방법 논문

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

DOI:

10.3791/57920

⸱

2018년 9월 15일

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마이크로 RNAs (miRNAs) 메신저 RNAs (mRNAs)의 post-transcriptional 레 귤 레이 터로 봉사 하는 짧고 높은 동종 RNA 시퀀스입니다. 현재 미르 탐지 방법 감도 특이성에서 변화 한다. 우리는 현장에서 교 잡 및 마우스 심장 조직 섹션에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining를 결합 하는 프로토콜을 설명 합니다.

초록

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마이크로 RNAs (miRNAs) 단일 가닥 RNA 사본 메신저 RNAs (mRNAs) 바인딩할 및 그들의 번역을 억제 또는 그들의 저하를 촉진 하는. 날짜 하려면, miRNAs 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검색 방법에 대 한 필요성을 의미 했다 생물학 및 질병 과정의 많은 수에 연루 되었습니다. 여기, 우리 digoxigenin 분류 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브 기반 미르 검색, 마우스 심장 섹션에 단백질 immunostaining와 함께 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 우리는 현장에서 교 잡 기술을 미르-182 식 제어 및 심장 비 대 쥐에서 심장 섹션에서을 식별 하는 프로브를 사용 하 여 수행. 다음, 우리는 공동 cardiomyocyte 셀 미르-182 지역화를 동일한 섹션에 심장 분 T (cTnT) 단백질에 대 한 immunostaining를 수행 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 통해 미르-182 기반 색도계 분석 결과, 및 형광 성 얼룩 통해 cTnT 감지할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 모든 miRNA LNA 발굴 표시 된 프로브를 통해 관심의 표현 및 마우스 심장 조직 섹션에 관련 된 단백질 표정 감지 하 사용할 수 있습니다.

서론

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마이크로 RNAs (miRNAs)는 짧은 (18-25의 뉴클레오티드), 단일 가닥, noncoding RNAs는 메신저 RNA (mRNA) 번역 억제 및 홍보 mRNA 저하 여 post-transcriptional 수준에서 유전자 발현의 부정적인 레 귤 레이 터 기능 1. miRNAs는 introns 또는 코딩의 exons에서 복사할 수 또는 noncoding 유전자와 전조 miRNAs (pre-miRNAs), 70 뉴클레오티드2의 짧은 줄기 루프 구조를 DROSHA에 의해 핵에서 죽 습. 세포질 다음 내보내기, 사전 miRNAs 더 성숙한 miRNAs는 18-25의 뉴클레오티드3,4로 DICER에 의해 처리 됩니다. 그 후, RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC) 통합이 miRNAs 단일 가닥 RNAs로 그들의 식3,5 억제 하는 3' 되지 않은 지역 (3'-UTR) 그들의 표적 mRNAs의 바인딩을 수 있는 .

그들은 처음으로 확인 했다, 이후 지난 3 년간 내 miRNAs가 유전자 발현, 그 자신의 식 레벨은 긴밀 하 게 제어6의 마스터 레 귤 레이 터 등장 했습니다. 장기 개발7,,89,10,11,12, 항상성13,14의 유지 보수에에서 miRNAs에 대 한 역할 설명 되었습니다. , 질병 컨텍스트 신경15,,1617,18,19, 심혈 관20를 포함 하는 자기 면역 조건21 뿐만 아니라 ,22, 암23,24, 등25. MiRNA 식 패턴의 관련성에 대 한 증가 감사 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검출 방법에 대 한 필요성을 게 앞으로 가져왔다. 이러한 방법 등이 실시간 PCR, microarrays, 북부에 게 더 럽 히기, 제자리에서 교 잡, 사실은 미르 성적표는 짧은 구성 주로 감도, 특이성, 및 양적 발전에 따라 고 매우 일치 순서6.

우리는 최근 미르-182 심근 비 대26, 높은 hemodynamic 요구27,28응답에서 심장의 구조적 적응을 설명 하는 조건 개발에 대 한 중요 한 역할을 했다. 심장 비 대 maladaptive 개장29와 관련 된 경우 심장 마비, 회계 모든 죽음의 8.5%에 기인 심장 혈관 상태에 대 한 위험 증가에 지도할 수 있는 심근 질량에 있는 증가 의해 특징입니다. 질병30.

우리가 현장에서 교 잡은 digoxigenin 표시 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브와 결합 마우스 심장 조직 단면도에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining에 우리의 프로토콜을 설명 하는 여기, 우리의 심장 비 대의 모델입니다.

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프로토콜

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이 연구에 대 한 마우스 심장 조직 샘플 관련 법령 및 기관의 지침에 따라 확인 하 고 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.

1. 솔루션 준비

  1. RNase 무료 ddH2O 준비, 5l ddH2O의 0.1 %diethylpyrocarbonate (DEPC)의 5 mL로 하 여 실 온 (RT)에서 (O/N), 하룻밤. 오토 클레이 브 (121 ° C)에서 DEPC를 비활성화 하려면. 사용 DEPC 처리 ddH2O 준비에 대 한 다운스트림 솔루션으로의 표시.
    주의: DEPC는 알려진된 발암 물질, 증기 두건에서 처리.
  2. DEPC 처리 ddH2O. 압력솥 (121 ° C) 1 리터에 5 PBS 정제를 용 해 하 여 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션을 준비 합니다.
  3. 1 x PBS의 1 L 당 비 이온 세제의 1 mL를 희석 하 여 0.1% 비 이온 세제/PBS (PBST)를 준비 합니다.
  4. DEPC 처리 ddH2오 90%, 70%, 50%와 30% 에탄올을 준비
  5. 10 mg/mL DEPC 처리 ddH2오 약 수에에서 성분을 K (ProK)의 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 저장 DEPC 처리 ddH2O. 만들어 사용 하기 전에 신선한의 50 ml ProK 재고 솔루션의 100 μ diluting 하 여 ProK의 20 μ g/mL 작업 솔루션을 준비 합니다.
  6. 1 x PBS의 50 ml에서 PFA의 2 세대를 추가 하 여 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다. 해산 때까지 가끔 떨고, 65 ° C에서 열. 약 수와-20 ° c.에 게
    주의: PFA는 알려진된 발암 물질, 증기 두건에서 처리.
  7. DdH2O. 압력솥 (121 ° C)의 500 ml 87.8 g를 추가 하 여 3 M NaCl 솔루션을 준비 합니다.
  8. DdH2O. 압력솥 (121 ° C)의 100 ml 20.3 g를 추가 하 여 1 M MgCl2 솔루션을 준비 합니다.
  9. 1 M Tris pH 8.0 ddH2O. 조절 pH 8.0의 800 mL에서 녹이는 121.1 g 1 N HCl 몇 방울과 준비, 볼륨 1 L 압력솥 (121 ° C)를가지고. DdH2오의 1 M Tris pH 8.0에서 47.5 ml 2.5 mL를 diluting 하 여 50 mM Tris pH 8.0의 작업 솔루션을 준비
  10. 1 M Tris pH 9.5 ddH2O. 조절 pH 9.5 400 mL에 녹이는 60.6 g 1 N HCl 몇 방울과 준비, 500 mL와 오토 클레이 브 (121 ° C)에 볼륨을가지고.
  11. 3 M NaCl의 1-12 N HCl. 추가 16 mL 약 450 µ L로 DEPC 처리 ddH2O. 조절 pH 8.0의 130 ml Methylimidazole의 1.6 mL diluting 하 여 0.13 M 1 Methylimidazole pH 8.0을 준비 하 고 160 mL에 볼륨을가지고. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다.
    주의: 1-Methylimidazole 점 막, 눈과 피부에 유해 하, 증기 두건에서 처리.
  12. Diluting 176 µ L EDC의 0.13 M 1-Methylimidazole의 10 mL에 의해 0.16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-n ′-ethylcarbodiimide 염 산 염 (EDC)를 준비 합니다. 8.0 사용 하기 전에 12 N HCl. 확인 신선의 약 100 µ L로 pH를 조정 합니다.
    주의: EDC는 점 막, 눈, 그리고 피부에 유해한, 증기 두건에서 처리.
  13. 1 x PBS의 50 ml에서 30% H2O2 의 1.5 mL를 희석 하 여 1% H2O2 를 준비 합니다. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다.
  14. 준비 20 x SSC pH 7.0 175.3 g의 NaCl 및 나트륨 구 연산 염 (나3C6H5O7) ddH2O. 조정의 800 mL에서의 88.2 g을 용 해 하 여 pH 1의 몇 방울과 7.0 N HCl 1 L 압력솥 (121 ° C)를 볼륨을가지고.
    1. DdH2오 20 x SSC pH 7.0에서 180 mL의 20 mL를 희석 하 여 2 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비
    2. DdH2오 20 x SSC pH 7.0에서 47.5 ml 2.5 mL를 희석 하 여 1 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비
    3. DdH2오의 2 x SSC pH 7.0에서 45 mL의 5 mL을 diluting 하 여 0.2 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비
  15. DEPC 처리 ddH2O. 만들어 사용 하기 전에 신선한 0.5 mL에 2 x microRNA 분 버퍼의 0.5 mL를 diluting 하 여 교 잡 솔루션 x 1을 준비 합니다.
  16. DdH2오 약 수의 5 mL을 250 mg을 추가 하 여 Levamisole의 200 m m 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 저장
  17. 9 ml PBST, 양 혈 청 1 mL를 희석 하 고 BSA의 0.1 g을 추가 하 여 5 (10% 양 serum/1% BSA/0.2 m m Levamisol) 단계에 대 한 차단 솔루션을 준비 합니다. 사용 하기 전에 10 μ Levamisole의 추가 합니다. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다.
  18. PBST의 9 mL 혈 청 염소의 1 mL를 희석 하 고 BSA의 0.1 g을 추가 하 여 단계 6 (10% 염소 serum/1% BSA) 차단 솔루션을 준비 합니다. 4 ° C에서 저장 하 고 1 주일 이내 사용.
  19. 3의 3.3 mL를 diluting 하 여 prestaining 솔루션 준비 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris pH 9.5, 10 mL의 5 mL 100 µ L 트윈 20, ddH2O. 만들어 신선한 81.5 ml에서 Levamisole의 100 µ L의 사용 전에.
  20. 사용 하는 nitroblue tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly 인산 (BCIP) 정제 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 제조업체의 지침에 따라 기판 솔루션의 20 mL를 준비 하. 20 μ Levamisole의 추가 합니다. 사용 하기 전에 신선한 고 빛 으로부터 보호.
  21. 4 g의 트리, 4.4 g의 NaCl 및 ddH2O. 압력솥 (121 ° C)의 500 mL에 KCl의 375 mg을 추가 하 여 KTBT 솔루션을 준비 합니다.
  22. 선택 사항: 1 x PBS의 50 mL에 DAPI 재고 솔루션 (1 mg/mL)의 50 μ diluting 하 여 DAPI 작업 솔루션 (1 μ g/mL)를 준비 합니다.
    참고: 표준 솔루션 3 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris HCl, nuclease 무료 ddH2O, 1 x PBS와 20 x SSC 또는 구매 될 수 있다. 이 프로토콜, 50 mL 유리 Coplin jar 또는 20 mL 폴 리 프로필 렌 슬라이드 우편물에 대 한 단지 사용 되었습니다.

2. 조직 준비

참고: 여기 사용 마우스 심장 섹션 했다 포 르 말린-고정/파라핀 끼워 넣어진 조직에서 예일 병 리 조직 서비스, 준비, 5 μ m에서 잘라내어 충전된 슬라이드에 위치.

  1. 조직 재입니다.
    1. 따뜻한 파라핀 눈 녹는 때까지 교 잡 오븐에서 10 분 동안 60 ° C에서 슬라이드.
    2. 상용 개간 에이전트 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어 ( 재료의 표참조) 10 분, 두 번.
    3. 두 번, 2 분 50% 에탄올과 2 분 30% 에탄올 유리 Coplin jar 2 분, 100% 에탄올의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번, 뒤에 2 분 동안 90% 에탄올, 2 분, 70% 에탄올에에서 슬라이드를 품 어.
    4. DEPC 처리 ddH2O 5 분 동안 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어.
    5. 포함 하는 5 분의 1 x PBS의 50 mL 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어.
  2. 조직 드-proteinating입니다.
    1. 슬라이드 20 μ g/mL ProK 작업 솔루션, 교 잡 오븐에 15 분 동안 37 ° C에서 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에서 품 어.
      주의: 아래의 소화 될 수 있습니다 가난한 또는 아무 신호 개발 동안-소화 배경 얼룩의 개발과 조직 저하 될 수 있습니다. 최적화는이 단계 (1-20 μ g/mL ProK, 5-20 분 보육, RT-37 ° C)에 대 한 필요할 수 있습니다.
    2. RT에 5 분, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
  3. 조직의 고정입니다.
    1. 소수 성 펜을 사용 하 여 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.
    2. 각 슬라이드의 길이를 4 %PFA 솔루션의 500 µ L을 적용 하 고 실시간에 10 분 동안 가로 슬라이드를 품 어
    3. RT에 5 분, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
    4. 워시 0.13 M 1-10 분, RT에 methylimidazole의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드.
    5. 각 슬라이드의 길이에 500 µ L 0.16 M EDC 솔루션의 적용 고 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.
    6. 실시간에서 50 mM Tris pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어
    7. 린스에 RT, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드.
      참고: 두 PFA 및 EDC 고정 단계 미르 가교에 필요한 생략할 수 없습니다. 31
  4. 내 인 성 과산화 효소 블록입니다.
    1. 실시간에서 30 분 동안 1% H2O2 의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어
    2. 린스에 RT, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드.

3입니다. 교 잡

  1. 대상 온도까지 교 잡 솔루션 (슬라이드 당 500 µ L) 교 잡의 오븐에서 50 ° C에서 예 열, (10-15 분)에 도달.
  2. 교 잡 챔버 챔버의 하단에 필터 또는 휴지의 2 개를 놓고 종이 50 %formamide / 1 일로 준비 x SSC.
    주의: Formamide은 점 막, 눈과 피부, 증기 두건에서 유일한 핸들에 유해한.
  3. 각 슬라이드의 길이를 교 잡 솔루션의 200 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 50 ° C에서 1-3 h에 대 한 슬라이드를 품 어.
  4. 1.5 mL 튜브에 250 µ L ofhybridization 솔루션 (최종 농도 50 nM)에서 0.5 µ L 재고 조사 (25 µ M)를 혼합 하 여 프로브 솔루션을 준비 합니다.
    참고: 다른 miRNAs 표현 됩니다 서로 다른 수준에서 최적화 프로브 농도 관한이 단계 (1-50 nM), 아무 신호 나 높은 배경 개발을 피하기 위해 필요한 수 있습니다.
  5. 각 슬라이드의 길이를 프로브 솔루션의 250 µ L을 적용 하 고 상단에는 RNase 무료 coverslip 장소. 거품의 형성을 하지 마십시오.
  6. 신중 하 게 교 잡 챔버 parafilm으로 밀봉 하 고 O/N 50 ° c.에서 품 어
    참고: 교 잡 온도 각 프로브의 RNA 녹는 온도 (Tm) 약 30 ° C 설정 한다. 최적화 해야 합니다. 여기, 50 ° C 미르-182 교 잡/세척 온도로 사용 되, 그에 따라 조정 다른 프로브에 대 한.

4. 엄중 세척

  1. 2의 200 mL prewarm 대상 온도 (20-40 분)를 도달할 때까지 교 잡 오븐에서 50 ° C에서 x SSC.
  2. 슬라이드 2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 세척 50 ° c 5 분, 또는 coverslips는 느슨하게 때까지 x SSC.
  3. 슬라이드 2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 씻어 5 분, 두 번 RT에서 x SSC.
  4. 0.2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어 RT 5 분에서 x SSC.
  5. 5 분에 대 한 실시간에 PBST의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어.
  6. 5 분에 대 한 RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어.
    참고: RNase 무료 조건의 사용은 RNA RNA 하이브리드 안정적인 것으로 간주 됩니다 때문에 더 이상 필요.

5. 파 항 체 검출

  1. 소수 성 펜을 사용 하 여 필요한 경우 다시 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.
  2. 각 슬라이드의 길이를 솔루션 차단의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에서 30 분에 대 한 슬라이드를 품 어.
  3. 1.5 mL 튜브에 500 µ L ofblocking 솔루션 항 체 발굴의 0.5 μ diluting 하 여 발굴 항 체 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다.
    주의: 최적화가이 단계에 대 한 필요할 수 있습니다 (1: 500-1:2, 000).
  4. 각 슬라이드의 길이를 발굴 항 체 솔루션의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.
  5. 5 분, RT에 PBST의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
  6. 워시 유리 Coplin jar RT 5 분에 대 한 솔루션을 두 번 prestaining의 50 mL를 포함 하는 슬라이드.
  7. 슬라이드 6-24 h, 빛 으로부터 보호에 대 한 37 ° C에 20 mL ofAP 기판 솔루션을 포함 하는 폴 리 프로필 렌 슬라이드 우편물 항아리에 품 어.
    주의: 색상 개발 검사 되어야 한다 매 2 h. 최적화가이 단계에 대 한 필요할 수 있습니다.
  8. RT 5 분, KTBT 솔루션 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
  9. 5 분에 대 한 RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어.

6입니다. cTnT 항 체 검출

  1. 소수 성 펜을 사용 하 여 필요한 경우 다시 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.
  2. 각 슬라이드의 길이를 솔루션 차단의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.
  3. 1.5 mL 튜브에 200 μ ofblocking 솔루션에서 cTnT 항 체의 2 μ diluting 하 여 cTnT 항 체 솔루션 (1: 100)를 준비 합니다.
  4. 각 슬라이드의 길이를 200 µ L cTnT 항 체 솔루션을 적용 합니다. 슬라이드를 품 어 습도 챔버에 4 ° C에서 가로로 O/N.
  5. 5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
  6. 1.5 mL 튜브에 250 μ ofblocking 솔루션 항 체 안티 rabbit 568의 0.5 μ diluting 하 여 안티 rabbit 568 항 체 솔루션 (1: 500)를 준비 합니다.
  7. 각 슬라이드의 길이를 반대로 rabbit 568 항 체 솔루션의 250 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.
  8. 5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
  9. 선택 사항: 각 슬라이드의 길이에 DAPI 작업 솔루션의 250 µ L을 적용 하 고 빛 으로부터 보호 하는 RT에 1 분 동안 가로 슬라이드를 품 어.
  10. 5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.

7. 장착 및 이미징

  1. 장착 매체와 유리 커버 슬립의 2-3 방울과 슬라이드를 탑재 합니다. 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 O/N, 평면, 건조를 슬라이드 수 있습니다.
  2. Epifluorescent 또는 confocal 현미경 검사 법을 진행 합니다.

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결과

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miRNA에 제자리 교 잡 출 격 miRNA와 U6-snRNA, 부정과 긍정적인 컨트롤을 각각 역임을 사용 하 여 마우스 심장 섹션에 최적화 되었다. 색상 개발의 부족에 의해 표시 됩니다 부정적인 얼룩 동안 파란색, 표시는 긍정적인 얼룩 (그림 1A-1B). 미르-182의 Cardiomyocyte 특정 식 제어 및 PlGF overexpressing 쥐에서 심장 섹션에서 평가 했다. ΑMHC 발기인 아래 PlGF transgene 들고 쥐 transgene 활성화26의 6 주 이내에 심장 비 대, 보조 증가 신생 개발. 우리 현장에서 교 잡 수행 하 고 컨트롤에 비해 PlGF 쥐의 마음에 있는 미르-182의 증가 식 (그림 2A-2 H

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토론

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miRNA 사본 검출 감도, 특이성 및 양적 힘에서 변화 하는 다른 기술을 통해 얻을 수 있습니다. 여기, 우리 미르 교 잡 제자리에 immunostaining와의 커플링을 보여 같은 심장 섹션에 미르와 단백질 분자의 식 레벨의 동시 평가 허용 하는 프로토콜을 설명 하 고. 우리는 먼저 파라핀 포함 심장 섹션에 제자리에서 교 잡 파 표시 된 LNA 미르 프로브를 수행 하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 cTnT 같은 섹션에 대 한 immunostaining를 수행 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 결과 색상 및 형광 이미지를 병합 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 포 르 말린 고정 (4 ° C, O/N)에 대 한 최적화 되었습니다 / 파라핀 발굴 표시 된 LNA 미르 프로브 및 cTnT 사용 마우스 심장 조직, 임베디드. 추가 최적화를 다른 조직에 필요할 수 있습니다, 조사 또는 항 체 유형, 아래에 설명 된 대로.

RNas...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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우리는 아타 나 시오 스 Papangelis, 원고에 대 한 중요 한 의견에 대 한 감사 하 고 싶습니다. FM은 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC;에 의해 지원 BB/M009424/1). IP는 미국 심장 협회 과학자 개발 그랜트 (17SDG33060002)에 의해 지원 됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
디에틸피로카보네이트시그마 알드리치D5758DEPC
인산염 완충 식염수시그마 알드리치P4417PBS
트윈-20미국 생물분석AB02038비이온 계면활성제
히스토클리어내셔널 진단HS-200
단백질분해효소 K, 재조합, PCR 등급시그마 알드리치3115879001ProK
파라포름알데히드시그마 알드리치P6148PFA
염화나트륨ThermoFisherS271NaCl
염화마그네슘 육수화물ThermoFisherM33MgCl2
Tris시그마 AldrichT6066
염산 용액, 1 NThermoFisherSA48HCl
염산 용액, 12 NThermoFisherS25358HCl
1-메틸이미다졸시그마 알드리치336092
N-(3-디메틸아미노프로필)-N&프라임;-에틸카르보디이미드 염산염시그마 알드리치39391EDC
과산화수소 용액 H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
Trisodium citrate dihydrateSigma AldrichS1804Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)Qiagen339450scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probeQIagenYD006157015'-DIG 및 3'-DIG 표지
Levamisol hydrochlorideSigma Aldrich31742
소 혈청 알부민시그마 AldrichA9647BSA
NBT/BCIP 정제Sigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
염화칼ThermoFisherP217KCl
DAPI 용액(1mg/ml)ThermoFisher62248DAPI
유리 커버슬립ThermoFisher12-545E유리 커버 슬립
플라스틱 커버 슬립Grace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0.25mmRNA-ase 무료 플라스틱 커버 슬립
안티 디곡시제닌-AP, 팹 단편Sigma Aldrich11093274910DIG 항체
소수성 장벽 펜Vector LaboratoriesH-4000Pap 펜
안티 심장 트로포닌 T 항체Abcamab92546cTnT 항체
염소 항토끼 IgG (H+L) 교차 흡수 2차 항체, Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011항토끼-568 항체
Dako 형광 장착 매체DAKOS3023장착 매체
양 혈청Sigma AldrichS3772
염소 혈청Sigma AldrichG9023
탈이온화 포름아미드미국 바이오분석AB00600
혼성화 오븐ThermoFisherUVP HB-1000 하이브리드라이저
륨

참고문헌

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