생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화

요약

여기에 우리가 그람 음성의 대장균 (대장균)를 생산 하는 프로토콜을 현재 spheroplasts 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 명확 하 게 시각화 하 고 빠르게 특성 protoplasts 펩 티 드-박테리아의 상호 막 지역화 및 펩 티 드 translocating를 정의 하는 체계적인 방법을 제공 합니다.

초록

박테리아 내에서 펩 티 드 지역화 패턴을 평가 하는 방법으로 confocal 현미경 검사 법의 사용은 일반적으로 기존의 가벼운 현미경의 해결책 한계에 의해 억제 됩니다. 선물이 작은 막대 모양의 그람 음성의 대장균 (대장균) 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 변환 하는 프로토콜 특정된 현미경에 대 한 해상도 쉽게 향상 될 수 없습니다, 더 큰, 쉽게 군데 둥근 모양으로 spheroplasts 또는 protoplasts 라고합니다. 이 변환 관찰자를 펩 티 드 (즉, 막 지역화) 세균 막으로 자신을 결 사 또는 교차 하는 셀 (예: translocating) 입력을 막 신속 하 고 명확 하 게 결정할 수 있습니다. 이 방법을 우리는 또한 막 지역화 또는 translocating으로 펩 티 드를 특성화 하는 체계적인 방법을 제시. 이 메서드를 사용 하 여 막 활성 펩 티 드 및 세균성 긴장의 다양 한 수, 있지만 우리 Buforin II P11A의 상호 작용을 관찰 하 여이 프로토콜의 유틸리티 설명 (BF2 P11A), 대장균 과 항균 성 펩타이드 (AMP), spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts입니다.

서론

항균 성 펩 티 드 (암페어)는 기존의 항생제^1,2,3,,45대 안으로 그들의 잠재적인 사용 주의 얻고 있다. 앰프는 여 세포 막에 걸쳐 translocating 핵 산 또는 세포내 구성 요소와 상호 작용 하는 셀 내용을⁶의 누설을 일으키는 막 permeabilizing 여 박테리아를 죽 일. 항생제로 그들의 사용 이외에 앰프를 translocating 수 있습니다 적응 시킬 약물 전달 응용 프로그램에 대 한 그들은 불 침투성 세포 막^7,8교차 비 비정상적으로 수 있기 때문에. 우리, 따라서, 약물 디자인에 그들의 사용을 위한 기초를 누워 행동의 근본적인 앰프 메커니즘을 이해 하고자 합니다.

지역화 액션^9,....

프로토콜

1. 솔루션 준비

참고: 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts를 각각 일으키기 위하여 1.1-1.9, 1.8-1.11 단계에 설명 된 솔루션을 준비 합니다.

1. 1 준비 M Tris-Cl, pH 7.8 10.34 g Tris HCl와 dH₂O 125 mL 플라스 크에 50 mL에 트리 스 오의 4.17 g을 용 해 하 여. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
2. 0.10 g MgCl₂ (95.2 g/mol) 및 25 mL dH₂O 125 mL 플라스 크에 11.98 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 솔루션 (20 m m MgCl₂, 0.7 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 준비 합니다. 500 µ L을 추가 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 50 mL를 볼륨을 조정. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
3. 0.05 g MgCl₂ (95.....

결과

박테리아를 확대 하 고 구형, 여 우리가 쉽게 펩 티 드 세균 막에 지역화 또는 세균 막에 걸쳐 이동 쉽게 구분할 수 있습니다. 기존의 가벼운 현미경의 해상도 한계 게 도전 막에 지역화 신호 겹칠 나타납니다 때문에 막 또는 정상적인 박테리아 세포내 공간에서 펩 티 드 신호 발생 여부를 구별 하는 세포내 공간 (그림 3A)입니다. 반면, 확대의 크기 spheroplasts (2-5 µ m) 및 protoplasts (2-3 µ m)는 일반적으로 단지 1 개의 µ m 직경에서 정상적인 박테리아에 비해 막 마커를 쉽게 하는 세포내 공간 사이 명확 해상도 결과 펩 티 드 지역화 (그림 3B)를 구별 합니다.

여기, spheroplasts 및 protoplasts 앰.......

토론

여기에 제시 된 프로토콜 연구자를 더 빠르게 세균 이미지의 더 큰 샘플 크기 확대, 구형 박테리아, 오리엔트, 찾아서 이미지를 훨씬 더 쉽게 하기 때문에 가능 하 게. 이 향상 된 기능은 데이터를 수집 하는 여러 가지 면에서 유용 합니다. 첫째, 펩 티 드 지역화 패턴의 체계적인 정량 분석을 수 있습니다. 동안 질적 동향은 이미지의 작은 세트에서 설명 될 수 있다, 높은-품질의 이미지의 큰 샘플 집합에 대해서만 공개 더 nuanced 지역화 패턴, 동향 펩 티 드 대 translocates 셀의 비율을 localizes 같은 막입니다. 또한, 더 나은 해결 수 막 지역화에서 내부 형광 쉽게 시간 과정 연구를 얼마나 빨리 펩 티 드와 상호 작용 뿐만 아니라 세균성 세포 지역화 패턴 시간이 지남에 변경 하는 방법으로 평가 수행할 수 있습니다. 향상 된 해상도 또한 작은 박테리아 가능 하지 않은 펩 티 드 지역화 추세를 고려 하는 연구를 수 있습니다. 예를 들어 일부 우리의 관찰 된 spheroplasts와 protoplasts, 펩.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트리즈마 하이드로클로라이드 (트리스 HCl)	시그마	T3253
트리즈마 베이스 (트리스 OH)	시그마	T1503
염화마그네슘	시그마	M8266
수크로오스	시그마	S7903
라이소자임	시그마	L6876
데옥시리보뉴클레아제 I	시그마	D4527
에틸렌디아민테트라아세트산	시그마	106361	원래 프로토콜 개발에 사용된 시그마 106361; 106361 ED2SS를 대체품으로 사용하여 단종
세팔렉신 수화물	시그마	C4895
암피실린	피셔 사이언티픽	BP1760
BBL 트립티카제 콩 육수	피셔 사이언	B11768
BF2 P11A FITC	네오사이언티픽	맞춤 주문
di-8-ANEPPS	Biotium	61012
DMSO	Sigma	34869	원래 프로토콜 개발에 Sigma D8779를 사용했습니다. D8779는 34869를 대체품으로 단종
. Maleic acid	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm 주사기 필터 w/ 0.2 μ m HT Tuffryn Membrane	Pall Corporation	4192
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	Leica Microsystems	TCS SP5 II	이미지 획득용
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence	Leica Microsystems		이미지 처리용

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