마이크로 RNAs (miRNAs) 메신저 RNAs (mRNAs)의 post-transcriptional 레 귤 레이 터로 봉사 하는 짧고 높은 동종 RNA 시퀀스입니다. 현재 미르 탐지 방법 감도 특이성에서 변화 한다. 우리는 현장에서 교 잡 및 마우스 심장 조직 섹션에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining를 결합 하는 프로토콜을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
마이크로 RNAs (miRNAs) 단일 가닥 RNA 사본 메신저 RNAs (mRNAs) 바인딩할 및 그들의 번역을 억제 또는 그들의 저하를 촉진 하는. 날짜 하려면, miRNAs 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검색 방법에 대 한 필요성을 의미 했다 생물학 및 질병 과정의 많은 수에 연루 되었습니다. 여기, 우리 digoxigenin 분류 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브 기반 미르 검색, 마우스 심장 섹션에 단백질 immunostaining와 함께 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 우리는 현장에서 교 잡 기술을 미르-182 식 제어 및 심장 비 대 쥐에서 심장 섹션에서을 식별 하는 프로브를 사용 하 여 수행. 다음, 우리는 공동 cardiomyocyte 셀 미르-182 지역화를 동일한 섹션에 심장 분 T (cTnT) 단백질에 대 한 immunostaining를 수행 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 통해 미르-182 기반 색도계 분석 결과, 및 형광 성 얼룩 통해 cTnT 감지할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 모든 miRNA LNA 발굴 표시 된 프로브를 통해 관심의 표현 및 마우스 심장 조직 섹션에 관련 된 단백질 표정 감지 하 사용할 수 있습니다.
서론
마이크로 RNAs (miRNAs)는 짧은 (18-25의 뉴클레오티드), 단일 가닥, noncoding RNAs는 메신저 RNA (mRNA) 번역 억제 및 홍보 mRNA 저하 여 post-transcriptional 수준에서 유전자 발현의 부정적인 레 귤 레이 터 기능 1. miRNAs는 introns 또는 코딩의 exons에서 복사할 수 또는 noncoding 유전자와 전조 miRNAs (pre-miRNAs), 70 뉴클레오티드2의 짧은 줄기 루프 구조를 DROSHA에 의해 핵에서 죽 습. 세포질 다음 내보내기, 사전 miRNAs 더 성숙한 miRNAs는 18-25의 뉴클레오티드3,4로 DICER에 의해 처리 됩니다. 그 후, RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC) 통합이 miRNAs 단일 가닥 RNAs로 그들의 식3,5 억제 하는 3' 되지 않은 지역 (3'-UTR) 그들의 표적 mRNAs의 바인딩을 수 있는 .
그들은 처음으로 확인 했다, 이후 지....
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프로토콜
이 연구에 대 한 마우스 심장 조직 샘플 관련 법령 및 기관의 지침에 따라 확인 하 고 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1. 솔루션 준비
- RNase 무료 ddH2O 준비, 5l ddH2O의 0.1 %diethylpyrocarbonate (DEPC)의 5 mL로 하 여 실 온 (RT)에서 (O/N), 하룻밤. 오토 클레이 브 (121 ° C)에서 DEPC를 비활성화 하려면. 사용 DEPC 처리 ddH2O 준비에 대 한 다운스트림 솔루션으로의 표시.
주의: DEPC는 알려진된 발암 물질, 증기 두건에서 처리. - DEPC 처리 ddH2O. 압력솥 (121 ° C) 1 리터에 5 PBS 정제를 용 해 하 여 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션을 준비 합니다.
- 1 x PBS의 1 L 당 비 이온 세제의 1 mL를 희석 하 여 0.1% 비 이온 세제/PBS (PBST)를 준비 합니다.
- DEPC 처리 ddH2오 90%, 70%, 50%와 30% 에탄올을 준비
- 10 mg/mL DEPC 처리 ddH2오 약 ....
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결과
miRNA에 제자리 교 잡 출 격 miRNA와 U6-snRNA, 부정과 긍정적인 컨트롤을 각각 역임을 사용 하 여 마우스 심장 섹션에 최적화 되었다. 색상 개발의 부족에 의해 표시 됩니다 부정적인 얼룩 동안 파란색, 표시는 긍정적인 얼룩 (그림 1A-1B). 미르-182의 Cardiomyocyte 특정 식 제어 및 PlGF overexpressing 쥐에서 심장 섹션에서 평가 했다. ΑMHC 발기인 아래 PlGF transgene 들고 쥐 transgene 활성화26의 6 주 이내에 심장 비 대, 보조 증가 신생 개발. 우리 현장에서 교 잡 수행 하 고 컨트롤에 비해 PlGF 쥐의 마음에 있는 미르-182의 증가 식 (그림 2A-2 H
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토론
miRNA 사본 검출 감도, 특이성 및 양적 힘에서 변화 하는 다른 기술을 통해 얻을 수 있습니다. 여기, 우리 미르 교 잡 제자리에 immunostaining와의 커플링을 보여 같은 심장 섹션에 미르와 단백질 분자의 식 레벨의 동시 평가 허용 하는 프로토콜을 설명 하 고. 우리는 먼저 파라핀 포함 심장 섹션에 제자리에서 교 잡 파 표시 된 LNA 미르 프로브를 수행 하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 cTnT 같은 섹션에 대 한 immunostaining를 수행 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 결과 색상 및 형광 이미지를 병합 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 포 르 말린 고정 (4 ° C, O/N)에 대 한 최적화 되었습니다 / 파라핀 발굴 표시 된 LNA 미르 프로브 및 cTnT 사용 마우스 심장 조직, 임베디드. 추가 최적화를 다른 조직에 필요할 수 있습니다, 조사 또는 항 체 유형, 아래에 설명 된 대로.
RNas.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 아타 나 시오 스 Papangelis, 원고에 대 한 중요 한 의견에 대 한 감사 하 고 싶습니다. FM은 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC;에 의해 지원 BB/M009424/1). IP는 미국 심장 협회 과학자 개발 그랜트 (17SDG33060002)에 의해 지원 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 디에틸피로카보네이트 | 시그마 알드리치 | D5758 | DEPC |
| 인산염 완충 식염수 | 시그마 알드리치 | P4417 | PBS |
| 트윈-20 | 미국 생물분석 | AB02038 | 비이온 계면활성제 |
| 히스토클리어 | 내셔널 진단 | HS-200 | |
| 단백질분해효소 K, 재조합, PCR 등급 | 시그마 알드리치 | 3115879001 | ProK |
| 파라포름알데히드 | 시그마 알드리치 | P6148 | PFA |
| 염화나트륨 | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| 염화마그네슘 육수화물 | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | 시그마 Aldrich | T6066 | |
| 염산 용액, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| 염산 용액, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-메틸이미다졸 | 시그마 알드리치 | 336092 | |
| N-(3-디메틸아미노프로필)-N&프라임;-에틸카르보디이미드 염산염 | 시그마 알드리치 | 39391 | EDC |
| 과산화수소 용액 H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG 및 3'-DIG 표지 |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP 정제 | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| 염화칼 | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI 용액(1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| 유리 커버슬립 | ThermoFisher | 12-545E | 유리 커버 슬립 |
| 플라스틱 커버 슬립 | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase 무료 플라스틱 커버 슬립 |
| 안티 디곡시제닌-AP, 팹 단편 | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG 항체 |
| 소수성 장벽 펜 | Vector Laboratories | H-4000 | Pap 펜 |
| 안티 심장 트로포닌 T 항체 | Abcam | ab92546 | cTnT 항체 |
| 염소 항토끼 IgG (H+L) 교차 흡수 2차 항체, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | 항토끼-568 항체 |
| Dako 형광 장착 매체 | DAKO | S3023 | 장착 매체 |
| 양 혈청 | Sigma Aldrich | S3772 | |
| 염소 혈청 | Sigma Aldrich | G9023 | |
| 탈이온화 포름아미드 | 미국 바이오분석 | AB00600 | |
| 혼성화 오븐 | ThermoFisher | UVP HB-1000 하이브리드라이저 |
참고문헌
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
- Hu....
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재인쇄 및 허가
