 하는 정보는 배경 정보 및 연구;의 중요성에 대 한 컨텍스트 포함 되어야 합니다. 주어질 것으로 예상 되는 지식 및 과학;의 관련된 분야에서 현재 이해에 미치는이 설명 작업, 샘플, 방법, 및 절차를 사용할 것입니다; 그리고, 해당 되는 경우 관련 간행물 및 결과 포함 하 여 시설에서 팀의 이전 생산성. 제안 템플릿 및 제안, 준비 사항 등 유용한 자원, 중성자 과학 사용자 포털 (neutrons.ornl.gov/users)를 통해 사용자에 게 사용할 수 있습니다.

토론

구조 생물학 연구 솔루션 분산 솔루션에서 생체에서 생화학 및 구조 정보 (예: 전체 크기 및 모양)를 같은 보완 구조 기술을 활용 합니다. SAN은 낮은 해상도 막 단백질의 구조, 현대 구조 생물학 및 생화학의 핵심 초점을 결정 하기 위한 특히 매력적인 기술입니다. SAN의 순화 된 단백질 결정학 실험 (1 mg/샘플)의 비교를 요구 한다. 고 순도 deuterated 세제 관련 막 단백질 연구의 최근 확장 상업적인 가용성은 액세스할 수 있습니다이 수소/중수소 막 단백질-세제 단지의 실험 SAN에 대 한 콘텐츠를 조작 하는 수단 직접 기록 단백질 신호를 허용 합니다. 성공 하면 ab initio 모델 분자 봉투는 단지 몇 시간 동안 수집 된 데이터에서 계산할 수 있습니다. 따라서, 막 단백질 생화학, biophysicists, 및 구조상 생물학 쉽게 활용할 수 탐 낼된 초기 3D 모델의 솔루션에서 막 단백질, 파트너 또는 기질, 그리고 얻은 모델 바인딩 복잡 한 구조를 얻기 위해 SAN SAN에 의해 회절 데이터...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Amicon Ultra MWCO 50KDa 농축기	EMD Millipore	UFC905096	실험기구
구연산 암모늄 이염기	성 Fisher Scientific	A663	중간 성분
황산 암모늄	EMD Millipore	2150	중간 성분
Bioflo 310 생물 반응기 시스템	Eppendorf	M1287-2110	장비
염화칼슘 이수화물	Acros	423525000	중간 성분
Carbenicillin	IBI Scientific	IB02025	항생제
Chloramphenicol	EMD Millipore	3130	항생제
코발트 (II) 염화	Acros	AC21413-0050	중간 구성
요소 구리 (II) 황산	Acros	AC19771-1000	중간 구성 요소
중수소산화물	시그마-알드리치	756822	중간 성분
드라이라이트 가스 청정기	WA Hammond Drierite Co., Ltd.	27068
EDTA, 디소듐, 이수화물	EMD Millipore	4010	중간 구성 요소
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	장비
및 Auml; kta 퓨리파이어 UPC100	GE 헬스케어		장비
글리세롤	Sigma-Aldrich	G5516	중간 구성
요소 HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 컬럼	GE Healthcare
이미다졸	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
염화철(III) 육수화물	MP 생화학 ICN19404590		중간 성분
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425-2
황산마그네슘 헵타하이드레이트	VWR	97062-134	중간 성분
망간(II) 황산염 일수화물	Acros	AC20590-5000	중간 구성 요소
MaxQ 6000 인큐베이팅/냉장 쉐이커	Thermo Scientific	SHKE6000-7	설비
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310A
인산칼륨 monobasic	VWR	97062-346	중간 구성 요소
RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	장비
SIGMAFAST 프로테아제 억제제 칵테일 정제, EDTA 무료	시그마-알드리치	S8830
염화나트륨	시그마-알드리치	S3014
수산화나트륨	그마-알드리치	795429
인산나트륨 이염기성	시그마-알드리치	S7907	중간 구성 요소
0.2µ의 멸균 25mm 주사기 필터; m PES 멤브레인	VWR	28145-501	labware
0.2µ가 있는 멸균 일회용 병 상단 필터; m PES 멤브레인	Thermo Scientific	596-4520	실험기구
Superdex 200 10/300 GL	GE 헬스케어
Superose-12 10/300 GL 컬럼	GE 헬스케어
Ultrospec 10 세포 밀도	GE Healthcare	80211630	장비
황산 아연 수화물	Acros	AC38980-2500	중간 구성 요소