방법 논문

향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

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DOI:

10.3791/57921

⸱

2018년 6월 10일

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

선물이 epigenomically 안정 순 preimplantation epiblast 같은 만능 상태로, 대량, 효율적이 고 신속한 화학 귀선 기존의 혈통 액 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)의 대 한 프로토콜. 이 방법은 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에 걸쳐 감소 혈통 액 유전자 발현과 감독된 multilineage 차별화에 표시 되어 있는 개선에 발생합니다.

초록

순진한 인간 만능 줄기 세포 (N hPSC) 향상 된 기능 재생 의학에 다양 한 영향을 있을 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 효율적으로 준비 하는 혈통, 기존의 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 향상 된 기능을 가진 순진한 같은 pluripotency에 피더 무료 또는 급지대 종속 상태에 유지 되돌릴 것입니다. 이 화학 순진한 귀선 메서드 GSK3β, 고전 백혈병 금지 요인 (LIF), 고용 및 MEK/ERK 저해 칵테일 (LIF-2i)는 tankyrase 억제제 XAV939만 보충 (LIF-3i). LIF 3i 안정적인 만능 주 생화학, transcriptional, 채택 및 인간의 사전 주입 epiblast의 후 성적인 기능에 기존의 hPSC 되돌립니다. 이 LIF 3i 메서드가 필요 최소한의 셀 문화 조작 하며 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 transgene 무료 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에서 높은 재현성. LIF 3i 방법 차별화; 전에 다시 프라이 밍 단계를 필요 하지 않습니다. N hPSC 매우 높은 효율성과 직접 분화 될 수 있다 하 고 유지 하는 karyotypic 및 epigenomic 안정성 (찍힌된 loci에 포함). 방법의 보편성을 높이기 위해 기존의 hPSC 처음 두 개의 추가 작은 분자 단백질 키 니 아 제 (산림) 및 소닉 고슴도치 (쉿) (purmorphamine) 신호 (LIF-5i) 약효와 보충 LIF 3i 칵테일에 교양. 이 간단한 LIF 5i 적응 단계 크게 기존의 hPSC의 초기 클론 확장을 강화 하 고 그들 이후에 순진한 LIF-3i 혼자 대량 수량에 따라서 따기/subcloning 드문 N-hPSC에 대 한 필요성을 obviating와 복귀 허용 나중에 식민지입니다. LIF 5i 안정화 hPSCs 그 후에 유지 됩니다 LIF 3i 안티 apoptotic 분자의 필요 없이 혼자. 가장 중요 한 것은, LIF 3i 귀선 현저 하 게 그들의 혈통 액 유전자 발현을 감소 하 고 감독된 차별화의 인터 라인 변화를 일반적으로 지우기에 의해 기존의 hPSC의 광범위 한 레 퍼 토리의 기능 pluripotency를 향상 독립 hPSC 라인 사이 관찰. LIF 3i 돌 N-hPSC의 대표 characterizations 혈통 액 대isogenic hPSC의 기능 비교에 대 한 제공, 그리고 실험적인 전략 있습니다. 순진한 같은 상태 설명 되어 있습니다.

서론

2i (MEK/ERK 및 GSK3β 억제제) 문화 시스템 유형이 다른 혈 청 기반 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 문화 마우스 preimplantation epiblast1유사 pluripotency의 균일 한 접지 상태를 수정 하기 위해 원래 개발 되었다. 그러나, 2i는 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 라인2의 안정적인 유지 보수를 지원 하지 않습니다. 다양 한 성장 인자를 보충 하는 복잡 한 작은 분자와 유전자 변형 방법 최근 상 캡처 보고 된 유사한 인간의 순 같은 만능 분자 상태2. 그러나, 또한 이러한 메서드를 사용 하 여 만든 "순진한 같은" 상태 karyotypic 불안정성, epigenomic 결함 (예: 글로벌의 손실 부모의 게놈 각 인), 전시 또는 차별화 잠재적 장애인.

에 대비, GSK3β, ERK 및 tankyrase 신호 트리플 화학 억제의 칵테일 및 백혈병 금지 요인 (LIF-3i) 기존의 hPSC 라인3의 광범위 한 레 퍼 토리의 안정 순-같은 버전에 대 한 충분 한 했다. LIF 3i 되돌릴 순 hPSC (N hPSC) 정상적인 karyotypes를 유지 하 고 순진한 특정 인간의 preimplantation epiblast 유전자의 그들의 식을 증가 (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, 스텔라 (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). Phosphorylated STAT3 신호 증가, 포함 mESC 같은 순진한 pluripotency에 고유한 분자와 생 화 확 적인 특성의 배열과 LIF 3i 버전도 수 여 hPSC 감소 ERK 인 산화, 글로벌 5-methylcytosine 포장 소비재 hypomethylation, 배아 줄기 세포 (ESC)에서 게놈 넓은 포장 소비재 demethylation-특정 유전자 발기인, 및 지배적인 원심 OCT4 증강 사용. 또한, 다른 순진한 비해 귀착되 었 다 aberrantly hypomethylated 복귀 방법 각 게놈 loci, LIF 3i 돌 N-hPSC 찍힌된 CpG 패턴의 체계적인 손실 또는 DNA methyltransferase 식의 손실 없는 (예: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

기존의 인간 배아 줄기 세포 (hESC)와 지류 또는 E8 급지대 무료 조건에서 자란 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 광범위 한 배열의 직접 LIF 3i 문화 순진한 epiblast 같은 상태로 신속 하 고 대량 귀선 달성. 그러나, 직접 LIF 3i 순진한 귀선 일부 불안정 한 기존의 hPSC 라인 고유의 게놈 및 혈통 액 variabilities 유전자 다양 한 기증자 배경에서 발생 하는 때문에 효율적인 하지 수 있습니다.

따라서, LIF 3i 메서드의 유틸리티를 확대, stepwise 최적화 개발 되었다 고 여기 제시 수 있는 거의 모든 기존의 hESC 또는 transgene 무료 hiPSC 선 보편적인 순진한 귀선 교양 모이 통에. 이 단신 순진한 귀선 메서드 사용 하 여 두 추가 작은 분자 (LIF-5i) 단백질 키 니 아 제 (산림)와 소닉 더 헤지호그 (sHH) (약효와 LIF 3i 칵테일을 보완 하는 기존의 hPSC에서 일시적인 초기 문화 단계 purmorphamine) 신호입니다. LIF 5i에 기존의 hPSC의 한 초기 통과 이후 안정적인 LIF 3i 버전 대량 수량에서을 그들을 적응 시킨다. 초기 LIF 5i 적응은 크게 E8 또는 지류 (LIF-3i 혼자에서 후속 안정적, 지속적인 통로) 이전에 성장 하는 기존의 hPSC의 초기 단일 세포 클론 증식을 증대 시킵니다. 기존의 hPSC 라인 적응 먼저 LIF 5i에 하나의 통로를 용납 이후 대량 클론 뿌리고 LIF 3i 조건에서 순진한 되돌릴 셀의 따기 및 subcloning 드문 안정적인 식민지, 또는 일상적인 사용의 필요성을 obviates는 안티-apoptotic 분자 또는 단백질으로 관련 된 키 (바위) 억제제.

LIF 3i 메서드는 성공적으로 안정적으로 확장 하 고의 광범위 한 레 퍼 토리를 유지 고용 되었습니다 > 30 독립, 유전으로 다양 한 기존의 hPSC 라인 > 10-30 구절 중 비 효소 또는 효소 분리 방법을 사용 하 여 고 염색체의 유도의 증거 없이 또는 epigenomic 이상, 찍힌된 유전자 loci에서 이상 포함 한. 또한, 순차 LIF-5i/LIF-3i 문화 유일한 순진한 복귀 방법입니다 지금까지 보고 그들의 혈통 액 유전자 발현을 감소 하 여 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리의 기능 pluripotency를 개선 하 고 극적으로 개선 하는 그들의 multipotent 차별화 힘. 고유의 LIF 3i 순진한 복귀 방법 지웁니다 환승 혈통 액, 기존의 hPSC 라인의 차별화의 다양성 그리고 재생 의학 및 세포 치료에 응용 프로그램의 좋은 유틸리티.

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프로토콜

모든 동물 절차 동물 관리 지침 및 프로토콜 존스 홉킨스 학교의 의학 연구소 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC)의 승인에 따라 수행 했다.

1. 준비 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF)의 피더 종속 기존 (hESC 매체/MEF)에 대 한 순진한 되돌릴 또는 (LIF 3i 매체/MEF) hPSC 문화

  1. 구입 또는 DR4 하이브리드 E13.5 마우스 배아 다음 게시 프로토콜4x CF1 또는 CF1 MEF 지류의 사내 낮은 통로 공급 준비.
    1. 낮은 통로 (p1-p2) MEF 문화 사전 (대 한 긴 기간 저장) cryopreserve 또는 (최대 6 개월)에 대 한 사후 조사 및 액체 질소가 게 앞4에서 설명한.
    2. 비추는 (5000 rad)는 γ-또는 X-레이-irradiator를 사용 하 여 p5 아래 확장 된 MEF 대량 저장용 단기 (6 개월 미만)는 초 저온 냉동 고에서-80 ° C에서 1.5 x 10에서 aliquots 유리병 당6 셀을 준비 하 고.
    3. 1.2 x 10 접시6 (갓 비 cryopreserved 반구)와 1.5 x 106 (반구 cryopreserved) MEF 아래 설명 된 대로 급지대 문화를 준비 하기 위한 하나의 6-잘 gelatinized 접시 당.
  2. 생물 안전 캐비닛에 각 음에 살 균 0.1% 젤라틴 솔루션의 1.5 mL를 추가 하 여 6-잘 마른 조직 문화 취급 판 젤라틴 코팅을 준비 합니다.
  3. 적어도 1 시간 동안 37 ° C에 판 젤라틴 코팅을 품 어 나 실험실 공동2 인큐베이터에서 밤새.
  4. 다음 날, 낮은 통로 (예를 들어, P2 p 4) DMSO cryopreserved 하 고 조사를 해 동 (5000 rad) MEF는 단계에 따라 아래에 표시 된.
    참고: 비-반구 MEF 해야 해 동, 확장, 수 있으며 사용 직전 반구.
  5. 37 ° C 물 욕조에 cryopreserved MEF 약 수를 놓습니다. 녹고, 에탄올 튜브 소독 고 즉시 biosafety 내각 (예: 전송 1 mL DMSO MEF 약 수 살 균 15 mL에 9 mL MEF 매체로 내에서 MEF 매체 (표 1)와 적어도 10 DMSO cryoprotectant 희석 원뿔).
  6. 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 5 분 동안 200 x g 에 희석된 MEF 셀 원심
  7. Biosafety 내각에서 발음 하 고 셀 무료 상쾌한 삭제 한 1-2 mL 신선한 MEF 매체에 셀 펠 릿 resuspend.
  8. 부드럽게 젤라틴 솔루션을 삭제 하 고 위에 표시 된 대로 다시 gelatinized 6 잘 플레이트의 각 음을 MEF 중간에 중단 하는 MEF의 2 개 mL를 추가 합니다. 수 MEF 전지와 접시 1.2 x 106 (갓 비 cryopreserved 반구) 또는 1.5 x 106 (반구 cryopreserved) MEF 한 6-잘 gelatinized 접시 당.
    참고: 캐비닛 biosafety에 CO2 배양 기에서 전송 되는 모든 세포 배양 배지 에탄올 살포 종이로 부드럽게 닦 일 수 있다 하지만 해야 하지 직접 살포 될에 70% 에탄올 솔루션을 우물에 에탄올 보급을 피하기 위해.
  9. 사용 하기 전에 첨부 파일을 허용 하도록 MEF 플레이트 37 ° c (5% CO2, 습 한 분위기) 실험실 CO2 배양 기에서 하룻밤을 품 어.

2. 대량 간단한 LIF-5i 적응 단계 후속 순진한 귀선에 대 한 기존의 hPSC 문화의 안정화

  1. 처음 LIF-5i/LIF-3i 복귀 전에 G 밴딩에 의해 정상적인 karyotype 소지에 대 한 모든 기존의 hPSC 라인을 확인 합니다.
    참고: 높은 통행 기존의 hPSC 라인의 LIF 3i 귀선 (예., P > 40-50) 때문에 이러한 문화에 부정적인 영향을 줄 수의 안정적, 효율적이 고 대량 LIF 3i 귀선 액, 게놈 착오 항구 이미 수 있습니다 피해 야 한다 convetional hPSC 라인입니다.
  2. 유지 하 고 (제 1 항에 명시 된) 대로 MEF 기반 문화 시스템, 또는 (탐정의 찾아보십시오) 급지대 무료 문화 시스템에 유효한 정상적인 karyotypes 기존의 hPSC 문화를 확장.
    참고: 두 지류 종속 hPSC/MEF cocultures (예: hESC 매체 (표 1) 4-10 ng/mL bFGF 보충) 또는 급지대 무료 (예., E8 5 또는 mTSER 6 미디어 (제조 업체의 지침에 따라 vitronectin 코팅 접시) 방법은 LIF-5i/LIF-3i/MEF 시스템 (그림 1)를 사용 하 여 대량 순진한 복귀와 호환 됩니다. 비 효소 메서드는 복귀에 대 한 그들을 준비 하기 전에 기존의 hPSC의 뿌리고에 대 한 선호. LIF 5i와 LIF 3i 미디어 공식 항생제 또는 항진균 성 대리인을 포함 하지 않습니다. Biosafety 내각 불 임 및 유지 보수에 대 한 표준 작업 규칙을 피하기 위해 어떤 세균 이나 곰 팡이 오염 엄격 하 게 관찰 될 것으로 예상 된다.
  3. MEF 기반 문화 시스템, 적어도 하루 전에 뿌리고 LIF 5i 적응 기존의 hPSC 문화의 섹션 1에서 설명한 대로 gelatinized 6 잘 플레이트에서 MEF 지류를 준비 합니다.
  4. 기존의 hPSC 문화 50 %confluency (즉, 초기 도금 후 3-5 일)에 도달 했습니다, 후 바꿉니다 표준 hESC 문화 매체 LIF 5i 매체 (2 mL 당 잘; 표 1)입니다.
    참고: 캐비닛 biosafety에 다음이 단계를 수행 합니다.
  5. 문화 고 최대 2 일 동안 LIF 5i에 CO2 인큐베이터 (5% CO2, 습 한 분위기)에서 기존 hPSC/MEF를 유지 합니다. LIF 5i 매체 매일 그들의 연속적인 통행 및 LIF 3i에 안정적인 복귀에 대 한 적응을 변경 합니다.
  6. 또는, 기존의 급지대 무료 문화 (예를 들어, e 8에)에 대 한 문화 hPSC LIF 5i에만 뿌리고 다음날 아침 전에 하룻밤.
    참고: LIF 5i와 LIF 3i 문화 모두 유지할 수 있습니다 대기 (21% O2) 또는 생리 (5% O2) 산소 수준 (5% CO2, 습 한 분위기) CO2 배양 기에서.
  7. 뿌리고, 이전 문화 접시 biosafety 내각에서 LIF 5i 적응 기존의 hPSC, PBS와 한 번 씻어 놓고 각 잘 하 셀 분리 시 약의 1 mL를 추가 합니다. CO2 배양 기에서 37 ° C에서 5 분 동안 incubate 그리고 biosafety 내각에서 다시 단일 세포 현 탁 액에는 피 펫으로 부드럽게 triturate.
    참고: 비 효소 분리 버퍼 또는 단일 셀 뿌리고 준비 사용할 수 있습니다.
  8. HESC 매체 (적어도 2-fold 희석) 살 균 15 mL 원뿔 튜브에에서 세포 현 탁 액을 수집 하 고 부드럽게 세포를 단일 세포 현 탁 액 pipetting으로 triturate.
  9. 5 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuge, aspirate/삭제 상쾌한, 그리고 biosafety 캐비닛에 LIF 5i 매체의 1-2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  10. PBS (6-잘 접시에 잘 당 2 mL)로 두 번 중 도금된 MEF 접시를 세척 하 고 1-2 x 106 셀 (2 mL LIF 5i 매체) PBS 씻어 MEF 접시의 1에 배포.
  11. 조정 하 고 각 개별 hPSC 라인 replating 효율성 높은 변수 수 순진한 되돌릴 수에 대 한 초기 도금 밀도 최적화. (5% CO2, 습 한 분위기) CO2 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
    참고: 안티 apoptotic 시 약의 사용은 권장 하지 않습니다 대부분의 hPSC 라인에 대 한이 방법으로. LIF 5i 시스템은 이미 상당히 기존의 hPSC 라인의 초기 대량 클론 다시 도금 효율성을 향상 시킵니다. 그러나, 바위 억제제의 한 번만 사용 (5-10 μ M Y-27632) 추가 성향으로 일부 불안정 한 혈통 액 hPSC 라인에 대 한 첫 대목에서 기존의 hPSC 문화의 초기 LIF 5i 클론 다시 도금 효율을 향상 시킬 수 있습니다 자연 감 별 법입니다.
  12. 해리 기존의 hPSC에 LIF-5i에의 한 잘 전송 급지대 무료 문화 (예를 들어, E8)에서 직접 시작 하는 경우 한 MEF 도금 잘 (즉, 1:1 통로) 반구.
  13. 다음 날, 부드럽게 연결 되지 않은 모든 셀 리프트, 매체 발음 접시 소용돌이 (PBS 세척은 선택 사항) LIF 5i 매체의 2 개 mL를 바꿉니다. Biosafety 캐비닛 3-5 일 동안 매일 또는 세포는 60-70% 합칠 (그림 1) 때까지이 단계를 수행 합니다. (5% CO2, 습 한 분위기) CO2 인큐베이터에 접시를 놓습니다.

3. 장기 유지 관리 및 N-hPSC LIF 3i 매체에서의 확장

  1. 초기 LIF 5i 적응, 다음 이후의 안정적인 LIF 3i 문화 biosafety 캐비닛, 또는 문화 60-70% 합칠 (그림 1)이 될 때 3-4 일 마다 통로.
    참고: LIF 3i 문화 필요로 엄격한 유지 보수 및 장기간된 문화에서 높은 confluency/세포 밀도 도달 N-hPSC 문화 허용 (예., > 4 일) 이후 클론 다시 도금 효율 감소 및 자발적인 촉진 감 별 법입니다.
  2. Biosafety 내각에서 문화 매체를 삭제 하 고 각 씻어 부드럽게 PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 LIF-5i/LIF-3i 문화의 잘. PBS를 무시 하 고 세포 분리 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. CO2 인큐베이터 (5% CO2, 습 한 분위기)에서 37 ° C에서 5 분 동안 품 어.
  3. 세포 현 탁 액을 수집, hESC 매체 추가 (억제제 또는 성장 인자 (표 1); 없이 적어도 2-fold 희석) 하 모든 hPSC를 복구 하 고 부드럽게 세포를 단일 세포 현 탁 액 pipetting으로 triturate. 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 정지를 전송.
  4. 5 분 동안 300 g에서 centrifuge 및 aspirate/삭제는 상쾌한. 다시 LIF 3i 매체에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  5. 플레이트 ~ 2 잘 당 105 셀 x LIF 3i 문화의 일상적인 뿌리고 위한 gelatinized 6 잘 플레이트에 비친된 MEF에. 초기 LIF 5i 적응 문화권 LIF-3i/MEF에 처음 높은 밀도 (4 x 105 셀/잘) 첫 대목 전에 접시.
  6. 다시 접시 그리고 LIF 5i 적응 hPSC 신선한 PBS 씻어 비친된 MEF 급지대 접시에 (위와 같이 전날 준비) LIF 3i 매체에 배포. LIF 3i 매체 매일 교체 합니다.
  7. 최소에 대 한 통행 N-hPSC 4-7 연속 대량 LIF 3i 중간 사전 기능 연구 또는 cryopreservation N hPSC의 사용에에서 통행. N-hPSC의 구절의 번호를 기록 기존의 또는 LIF 3i 미디어.
    참고: 높은 통행의 LIF 3i 버전 (예: > p40) 혈통 액, 기존의 hPSC 라인은 권장 하지 않습니다. 노력 그들은 사용할 수 있는 가장 낮은 가능한 통로에 기존의 hPSC 라인 복귀 하 여야 한다. 또한, 같은 N-hPSC 문화 때문에 장기간된 클론 세포 문화 선택 karyotypically 비정상적인 클론 항구 수 있습니다 이후 10 LIF 3i 구절 보다 큰 받은 LIF 3i 돌 hPSC 사용 하 여 기능 연구에 대 한 권장 하지 않습니다. 경우 낮은 통로 기존의 hPSC 라인의 신선한 LIF-5i/LIF-3i reversions 기능 연구에 대 한 실시 한다 N-hPSC와의 주식 < LIF 3i 10 구절은 사용할 수 없습니다.

4. cryopreservation 및 LIF 3i 돌 N-hPSC의 재개

  1. 기능 연구 또는 장기 cryopreservation 사용 하기 전에, 위에 표시 된 대로 되돌린된 N-LIF 3i에 적어도 5-7 구절에 대 한 hPSC를 확장 합니다. 기존의 조건 및 각 cryopreserved 유리병에 LIF 3i 조건 구절의 번호를 기록 하십시오.
    참고: 초과 LIF 3i 돌 N hPSC 기능 분석에 사용 되지 수 각 통로에 cryopreserved 하지만 낮은 후 귀선 구절의 동결 (예:., < p3) 가난한 사람, 또는 높은 가변 후 재개 복구 효율성에 발생할 수 있습니다.
  2. Biosafety 내각에 문화 매체를 발음 하 고, PBS (잘 당 2 mL)에 셀을 세척 하 고, PBS를 발음 한 세포 분리 솔루션 (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 단일 셀에 hPSC 식민지를 분리. CO2 인큐베이터 (5% CO2, 습 한 분위기)에서 37 ° C에서 5 분 동안 접시를 놓습니다. (2-fold) LIF 3i 매체와 세포 분리 솔루션을 희석 하 고, 살 균 15 ml 원뿔 hPSC를 수집 하 고 5 분 동안 200 x g 에서 세포를 원심 한 LIF 3i 매체 (잘 상응 당 1-2 mL)에 셀 펠 릿 resuspend. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
  3. LIF 3i 매체 (200 x g 5 분)에서 N-hPSC 원심 및 냉동 솔루션 (표 2), biosafety 내각에서 셀 1 x 10 이상6 셀/mL의 조밀도에 resuspend.
  4. 장기 저장 극저온 관으로 셀을 전송 하 고 느린 냉동 컨테이너에 배치. -80 ° C 냉장고에 하룻밤 동결을 샘플 수 있습니다.
  5. 다음 날, 장기 저장을 위한 액체 질소 냉동 고에는 cryovials를 전송 합니다.
  6. 녹고, 배치 냉동된 유리병 ~ 2 분 Sterilize 유리병 (즉, 에탄올 스프레이)에 대 한 37 ° C 물 목욕으로, hPSC 살 균 15 mL 원뿔에 전송 하 고 천천히 5 μ M의 보충 셀 사진에서 hESC 매체 (표 1) 희석 로 관련 된 단백질 키 니 아 제 (바위) 억제제 Y-27632 캐비닛 메 마른 생물 안전 후드 내에서.
  7. 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리기. Biosafety 내각에서 삭제 셀 무료 상쾌한 고 LIF 3i 매체 (1-2 mL) 5 μ M 바위 억제제 Y-27632 보충에 셀 펠 릿 resuspend.
    참고: Y-27632의 가난한 후 녹고 복구 효율성 (그림 2)에서 발생 합니다.
  8. PBS 씻어 MEF 도금 우물에 LIF-3i/ROCK 억제제에 resuspended 해 동된 셀을 전송 합니다. 병 당 1 x 106 세포의 밀도에서 LIF 3i 문화 cryopreserve 녹여 gelatinized 6 잘 플레이트의 한 잘 모이 통에이 튜브의 각.
  9. 다음 날로 키 니 아 제 억제 물 없이 일반 LIF 3i 중간 확장 시작.

5. 피더 제거 N hPSC 샘플의 컬렉션에 대 한

  1. LIF-3i/MEF (또는 기존의 hESC/MEF)에서 샘플 문화 준비를 (즉, 유전자 발현에 대 한 (예를 들어, 양적 RT-PCR, microarrays) 또는 단백질 (예: 서쪽 오 점) 분석을 사용 하 여 MEF 지류에서 LIF 3i 문화 고갈 마그네틱 활성화 셀 정렬 ()로 맥 안티-TRA-1-81 항 체 코팅 제조 업체의 프로토콜에 따라 microbeads.
  2. 아래 설명 된 대로 또는 고갈 지류의 문화를 다음과 같은 간단한 사전 도금 메서드를 사용 합니다.
  3. 메 마른 생물 안전 후드 캐비닛, 셀 무료 상쾌한, 잘 당 2 mL 살 균 PBS 가진 펠 릿을 세척. 세포 분리 솔루션 (1 mL/음)를 사용 하 여 부착 LIF-3i/MEF 문화를 분리 합니다. CO2 인큐베이터 (5% CO2, 습 한 분위기)에서 5 분 동안 품 어. HPSC 살 균 15 ml 원뿔을 수집 합니다. 워시 2-fold에서 hESC 매체, 살 균 15 mL 원뿔 및 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리기로 전송 셀.
  4. Biosafety 내각에서 다시 LIF 3i 매체의 2 mL에 LIF-3i/MEF 해리 셀의 각 음을 중단 하 고 직접 갓 0.1% 젤라틴으로 코팅 6 잘 플레이트의 새로운 우물에 전송.
  5. CO2 인큐베이터 (5% CO2, 습 한 분위기)에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 hPSC 셀 LIF-3i/MEF를 품 어. 비 부착 한 세포 새로운 원뿔 튜브에 피 펫을 수집 합니다. 부드럽게 각 잘 하 hESC 매체의 2 개 mL를 추가 하 고는 나머지 비 부착 한 세포를 수집 소용돌이.
    참고: 방사능된 MEF의 대부분에 연결 됩니다 1 h에서 gelatinized 접시에에서는 hPSC의 대부분을 떠나.
  6. 결합 하 고 5 분 PBS에 세척에 대 한 300 x g 에서 세포를 원심. 스냅-액 셀 펠 릿 액체 질소에 원심, 후 또는 또는 다운스트림 단백질 또는 핵 산 분석 (그림 2B)와 호환 되는 lysing 버퍼에 다시 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  7. LIF 3i hPSC 라인 일치 기존의 끝났다 isogenic hPSC 컨트롤의 characterizations을 수행 합니다.
    참고: 때문에 본질적인 가변성 사이 고 끝났다 문화 안에서 관련 컨트롤 일치 timepoint 문화 또는 순진한 복귀 이전에 준비 된다. 자세한 프로토콜 및 다운스트림 immunofluorescent bioimaging에 대 한 자료 흐름 cytometry, 부 럽, 유전자 발현 (RT-PCR 분석 실험 및 microarrays), 메 틸 화 연구 (점 오 점, CpG 메 틸 화 microarray), OCT4 인접과 원심 증강 우세 기자 분석 실험 및 신호 전달 억제제 분석 제공 됩니다 다른 곳3.

6. 게시 순진한 귀선: 게놈 무결성 유효성 검사와 보존의 부모의 인쇄물 LIF 3i 돌 N-hPSC 기능 분석 실험에서 사용 하기 전에

  1. LIF-5i/LIF-3i 복귀를 시작 하기 전에 정상적인 karyotype (예를 들어, 게시 된 방법 7을 사용 하 여 밴드 Giemsa 얼룩 분석)의 소유 물에 대 한 시작 끝났다, 기존의 hPSC 문화를 화면.
    참고:이 비정상적인 게놈 변경 artefactual 선택적 생존 이점을 클론 LIF 3i 조건에서 운전 수는 항구 수 있습니다 기존의 hPSC 인구를 제거 하는.
  2. 최적의 결과 위해 갓 복귀 기존의 hPSC 기능 연구에 그들의 사용에 몇 주 이전에 LIF 3i와 순진한 같은 상태로 문화 또는 차별화를 감독.
    참고: 루틴 LIF 3i 10 구절 다음 순진한 귀선은 권장 하지 않습니다에 대 한 조건에서 '유지 보수' 문화를 연장 한다. 일상적인 확장 및 유지 보수 hESC과 hiPSC의 전통적인 문화 시스템을 사용 하 여 수행 되어야 합니다 (예를 들어, E8, 또는 MEF/hESC bFGF와 중간).
  3. 정상의 보존 LIF 3i 복귀 후 5-7 구절 karyotypes에 대 한 사후 되돌린된 N hPSC 라인을 평가 (예., 밴드 Giemsa 얼룩 분석7또는 어떤 다른 방법의 선택).
  4. 선택의 DNA 메 틸 화 분석에 의해 정상적인 부모의 게놈 인쇄물의 보존에 대 한 모든 되돌린된 N hPSC 라인을 평가 (예를 들어, 프로토콜 CpG DNA microarray 분석 LIF 3i 돌 N-hPSC에서 부모의 인쇄물의 다른3 제공 됩니다 ) LIF 3i 버전의 5-10 구절 후.

7. LIF 3i 돌 N-hPSC를 사용 하 여 양적 감독된 차별화 분석 실험에 대 한 게시물 순진한 귀선: 실험 설계 지침

  1. 직접 추가 셀 문화 조작 없이 설립된 감독된 차별화 프로토콜에 LIF 3i N-hPSC를 사용 합니다.
    참고: 다시 프라이 (즉, N-hPSC를 다시 감독된 차별화 분석 실험에서 사용 하기 전에 기존의 끝났다 조건 변환) LIF 3i 방법 불필요 하 고 권장 하지 않습니다.
  2. 분석 결과의 영향에 대 한 제어 및 개별 hPSC 라인의 기능 테스트에서 가변성을 환승, 최소한 3 개의 hPSC와 독립적인 분화 프로토콜을 채용 하 여 계보 관련 차별화 potencies 크로스 확인 선 독립 유전 배경에서 파생 된 (즉, 여러 기증자 파생 된 hiPSC 및 hESC).
  3. 기능 비교에 대 한 설정 형제, 해당 통로 번호, 그리고 기존의 혈통 액을 동시에 같은 (isogenic) hPSC 줄에서 문화와 LIF 3i 되돌릴 hPSC 문화. 그들의 각각 미디어에 액/순 형제 isogenic hPSC 문화를 유지 (예., E8 vs. LIF-3i), 동시에 어떤 실험적인 바이어스 (그림 4)을 제거 하기 위해 동일한 차별화 프로토콜 및 재료를 사용 하 여 차별화.
  4. Isogenic 액 대 순 hPSC 비교, 조정 및 각 개별 차별화 분석 결과 대 한 초기 도금 밀도 최적화.
    참고: 신경 조상, 최종 endoderm LIF 3i 돌 N-hPSC의 hemato 내 피 감독된 차별화에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다 다른 곳 3. LIF 3i 돌 N-hPSC는 기존의 hPSC 보다 감독된 차별화 분석 실험에 더 강력한 증식 및 분화 용량을가지고. N hPSC는 일반적으로 기존의 hPSC 보다 낮은 초기 도금 농도 필요로 하 고 그들의 기존의 끝났다 hPSC 달리 대응 하지 않아도 다음 효소 그들의 클론 생존을 향상 시키기 위해 안티 apoptotic 시 약의 사용 차별화 분석 실험에서의 소화

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결과

이 프로토콜 두 지류 종속 및 급지대 독립적인 계보 됐다는 기존의 hPSC 문화 (그림 1)에서 LIF 3i와 효율적인 순진한 같은 버전을 최적화합니다. 자세한 프로토콜 설명 여기, LIF-3i 어느 급지대 또는 급지대 무료 기존의 hPSC 조건 (예: E8 매체)에서 시작에 개요 순차적 적응.

여러 기존 hESC LIF 3i 버전에 대 한 결과 대표 하 고 transgene 무료 hiPSC 라인 그림 1-3에 표시 됩니다. 이러한 일반적인 결과 상용 hESC 라인 H9, 유효성을 검사할 수 또는 상업적으로 사용할 수와 함께 혈액 파생 episomal hiPSC 라인 (6.2) Zambidis 실험실8

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토론

LIF 3i 시스템 인간의 pluripotent 줄기 세포 클래식 murine 2i 순진한 귀선 칵테일1 의 수정된 된 버전을 적용합니다. (이 혼자 2에서 확장할 수 없습니다) hPSC의 자기 갱신 tankyrase 억제제 XAV939 함께이 칵테일을 보완 하 여 LIF-2에서 안정 이다. LIF 3i 문화 대량 인간의 preimplantation epiblast3닮은 만능 상태로 기존의 hPSC의 효율적인 복구를 수 있습니다. HPSC에서 XAV939의 행동의 메커니즘은 복잡 한 가능성이 있지만 시너지 2i와 함께, 그들은 가능성이 포함 최소, 중요 한 안정화 및 WNT 경로3신호를 통해 hPSC 자기 갱신의 확대.

기존의 hPSC 문화는 일반적으로 높은 변수...

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공개 사항

생활 기술 및 존스 홉킨스 대학 (JHU) 사이의 라이선스 계약에 따라 닥터 Zambidis 줄기 세포의 라이센스에 대 한 대학에서 받은 특허권 사용료의 몫을 받을 권리가 있다. 이 계약의 약관 JHU 상충 정책에 따라 관리 합니다. 이 저자의 준수 데이터 및 자료 공유에 저널 정책 변경 하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 NIH/네이 (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB 스타인 혁신 상 수상는 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk 과학 포럼 상와 모 슬 리 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugatedBD Biosciences561716use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibodySigma AldrichHPA029708use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibodyAbcamab6276use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated BD Biosciences550315use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugatedeBioscience17-0319-42use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kitMiltenyi Biotec130-091-935
anti-NANOG antibodyAbcamab109250use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibodySigma AldrichHPA005455use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibodyCell Signaling4695use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibodyCell Signaling4370use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibodyCell Signaling9145use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylatedAgilentE0432use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated R&D SystemFAB1435Ause 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugatedR&D SystemNLLC1435Guse at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibodyCell Signaling9139use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibodyMilliporeMAB4388use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated R&D SystemNLLC4770Ruse at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0068use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0069use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560193use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560161use 10µL per assay (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3311
CellAdhere dilution bufferStemCell Technologies7183dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouseCharles river023
CHIR99021R&D SystemL5283reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope systemZeissLSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC lineThermo Fisher ScientificA18945also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well platesCorning3506
Countess  cell counting chamber slideThermo Fisher ScientificC10228
Countess automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
DR4 mouseThe Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) mediumStemCell Technologies5940
Fetal bovin serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ForskolinStemgent04-0025reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG1890-100Gresuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
mTeSR1 mediumStemCell Technologies85850
Nalgene cryogenic vialsThermo Fisher Scientific5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide SystemFisher Scientific154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBSUSB Corporation 19943
PD0325901Sigma AldrichPZ0162reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
PurmorphamineStemgent04-0009reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin APeprotechAF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4Peprotech120-05ETresupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF)Peprotech1

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