생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화

요약

여기에 우리가 그람 음성의 대장균 (대장균)를 생산 하는 프로토콜을 현재 spheroplasts 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 명확 하 게 시각화 하 고 빠르게 특성 protoplasts 펩 티 드-박테리아의 상호 막 지역화 및 펩 티 드 translocating를 정의 하는 체계적인 방법을 제공 합니다.

초록

박테리아 내에서 펩 티 드 지역화 패턴을 평가 하는 방법으로 confocal 현미경 검사 법의 사용은 일반적으로 기존의 가벼운 현미경의 해결책 한계에 의해 억제 됩니다. 선물이 작은 막대 모양의 그람 음성의 대장균 (대장균) 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 변환 하는 프로토콜 특정된 현미경에 대 한 해상도 쉽게 향상 될 수 없습니다, 더 큰, 쉽게 군데 둥근 모양으로 spheroplasts 또는 protoplasts 라고합니다. 이 변환 관찰자를 펩 티 드 (즉, 막 지역화) 세균 막으로 자신을 결 사 또는 교차 하는 셀 (예: translocating) 입력을 막 신속 하 고 명확 하 게 결정할 수 있습니다. 이 방법을 우리는 또한 막 지역화 또는 translocating으로 펩 티 드를 특성화 하는 체계적인 방법을 제시. 이 메서드를 사용 하 여 막 활성 펩 티 드 및 세균성 긴장의 다양 한 수, 있지만 우리 Buforin II P11A의 상호 작용을 관찰 하 여이 프로토콜의 유틸리티 설명 (BF2 P11A), 대장균 과 항균 성 펩타이드 (AMP), spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts입니다.

서론

항균 성 펩 티 드 (암페어)는 기존의 항생제^1,2,3,,45대 안으로 그들의 잠재적인 사용 주의 얻고 있다. 앰프는 여 세포 막에 걸쳐 translocating 핵 산 또는 세포내 구성 요소와 상호 작용 하는 셀 내용을⁶의 누설을 일으키는 막 permeabilizing 여 박테리아를 죽 일. 항생제로 그들의 사용 이외에 앰프를 translocating 수 있습니다 적응 시킬 약물 전달 응용 프로그램에 대 한 그들은 불 침투성 세포 막^7,8교차 비 비정상적으로 수 있기 때문에. 우리, 따라서, 약물 디자인에 그들의 사용을 위한 기초를 누워 행동의 근본적인 앰프 메커니즘을 이해 하고자 합니다.

지역화 액션^9,10,,1112, 의 자신의 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하는 세균성 세포에 붙일 라벨의 패턴을 평가 하는 방법을 제공 하는 confocal 현미경 검사 법 ^{13 , 14}. 박테리아의 막의 라벨, 하나 붙일 레이블된 펩 티 드 막에 세균성 세포의 세포내 공간 localizes 경우 확인할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 기존의 가벼운 현미경의 해상도 한계 및 슬라이드¹⁵에 박테리아의 변수 방향 도전 이미징 할 수 있는 박테리아의 작은 크기와 막대 모양에 의해 제한 됩니다.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 붙일 레이블된 펩 티 드 지역화 패턴의 향상 된 시각화 수 있도록 제시 방법의 목표가입니다. 시각화는 작고, 얇은, 막대 모양의 그람 음성의 대장균 (대장균) 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium)를 설정 하 여 향상 된 확대, 둥근 형태로 박테리아 라고도 (그람 음성 긴장)에 대 한 spheroplasts 그리고 protoplasts (그람 양성 긴장)에 대 한^{16,17,18,19,,2021}. Spheroplasts와 protoplasts는 그들의 증가 크기와 그 영상에 대 한 관련성이 없는 슬라이드에 박테리아의 방향을 만드는 그들의 대칭 모양 때문에 이미지 하기 쉽습니다. 또한, 우리는 양적 앰프 중 막 지역화 또는 translocating로 성격을 나타내기 위하여 confocal 현미경 검사 법 데이터를 분석 하는 체계적인 접근 방법을 제시. 이러한 방법을 적용 쉽게 구별에 놓여있는지 펩 티 드 지역화 패턴 표시 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 다양 한 앰프, 세포 관통 펩 티 드를 포함 하 여 다른 막-활성 에이전트의 지역화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

뚜렷한이 기술의 장점은 그것 셀이¹⁵, 일반적으로 식별 하는 데 사용 하는 다른 형광 분석에 반대를 공개 수 있습니다 단일 세포 수준에서의 행동의 메커니즘에 통찰력을 제공 하나는 대량 견적^{9,22,23,,2425}만 제공 하는 앰프의 행동의 메커니즘. Spheroplasts 및 protoplasts 앰프 셀 항목을 평가 사용 때문에 지질 소포²⁴등 셀 항목을 평가 하기 위해 사용 되는 다른 모델 보다 더 순수 관련¹⁵ 특정 유용한²⁶ 입니다.

프로토콜

1. 솔루션 준비

참고: 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts를 각각 일으키기 위하여 1.1-1.9, 1.8-1.11 단계에 설명 된 솔루션을 준비 합니다.

1. 1 준비 M Tris-Cl, pH 7.8 10.34 g Tris HCl와 dH₂O 125 mL 플라스 크에 50 mL에 트리 스 오의 4.17 g을 용 해 하 여. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
2. 0.10 g MgCl₂ (95.2 g/mol) 및 25 mL dH₂O 125 mL 플라스 크에 11.98 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 솔루션 (20 m m MgCl₂, 0.7 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 준비 합니다. 500 µ L을 추가 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 50 mL를 볼륨을 조정. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
3. 0.05 g MgCl₂ (95.2 g/mol) 및 25 mL dH₂125 mL 플라스 크에 O 13.69 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 솔루션 B (10 m m MgCl₂, 0.8 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 준비 합니다. 500 µ L을 추가 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 50 mL를 볼륨을 조정. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
4. 50 mL dH₂125 mL 플라스 크에 O 13.69 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 0.8 M 자당을 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
5. 5 mg/mL deoxyribonuclease 준비 나 (DNase 나) 0.015 g DNase를 용 해 하 여 dH₂O 50 mL 플라스 크에 3 mL에 나. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독. Aliquot 솔루션 microfuge 관으로-20 ° c.에 게
6. 0.125 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 준비, EDTA disodium 0.698 g을 용 해 하 여 pH 8.0으로 15 mL dH₂O 125 mL 플라스 크에 (372.2 g/mol)를 탈수. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
7. 세 팔 렉 신 하이드 레이트 (365.404 g/mol) dH₂O 125 mL 플라스 크에 50 ml에서의 0.03 g을 용 해 하 여 600 µ g/mL 세 팔 렉 신을 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 및 4 ° c.에 원뿔 튜브에 저장
8. 5 mg/mL lysozyme 0.015 g lysozyme dH₂O 50 mL 플라스 크에 3 mL에 용 해 하 여 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독. Aliquot 솔루션 microfuge 관으로-20 ° c.에 게
9. DH₂O 2 L 플라스 크에 1 리터에 TSB의 30 g을 용 해 하 여 3 %w / v Trypticase 간장 국물 (TSB)를 준비 합니다. 약 수 25 mL 100 mL TSB 각각 대장균 spheroplasts 또는 B. megaterium protoplasts, 의 준비에 사용할 수를 포함 하는 플라스 크에 솔루션. 오토 클레이 브 소독 액체 매체를 플라스 크입니다. 살 균 TSB 실내 온도 또는 4 ° C에서 저장 될 수 있다
10. 34.23 g 자당 (342.3 g/mol), 0.46 g maleic 산 (116.07 g/mol), 그리고 0.38 g MgCl₂ (95.21 g/mol) dH₂O 250 mL 플라스 크에 100 mL에 용 해 하 여 솔루션 C (1 M 자당, 0.04 M maleate, 0.04 M MgCl₂, pH 6.5)를 준비 합니다. PH 6.5 조정 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
11. 100 mL 3 %w / v TSB와 100 mL 해결책 C 1 리터 유리병에 혼합 하 여 200 mL 원생 동물 매체를 준비 합니다. 오토 클레이 브 소독 솔루션을 상 온에서 저장.

2입니다. 준비의 숙박 문화

참고: 섹션 2-4 적절 한 무 균 기술을 사용 하 여 수행 합니다. 원하는 경우, 세균성 긴장을 잠재적인 오염 줄이기 위해 항생제 내성에 대 한 플라스 미드를 포함할 수 있습니다. 항생제 저항 긴장을 사용 하 여, 단계 2.1, 3.1-3.2, 그리고 4.1-4.4에에서 필요한 항생제를 추가 합니다.

1. 살 균 피 펫 팁을 사용 하 고 3 %w / v TSB의 2-3 mL를 포함 하는 14 mL 문화 관으로 배치 박테리아에의 한 식민지를 선택 하 여 숙박 문화를 준비 합니다. 16-21 h를 흔들어 동안 37 ° C에서 품 어.

3. 그람 음성의 대장균 Spheroplasts의 준비

1. 250 mL 플라스 크에 25 mL 볼륨 3 %w / v TSB의 숙박 문화 1: 100 희석 하 고 37 ° C에서 세균성 솔루션 솔루션 600 0.5-0.8의 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 약 2.5 h를 흔들어 동안 품 어 nm. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 합니다.
2. 250 mL 플라스 크에 희석이 문화 1:10 3 %w / v TSB의 30 ml에서 및 2.5 h 60 µ g/mL 세 팔 렉 신 (347.4 g/mol) 단일 셀 필 라 멘 트의 약 생산의 존재를 흔들어 동안 37 ° C에서 품 어 50-150 µ m 길이에서 는 가벼운 현미경 (그림 1B)를 사용 하 여 1000 X 배율에서 관찰.
3. 1500 x g, 4 분 Decant 4 ° C에서 세균성 솔루션 centrifuging 여는 필 라 멘 트를 수확 하 고 상쾌한, 펠 릿 예약 취소.
4. 부드럽게 되는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하는 0.8 M 자당의 1 mL을 추가 하 여는 필 라 멘 트를 씻어. 1 분 동안 incubate 고은 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 삭제.
5. 150 µ L 1의 추가 M Tris-Cl (pH 7.8), lysozyme 5 mg/mL의 120 µ L, 5 mg/mL DNase의 30 µ L, 그리고 펠 릿을 주문 하 고 10 분 동안 실내 온도에 솔루션을 품 어는 그들의 각각에서 0.125 M EDTA의 120 µ L.
6. 추가 솔루션의 1 mL 점차적으로 1 분 이상 3.5 동안 부드럽게 손으로 솔루션을 소용돌이 micropipette를 사용 하 여 준비 하는 솔루션을 합니다. 실 온에서 4 분에 대 한 솔루션을 품 어.
7. 두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 4 ° C 솔루션 B의 7 mL를 넣어. 이 두 튜브의 각 3.6에서 준비 하는 솔루션의 동일 금액을 추가 합니다. 1500 x g, 4 분 4 ° C에서 솔루션 원심
8. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 제거 1-의 2 개 mL 상쾌한 제외 하 고 모두는 펠 렛을 방해 하지 않고. 부드럽게 P1000 micropipette를 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 펠 릿을 resuspend. 시각적으로 확인 spheroplasts 형성 1000 X 확대 가벼운 현미경 (그림 1C)을 사용 하 여 샘플을 관찰 하 여.
9. -20 ° C에서 1 주까지 또는 그들은 3 freeze-thaw 주기를 통해 갈 때까지 spheroplasts를 저장 합니다.

4. 그람 양성 B. megaterium Protoplasts의 준비

1. 250 mL 플라스 크에 희석 3 %w / v TSB의 100 mL에서 하룻밤 문화 1:1,000 하 고 37 ° C에서 세균성 솔루션 솔루션 0.9-의 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 약 4.5 h 흔들어 동안 품 어 1.0 600 nm. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 합니다.
2. 2 50 mL 원뿔 튜브와 2000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기에 액체 문화를 부 어.
3. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 두 원뿔 튜브에서 상쾌한을 삭제 합니다. 2.5 mL 원생 동물 매체에 각 펠 릿을 resuspend 하 고 resuspended 솔루션을 결합 하 여 단일 원뿔 관으로. 125 mL 플라스 크에 결합 된 resuspended 솔루션 플라스틱
4. 5 mg/mL lysozyme의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C에서 1 시간 흔들어 동안 품 어.
5. 1000 배 확대 가벼운 현미경, 부정, 분야 (그림 2) 대신 부 봉으로 표시 되는 박테리아와 같은 지적을 사용 하 여 아래 protoplasts의 증가 모니터링 합니다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 솔루션 15 mL 원뿔 튜브와 2000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 전송.
6. 가만히 따르다는 상쾌한 고 다시 5 mL 원생 동물 미디어에 펠 릿을 중단. -20 ° C에서 1 주까지 또는 그들은 3 freeze-thaw 주기를 통해 갈 때까지 protoplasts를 저장 합니다.

5. 펩타이드 솔루션 및 이미징 막 염료의 준비

1. 펩 티 드 솔루션
   1. 알루미늄 호 일에 싸여 microfuge 관, FITC BF2 P11A 800 µ L dH₂오 사용 펩 티 드 단백질 농도 측정을 수행 하려면 적어도 하나의 트립토판 잔류물을 포함 표시의 2 밀리 그램을 디졸브.
   2. 280에서 펩 티 드 용액의 흡 광도 측정 하는 spectrophotometrically, 3 중에 nm. 트립토판 (5,700/Mcm)에 대 한 어 금 니 소멸 계수를 사용 하 여 펩 티 드 농도 계산 합니다.
   3. DH-20 ° C에서 microfuge 관에서 100-200 µ M. 저장소의 최종 농도에₂O 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸여 있는 펩 티 드 농도 희석.
2. 막 염료
   1. Microfuge 관에서 DMSO의 843.3 µ L에 디-8-ANEPPS의 5 mg를 용 해 하 여 디-8-ANEPPS (592.9 g/mol)의 10 m m 재고를 준비 합니다. 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서 4 ° C에서 저장 합니다.
   2. Microfuge 관에서 10 m m 디-8-ANEPPS의 3 µ L 997 µ L DMSO를 추가 하 여 0.03 m m 디-8-ANEPPS의 1 mL를 준비 합니다. 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서 4 ° C에서 microfuge 관에 저장 합니다.

6. 대장균 Spheroplasts 및 B. megaterium Protoplasts를 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법의 시각화

1. Spheroplasts 또는 protoplasts 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 슬라이드에 5 µ L 플라스틱 FITC 앰프 (100-200 µ M) 슬라이드에 표시 된의 2 µ L을 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 3 분 동안 품 어.
2. 슬라이드에는 막 염료 디-8-ANEPPS (0.03 m m)의 1 µ L을 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 3 분 동안 품 어. 유리 coverslip로 커버 하 고 매니큐어와 함께 인감.
3. Confocal 현미경 및 아르곤 레이저를 켭니다. 20% 전원 출력을 20% 전송 아르곤 레이저를 조정 합니다.
4. 각각 499-532 nm와 FITC 표시 된 펩 티 드 방출 채널 및 디-8-ANEPPS-표시 막 염료 방출 채널, 670-745 nm의 방출 파장 범위를 설정 합니다.
5. 이미지 protoplasts 또는 spheroplasts (그림 1 및 그림 2) 63 X 목표. 8 비트를 이미징 소프트웨어를 사용 하 여, 512 x 512 복합 z-스택 이미지 구성 0.5 µ m 조각 spheroplast 또는 원생 동물의 전체.
   참고: 이미징 spheroplasts 및 protoplasts 동안 피가 통해 방출 감소를 신중 하 게 고려 걸릴. 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.

7입니다. 앰프 지역화의 특성

1. 이미징 소프트웨어에 복합 z-스택 이미지를 엽니다. Spheroplast 또는 원생 동물의 센터-대부분 슬라이스를 찾아서 한 원형 지역의 관심 (ROI)을 배치 (직경에서 0.3 μ m) 막 (ROI 1), spheroplast 또는 원생 동물 (ROI 2)의 중심에와 spheroplast 또는 측정 하는 원생 동물에 배경 형광 (ROI 3) (그림 5) 포화 픽셀의 포함을 하지 마십시오. 이미징 소프트웨어에 의해 각 ROI의 형광 강도 계산할 수 있습니다.
   참고: 경우에 펩 티 드를 막의 전체를 지역화 하지 않습니다, 그릴 때 투자 수익 1 펩 티 드 지역화는 막의 지역에.
2. 다음 방정식을 사용 하 여 막 펩 티 드 형광 강도 세포내 펩 티 드 형광 강도의 비율 결정.
   
   참고: 투자 수익 3에서 형광 강도에서 뺍니다 2 투자 수익 및 투자 수익 1 형광 강렬 배경 형광에 대 한 계정을 위해.

결과

박테리아를 확대 하 고 구형, 여 우리가 쉽게 펩 티 드 세균 막에 지역화 또는 세균 막에 걸쳐 이동 쉽게 구분할 수 있습니다. 기존의 가벼운 현미경의 해상도 한계 게 도전 막에 지역화 신호 겹칠 나타납니다 때문에 막 또는 정상적인 박테리아 세포내 공간에서 펩 티 드 신호 발생 여부를 구별 하는 세포내 공간 (그림 3A)입니다. 반면, 확대의 크기 spheroplasts (2-5 µ m) 및 protoplasts (2-3 µ m)는 일반적으로 단지 1 개의 µ m 직경에서 정상적인 박테리아에 비해 막 마커를 쉽게 하는 세포내 공간 사이 명확 해상도 결과 펩 티 드 지역화 (그림 3B)를 구별 합니다.

여기, spheroplasts 및 protoplasts 앰...

토론

여기에 제시 된 프로토콜 연구자를 더 빠르게 세균 이미지의 더 큰 샘플 크기 확대, 구형 박테리아, 오리엔트, 찾아서 이미지를 훨씬 더 쉽게 하기 때문에 가능 하 게. 이 향상 된 기능은 데이터를 수집 하는 여러 가지 면에서 유용 합니다. 첫째, 펩 티 드 지역화 패턴의 체계적인 정량 분석을 수 있습니다. 동안 질적 동향은 이미지의 작은 세트에서 설명 될 수 있다, 높은-품질의 이미지의 큰 샘플 집합에 대해서만 공개 더 nuanced 지역화 패턴, 동향 펩 티 드 대 translocates 셀의 비율을 localizes 같은 막입니다. 또한, 더 나은 해결 수 막 지역화에서 내부 형광 쉽게 시간 과정 연구를 얼마나 빨리 펩 티 드와 상호 작용 뿐만 아니라 세균성 세포 지역화 패턴 시간이 지남에 변경 하는 방법으로 평가 수행할 수 있습니다. 향상 된 해상도 또한 작은 박테리아 가능 하지 않은 펩 티 드 지역화 추세를 고려 하는 연구를 수 있습니다. 예를 들어 일부 우리의 관찰 된 spheroplasts와 protoplasts, 펩...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트리즈마 하이드로클로라이드 (트리스 HCl)	시그마	T3253
트리즈마 베이스 (트리스 OH)	시그마	T1503
염화마그네슘	시그마	M8266
수크로오스	시그마	S7903
라이소자임	시그마	L6876
데옥시리보뉴클레아제 I	시그마	D4527
에틸렌디아민테트라아세트산	시그마	106361	원래 프로토콜 개발에 사용된 시그마 106361; 106361 ED2SS를 대체품으로 사용하여 단종
세팔렉신 수화물	시그마	C4895
암피실린	피셔 사이언티픽	BP1760
BBL 트립티카제 콩 육수	피셔 사이언	B11768
BF2 P11A FITC	네오사이언티픽	맞춤 주문
di-8-ANEPPS	Biotium	61012
DMSO	Sigma	34869	원래 프로토콜 개발에 Sigma D8779를 사용했습니다. D8779는 34869를 대체품으로 단종
. Maleic acid	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm 주사기 필터 w/ 0.2 μ m HT Tuffryn Membrane	Pall Corporation	4192
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	Leica Microsystems	TCS SP5 II	이미지 획득용
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence	Leica Microsystems		이미지 처리용