Method Article

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

DOI:

10.3791/57920

⸱

September 15th, 2018

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마이크로 RNAs (miRNAs) 메신저 RNAs (mRNAs)의 post-transcriptional 레 귤 레이 터로 봉사 하는 짧고 높은 동종 RNA 시퀀스입니다. 현재 미르 탐지 방법 감도 특이성에서 변화 한다. 우리는 현장에서 교 잡 및 마우스 심장 조직 섹션에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining를 결합 하는 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

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마이크로 RNAs (miRNAs) 단일 가닥 RNA 사본 메신저 RNAs (mRNAs) 바인딩할 및 그들의 번역을 억제 또는 그들의 저하를 촉진 하는. 날짜 하려면, miRNAs 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검색 방법에 대 한 필요성을 의미 했다 생물학 및 질병 과정의 많은 수에 연루 되었습니다. 여기, 우리 digoxigenin 분류 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브 기반 미르 검색, 마우스 심장 섹션에 단백질 immunostaining와 함께 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 우리는 현장에서 교 잡 기술을 미르-182 식 제어 및 심장 비 대 쥐에서 심장 섹션에서을 식별 하는 프로브를 사용 하 여 수행. 다음, 우리는 공동 cardiomyocyte 셀 미르-182 지역화를 동일한 섹션에 심장 분 T (cTnT) 단백질에 대 한 immunostaining를 수행 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 통해 미르-182 기반 색도계 분석 결과, 및 형광 성 얼룩 통해 cTnT 감지할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 모든 miRNA LNA 발굴 표시 된 프로브를 통해 관심의 표현 및 마우스 심장 조직 섹션에 관련 된 단백질 표정 감지 하 사용할 수 있습니다.

Introduction

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마이크로 RNAs (miRNAs)는 짧은 (18-25의 뉴클레오티드), 단일 가닥, noncoding RNAs는 메신저 RNA (mRNA) 번역 억제 및 홍보 mRNA 저하 여 post-transcriptional 수준에서 유전자 발현의 부정적인 레 귤 레이 터 기능 1. miRNAs는 introns 또는 코딩의 exons에서 복사할 수 또는 noncoding 유전자와 전조 miRNAs (pre-miRNAs), 70 뉴클레오티드2의 짧은 줄기 루프 구조를 DROSHA에 의해 핵에서 죽 습. 세포질 다음 내보내기, 사전 miRNAs 더 성숙한 miRNAs는 18-25의 뉴클레오티드3,4로 DICER에 의해 처리 됩니다. 그 후, RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC) 통합이 miRNAs 단일 가닥 RNAs로 그들의 식3,5 억제 하는 3' 되지 않은 지역 (3'-UTR) 그들의 표적 mRNAs의 바인딩을 수 있는 .

그들은 처음으로 확인 했다, 이후 지....

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Protocol

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이 연구에 대 한 마우스 심장 조직 샘플 관련 법령 및 기관의 지침에 따라 확인 하 고 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.

1. 솔루션 준비

  1. RNase 무료 ddH2O 준비, 5l ddH2O의 0.1 %diethylpyrocarbonate (DEPC)의 5 mL로 하 여 실 온 (RT)에서 (O/N), 하룻밤. 오토 클레이 브 (121 ° C)에서 DEPC를 비활성화 하려면. 사용 DEPC 처리 ddH2O 준비에 대 한 다운스트림 솔루션으로의 표시.
    주의: DEPC는 알려진된 발암 물질, 증기 두건에서 처리.
  2. DEPC 처리 ddH2O. 압력솥 (121 ° C) 1 리터에 5 PBS 정제를 용 해 하 여 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션을 준비 합니다.
  3. 1 x PBS의 1 L 당 비 이온 세제의 1 mL를 희석 하 여 0.1% 비 이온 세제/PBS (PBST)를 준비 합니다.
  4. DEPC 처리 ddH2오 90%, 70%, 50%와 30% 에탄올을 준비
  5. 10 mg/mL DEPC 처리 ddH2오 약 ....

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Results

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miRNA에 제자리 교 잡 출 격 miRNA와 U6-snRNA, 부정과 긍정적인 컨트롤을 각각 역임을 사용 하 여 마우스 심장 섹션에 최적화 되었다. 색상 개발의 부족에 의해 표시 됩니다 부정적인 얼룩 동안 파란색, 표시는 긍정적인 얼룩 (그림 1A-1B). 미르-182의 Cardiomyocyte 특정 식 제어 및 PlGF overexpressing 쥐에서 심장 섹션에서 평가 했다. ΑMHC 발기인 아래 PlGF transgene 들고 쥐 transgene 활성화26의 6 주 이내에 심장 비 대, 보조 증가 신생 개발. 우리 현장에서 교 잡 수행 하 고 컨트롤에 비해 PlGF 쥐의 마음에 있는 미르-182의 증가 식 (그림 2A-2 H

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Discussion

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miRNA 사본 검출 감도, 특이성 및 양적 힘에서 변화 하는 다른 기술을 통해 얻을 수 있습니다. 여기, 우리 미르 교 잡 제자리에 immunostaining와의 커플링을 보여 같은 심장 섹션에 미르와 단백질 분자의 식 레벨의 동시 평가 허용 하는 프로토콜을 설명 하 고. 우리는 먼저 파라핀 포함 심장 섹션에 제자리에서 교 잡 파 표시 된 LNA 미르 프로브를 수행 하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 cTnT 같은 섹션에 대 한 immunostaining를 수행 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 결과 색상 및 형광 이미지를 병합 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 포 르 말린 고정 (4 ° C, O/N)에 대 한 최적화 되었습니다 / 파라핀 발굴 표시 된 LNA 미르 프로브 및 cTnT 사용 마우스 심장 조직, 임베디드. 추가 최적화를 다른 조직에 필요할 수 있습니다, 조사 또는 항 체 유형, 아래에 설명 된 대로.

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Disclosures

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저자는 공개 없다.

Acknowledgements

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우리는 아타 나 시오 스 Papangelis, 원고에 대 한 중요 한 의견에 대 한 감사 하 고 싶습니다. FM은 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC;에 의해 지원 BB/M009424/1). IP는 미국 심장 협회 과학자 개발 그랜트 (17SDG33060002)에 의해 지원 됩니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
디에틸피로카보네이트시그마 알드리치D5758DEPC
인산염 완충 식염수시그마 알드리치P4417PBS
트윈-20미국 생물분석AB02038비이온 계면활성제
히스토클리어내셔널 진단HS-200
단백질분해효소 K, 재조합, PCR 등급시그마 알드리치3115879001ProK
파라포름알데히드시그마 알드리치P6148PFA
염화나트륨ThermoFisherS271NaCl
염화마그네슘 육수화물ThermoFisherM33MgCl2
Tris시그마 AldrichT6066
염산 용액, 1 NThermoFisherSA48HCl
염산 용액, 12 NThermoFisherS25358HCl
1-메틸이미다졸시그마 알드리치336092
N-(3-디메틸아미노프로필)-N&프라임;-에틸카르보디이미드 염산염시그마 알드리치39391EDC
과산화수소 용액 H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
Trisodium citrate dihydrateSigma AldrichS1804Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)Qiagen339450scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probeQIagenYD006157015'-DIG 및 3'-DIG 표지
Levamisol hydrochlorideSigma Aldrich31742
소 혈청 알부민시그마 AldrichA9647BSA
NBT/BCIP 정제Sigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
염화칼ThermoFisherP217KCl
DAPI 용액(1mg/ml)ThermoFisher62248DAPI
유리 커버슬립ThermoFisher12-545E유리 커버 슬립
플라스틱 커버 슬립Grace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0.25mmRNA-ase 무료 플라스틱 커버 슬립
안티 디곡시제닌-AP, 팹 단편Sigma Aldrich11093274910DIG 항체
소수성 장벽 펜Vector LaboratoriesH-4000Pap 펜
안티 심장 트로포닌 T 항체Abcamab92546cTnT 항체
염소 항토끼 IgG (H+L) 교차 흡수 2차 항체, Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011항토끼-568 항체
Dako 형광 장착 매체DAKOS3023장착 매체
양 혈청Sigma AldrichS3772
염소 혈청Sigma AldrichG9023
탈이온화 포름아미드미국 바이오분석AB00600
혼성화 오븐ThermoFisherUVP HB-1000 하이브리드라이저
륨

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hu....

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In Situ HybridizationMicroRNA DetectionMouse Heart SectionsProtein ImmunostainingCardiac Troponin TDigoxigenin Labeled ProbeLocked Nucleic AcidAlkaline Phosphatase AssayFluorescent StainingTissue Section Preparation

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