췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

요약

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

초록

격리 된 췌 장 독도 사용 하 여 실험은 당뇨병 연구를 위한 중요 하지만 독도 비싸고 한정 된 풍부의. 독도 포함 영향을 함수, 구조화 된 아키텍처에 혼합된 셀 인구 그리고 인간의 독도 널리 셀 형식 구성에서 변수. 교양된 독도 공부를 현재 자주 사용 되는 방법 분자 연구 수행 전체 독도, 총괄 한 이종 섬 세포 유형, 또는 현미경 또는 섬 건축을 방해 하는 분산 된 작은 섬 세포에 분자 연구에 포함 됩니다. Vivo에서 섬 연구, 파라핀 끼워 넣어진 췌 단면 네이티브 췌 장 환경에서 셀 관련 결과 평가 하기 위해 강력한 기술입니다. 여러 가지 이점을 제공할 것 이라고 파라핀 단면에 의해 후 문화 독도 공부: 같은 독도 (도 잠재적으로 정확한 같은 독도, 직렬 섹션을 사용 하 여), 셀 형식 관련 측정 및 유지 관리 기본에 여러 결과의 검출 섬-셀 및 셀 층 상호 작용 실험 노출 시 및 분석을 위해. 그러나, 기존 기술을 포함 고립 독도 후 비효율적인, 시간 소모, 소재의 손실에 수 그리 다 문화와 일반적으로 부적당 한 섬 숫자 결과 측정 하는 데 유용 해야 섹션을 생산. 임상 병 리 실험실 셀 블록 준비 시설 기초 연구 실험실에 대 한 허무 하 고 액세스할 수 있습니다. 우리는 강력한 수율 및 독도의 배포 섹션을 생성 하는 개선, 벤치 탑 메서드를 개발 했습니다. 고정된 독도 따뜻한 조직학 agarose 젤에 resuspended 하 고는 독도 평면에서 배포 되는 표준 유리 슬라이드에 플랫 디스크에 pipetted. 표준 탈수 후에 포함, 여러 (10 +) 4-5 µ m 섹션 같은 섬 블록에서 잘릴 수 있다. 이 메서드를 사용 하 여 마우스, 쥐, 인간 시리즈에 조직학 및 immunofluorescent 분석을 수행할 수 있습니다. 이것은 교양된 독도에서 셀 형식 관련, 건축이 그대로 결과 평가 하는 효과적인, 저렴 한, 시간-절약 접근.

서론

췌 장 독도 Langerhans, 인슐린, 순환의 유일한 소스는 당뇨병 mellitus를 공부 하는 수 사관에 대 한 중요 한 조직. 어떤 주어진된 유기 체에서 독도 가변 크기, 셀 유형 주파수, 및 건축^1,2,3있다. Vivo에서 구조와 췌 장 독도의 내 분 비 세포 구성 공부 하는 기존의 전략 췌 장 조직^4,5단면입니다. 콘텐츠의 전체 췌 장 세포의 작은 일부만 구성 하는 독도, 이후 고립 된 독도에 분자 연구 수행 됩니다. 비보 전 섬 문화 영양소에 대 한 응답을 테스트, 실험 유전자 변조 (transfection, 변환), 또는 실험적 치료 내 분 비 세포 생존, 확산, 및 기능을 조절 하는 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공 ^{5 , 6}.

섬 실험 비보 전 종종 전체 독도의 분자 연구 또는 단층^5,6에 성장 하는 분산 된 작은 섬 세포의 조직학 또는 분자 연구를 사용 하 여 분석 된다. 전체 독도의 분자 분석의 혼합과 세포 유형, 모든 개별 셀 형식을 추정 하는 경우 false 네거티브 또는 허위-긍정적인 결과 얻을 수 있는 심각한 경고를 소개 합니다. 이후 문화 현미경 검사 법에 대 한 coverslips에 셀 분산 셀 형식 관련 결과 측정, 있지만 섬 아키텍처, 개입에 대 한 응답을 변경할 수 있습니다 및 건축 관련 결과의 식별을 방해 방해. 또한, 일반적으로 단지 단일 결과 측정할 수 있다; 예를 들어 베타 세포 증식 및 동일한 조건 하에서 베타 세포 죽음을 측정, 두 개의 별도 실험 수행 해야 합니다. 이러한 방식을 간 섬 가변성, 분야에서 증가 관심의 영역에 눈도 있습니다. Cytometry 셀 형식 관련 분자 연구, 또는 단일 셀 RNA 연구에 의해 정렬 작은 섬 세포는 조직 풍부, 건축 근절, 그리고 일상적인 셀 문화 분석에 적합 하지 비싼, 시간이 걸리는 제한 하지만 우아한 ^{5 , 7}. 각 샘플에서 가져온 데이터 이며 단일 immunostaining⁸에 식별 가능한 결과 제한 confocal 영상 전체 마운트 immunostained 독도의 높은-품질 그대로 아키텍처 데이터를 제공 하지만 노동 집약, 이다.

-문화 전체 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하는 기능이이 관심사의 많은 주소 것 이다. 높은 비용, 낮은 풍부한 섬 조직 또는 인간 장기 기증자, 또는 독도 상태 게시물에 비보 또는 생체 외에서 실험 조작, 독특한 유전자 모델에서 귀중 한 있습니다. 같은 독도에서 여러 파라핀 섹션을 가져오는 동일한 실험에서 여러 셀 형식 관련, 그대로 건축 분석이 하게된다.

단면에 대 한 섬 펠 릿을 생성 하기 위해 기존 기술을 완벽 하지 않습니다. 조직학 최적화 agarose 어려운 과정⁹조각난 또는 작은 조직 샘플을 포함 하는 조직학 및 cytological 표본 처리에서 널리 이용 되는 수성 낮은 녹는점 젤입니다. 접근을 포함 한 섬 agarose microcentrifuge 튜브에서에 독도 일시 중단, 원심 작은 자료, agar 플러그를 검색 다음 처리 하 고^10,11단면에 대 한 포함입니다. 튜브의 아래쪽에서 응고 샘플을 추출 시간이 많이 걸리며 어려운, 샘플의 가끔 조각화 및 신체 상해의 위험입니다. 독도이 방법에서 얻은 단원의 부적절 한 섬 분포 선도 플러그의 끝에 집중 된다. 플러그의 둥근 바닥 복잡 포함 되도록 섬-가난한 지역 단면 제시 될 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 낮은 수율 및 결과 섹션에서 이멀전의 섬 유통 리드.

이 새로운 방법은 섬 섹션의 준비에 대 한 단순 하 고 향상 된 접근 이다. 독도 작은 볼륨에 집중 하 고 단일 평면에 독도와 작은 디스크를 현미경 슬라이드의 매끄러운 표면에 배치. Histogel-섬 디스크 파라핀 단축된 탈수 및 자일 렌 침투 프로토콜에 대 한 이후 처리 됩니다. Microfuge 관의 하단에 독도 집중, 이전 접근은 또한 비교로 수행 됩니다. 이 새로운 기술은 섹션, 각 섹션에서 독도의 유통 당 독도의 수율 향상과 카세트 섬 블록 전송 하는 데 시간이 적게 걸립니다. 이 기술은 유용 섬 생물학 또는 생산성을 극대화 하고자 하는 조직의 작은 조각을 공부 하는 다른 과학자의 기본 조직 아키텍처에서 단일 샘플에 여러 결과 측정 하 여 낮은 풍부 조직 사용.

프로토콜

동물 관련 된 모든 절차는 UMass 의료 학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다. 인간의 섬 연구는 인간을 대상의 사용을 포함 하지 않는 때문에 IRB 검토 또는 면제에 대 한 자격 하지 UMass 기관 검토 위원회에 의해 결정 했다.

1. 섬 격리와 문화

1. 독도 분리 하 고 외 분 비 및 ductal 조직 선택의 방법을 사용 하 여 오염에서 분리.
   참고:이 방법은 독도 콜라 ductal insufflation 및 Ficoll 분리¹² (설치류) 또는 통합 섬 배포 프로그램 (IIDP¹³, 인간)에서 후 선적 독도 격리를 사용 하 여 최적화 되었다. 독도 P200 micropipette로 뽑아서 했다.
2. 섬 형태를 최적화 하려면 독도 10 mL 완전 한 섬 매체 (와 10 %FBS, 페니실린/스, 5.5 mmol/L 포도 당 RPMI) 37 ° c.에 5% CO₂ 를 포함 하는 습도 챔버에 밤새 복구 허용 이 단계는 섹션을 얻이 필요가 없습니다,는 독도 더 그대로 복구 기간 후 ( 그림 2참조).

2. 섬 고정

1. 낮은 바인딩 P200 팁을 사용 하 여, 약 250 섬 등가물 (IEQ)¹³ 1.5 mL 낮은 바인딩 microfuge 관으로는 stereomicroscope에서 보정된 그리드를 사용 하 여 따. 낮은 바인딩 팁 및 튜브 섬 손실을 줄일.
2. 독도 microfuge 관의 바닥에 정착을 허용 합니다. 대부분 상쾌한 P200 피펫으로 팁, 어떤 독도 제거 하지 않도록 주의 복용 제거 합니다.
3. PBS의 1 mL를 추가 합니다. 속도 200 x g에 도달할 때까지 튜브 스윙 양동이 원심 분리기에 원심 고 스핀을 중단. 제거는 상쾌한. 2 세척의 총에 대 한 PBS 세척을 반복 합니다.
4. 10% 포 르 말린 용액 또는 갓 만든 4% paraformaldehyde 500 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실내 온도에 수정. 이 방법에서는 테스트 결과 대 한 이러한 종류의 고정 방식이 구별할 수 없었다. 짧은 고정 또한 수 있습니다; 원하는 결과 대 한 고정 기간을 최적화 하는 것이 좋습니다.
5. P200 팁 정착 액을 제거 합니다.
6. PBS의 1 mL를 추가 합니다. 속도 200 x g에 도달할 때까지 튜브를 원심 고 스핀을 중단. 제거는 상쾌한. 2 세척의 총에 대 한 PBS 세척을 반복 합니다.
7. 즉시 다음 단계를 진행 합니다.

3. 섬 디스크 (그림 1)의 준비

1. 처음 사용에 70 ° C에서 (예를 들어, Histogel) 젤을 녹여 고 aliquots 1.5 ml에서 장기 저장용 microfuge 관. Aliquot 볼륨 aliquots 다시 사용 될 수 있기 때문에 중요 한, 아니다.
2. 배치 microfuge 관 70 ° c.에 설정 열 블록에 젤 약 수를 포함 하 여 70 ° C에서 젤 (샘플 당 약 100 µ L)를 따뜻한
3. 1.5 mL 깨끗 microfuge 관으로 블루 agarose 구슬 (10 µ L 각 샘플)를 전송 합니다. 철저 하 게 pipetting 전에 구슬 resuspend.
   참고: 파란색 구슬 agarose 단추와 파라핀 블록에 포함 된 자료의 시각적 식별을 지원 하기 위해 독도와 혼합 됩니다. 사용 하는 파란 구슬 수 결과에 중요 한 하지만 과도 한 구슬 방지 (> 5 독도의 수 배) 섹션에서 독도의 최적의 배포를 허용 하도록.
4. 1 mL PBS와 함께 파란 구슬 두 번 씻는 다. 각 세척에 대 한 회전 구슬 800 x g에서 1 분. 두 번째 세척 후 10 µ L PBS, 여기서 n 은 샘플 튜브; 수 x (n+ 2) 구슬 resuspend 예를 들어 2 샘플 튜브, 구슬에 추가할 PBS 볼륨 40 µ L 것입니다.
5. 원심 microfuge 관 독도 (간단한 스핀 200 x g)을 포함 하 고는 상쾌한의 대부분을 제거 합니다. 가 위 또는 칼 10 µ L micropipette 팁의 끝을 잘라내어 각 샘플에 대 한 깨끗 한 팁을 사용 하 여 각 섬 튜브에 구슬의 10 µ L를 추가. ()을 피하기 위해 독도 잃고 혼합 하지 마십시오.
6. 독도 구슬 (200 x g 간단한 스핀) 원심. 포경 10 µ L micropipette 팁 가능한 많은 PBS를 제거 합니다.
7. 현미경 슬라이드 샘플 식별에 대 한 레이블을 지정 합니다. 2 ~ 3 샘플 각 슬라이드에 준비 될 수 있다. 따뜻하게 젤으로 열 블록 근처 벤치에 슬라이드를 놓습니다. 면도날 또는 위 샘플 당 20 µ L 낮은 바인딩 micropipette 팁 3 ~ 5의 끝을 잘라. 다른 하나에서 전환 급속 한 수 있도록 컷 팁 두 P20 micropipettes을 로드 합니다.
8. 첫 번째 micropipette를 사용 하 여, 추가 15-20 µ L 따뜻한 젤의 독도/구슬 microfuge 관; 즉시 혼합, 피하 거품; 형태로 슬라이드에 액체 한 천/독도/구슬 혼합물을 적용 한 < 1 cm 직경 디스크. 디스크 공간 외부 젤 링 슬라이드 가장자리 근처에 배치 (다음 단계). 부드럽게 몇 번 독도 비즈를 해결 하기 위해 슬라이드를 누릅니다.
9. 두 번째 micropipette를 사용 하 여 샘플 튜브를 따뜻한 젤의 20 µ L를 추가 합니다. 원본 디스크를 둘러싼 슬라이드에이 혼합물을 적용 다음 첫 번째 micropipette, 모든 나머지 독도/구슬, 응고, 시작 하는 경우 다시 열 블록에 온난화와 혼합 새로운 젤을 사용 하 여. 디스크는 원하는 크기와 두께 추가 미리 잘라 팁을 사용 하 여 필요에 따라 반복 합니다.
   참고: 외부 반지는 약간 두꺼운 경우 쉽습니다 gelled 디스크 처리. 일반적으로, 젤의 3 x 20 µ L은 충분 합니다. 이 단계 튜브 세척 하 여 독도의 손실을 최소화 하 고 섬-가난한 agarose 디스크 처리를 촉진 하기 위하여 디스크의 바깥쪽에 추가 됩니다.
10. 각 디스크를 개별적으로 준비 하 고 끊임없이 주의의 샘플 주문 각 슬라이드에 여러 개의 디스크를 삽입 하는 경우.
11. 10 분 동안 또는 젤 굳은 때까지 슬라이드 커버, 젖은 얼음의 평평한 표면에 놓습니다. 그것은 더 밖으로 마른 경우 유리에서 디스크를 밀어 어렵다입니다.
12. 레이블 처리/포함 조직 카세트 샘플 하나씩 연필로 생 검. 블루 종이 일로 방지를 슬라이드의 뒤쪽을 건조.
13. 유리에서 그것을 각 방향에 있는 디스크를 밀어 부드럽게 면도날의 무딘 가장자리를 사용 하 여. 때 그것은 쉽게 슬라이드, 파란 티슈 페이퍼에 현미경 슬라이드에서 디스크를 밀어 천천히. 디스크, 편평한 측, 종이에 직접 놓습니다.
14. 디스크 유지 평면, 방지 운동, 디스크, 카세트에 접힌된 종이에 놓고 카세트를 닫습니다 디스크 주위 종이 접어. 디스크 유리에서 깔끔하게 슬라이드 하지 않습니다, 경우 더 많은 젤을 추가 및/또는 몇 가지 더 많은 분 동안 얼음에 슬라이드를 반환.
15. 비 커에 PBS에 카세트 잠수함 최적의 형태에 대 한 같은 날을 포함 하는 파라핀 프로세스.

4. 파라핀 포함

참고: 프로세스 섬 젤 아래 설명 된 대로 약식된 탈수 시리즈를 사용 하 여 파라핀 블록을 디스크. 이 기술은 자동화 된 프로세서를 사용 하 여 최적화 되었습니다 하지만 수동 처리 비슷한 결과 생산 한다.

1. 15 분 동안 85%의 에탄올에 카세트를 담가.
2. 15 분 동안 95% 에탄올에 카세트를 담가.
3. 15 분 동안 100% 에탄올에 카세트를 담가. 3 세척의 총 두 번 반복 합니다.
4. 15 분 동안 크 실 렌에 카세트를 담가. 3 세척의 총 두 번 반복 합니다.
5. 카세트 녹은 파라핀에 10 분 동안 담가.
6. 10-30 분에 대 한 신선한 녹은 파라핀에 카세트를 전송.
7. 신중 하 게 카세트를 열고 파란색 종이 풀 다. 종이를 평평한 표면 반대 했다 그의 추적을 유지 하는 젤 디스크를 제거 합니다. 아래로, 절단 표면에 평행한 평면 (섬 포함) 표면으로 작은 몰드에 디스크를 포함 합니다. 플러그인에 대 한 신중 하 게 카세트에서 그것을 제거 하 고 절단 표면 쪽으로 향하고 함께 작은 몰드에 포함.

5입니다. 파라핀 단면화 및 얼룩

1. 슬라이드 레이블 순차적으로 직렬 섹션 필요한 경우.
2. 경험 있는 histotechnologist에 의해 잘라 5 µ m 파라핀 단면도 있다. 수율을 최대화 하기 위해 물자를 포함 하는 모든 섹션을 저장 합니다. 일반적으로, 20 섹션 수집 자료의 대부분의 캡처 수 있습니다.
3. 실 온에서 섹션을 저장 합니다. 섹션 (예: H & E) 일상적인 조직학 얼룩과 면역 형광 검사 (예: 인슐린, 글 루카 곤 및 DAPI) 의무가 있습니다. 필요한 경우 다른 항 원에 대 한 고정을 최적화 합니다.

결과

젤 디스크를 준비 하는 단계의 그림된 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 이 젤 디스크 메서드 결과 결과의 의미 있는 정량화를 허용 하는 단일 평면에 배포 하는 독도의 충분 한 수를 포함 하는 파라핀 섹션에서. 그림 2 는 독도 섹션 당 캡처 수를 설명 하기 위해 결과 섹션의 낮은 확대 이미지. 일반적으로, > 250 IEQ 절차, 사용 되었다 때 각 섹션에서 35 독도 했다 표시 하 고 > 10 섹션 (4-5 µ m) 독도 포함 하는 각 샘플에서 가져온. 독도 절차에 대 한 사용의 수를 증가 섹션에서 독도의 수 증가. 섹션에서 독도 구조적으로 다양 하 고 그 새로운 개념을 지 원하는 다양 한 크기의 고 기술 간 섬 차이에 장 님 보다는 섹션을 사용 하 여으로 데이터 흥미로운 얻을 수 있습니다. 방법은 동등 하 게 일 잘 설치류 독도 연구소 (쥐, 마우스)에...

토론

이 수정된 젤 디스크-기반 포함 메서드는 단순, 저렴 한, 및 섹션 당 독도의 높은 수율을 생성 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 평면 유리 표면에 젤 디스크 구성 동등한 배급에 퍼지는 독도 용이 하 게 잘 정의 된 영역. 평면 디스크에 독도 확산 섹션의 비행기에 많은 독도 배치 하 고, 수확량을 최적화 하 고 적은 독도 사용할 수 있도록의 이점을 제공 합니다. 디스크 두께 수 사관의 요구에 맞게 조정할 수 있습니다. 여러 섹션을 얻을 수 있습니다, 이후 같은 독도의 직렬 섹션 분석할 수 있습니다, 같은 실험 샘플에 측정할 수 있는 뚜렷한 결과의 수를 증가. 여기에 최적화 된 췌 장 독도 대 한, 비록 기술은 작은 조각, 어렵다면 자연, 또는 점성 샘플 과정 그렇지 않으면 어려울 것 이다을 포함 한 다른 낮은 풍부한 자료에 적용할 수 있습니다. 이 메서드는 신선한 고정 독도 대 한 최적화 하 고 다른 유형의 이전 냉동된 독도 등의 재료에 대 한 테스트 되지 않았습니다. 이 섹션은 또한 DNA 또는 RNA를 검출 하기 위하여 교...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL Eppendorf 튜브	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic 스타터 키트	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μ L)	Genesee Scientific	24-430
낮은 바인딩 팁(200 μ L)	Genesee Scientific	24-412
낮은 바인딩 팁(20 μ L)	Genesee Scientific	24-404
낮은 바인딩 팁 (10 μ L)	Genesee Scientific	24-401
10% 포르말린 용액	시그마	HT501128
파라포름알데히드	전자 현미경 과학	15710-S
히트블록	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
아가로스 블루 비즈- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco의 PBS	Life Technologies	14190-144
조직 처리 카세트	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 조직 처리기	Thermo-Shandon LLC
에탄올 200 증거	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
파라핀	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
인슐린 항체	DAKO	A0564
글루카곤 항체	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 2차 항체	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 2차 항체	Life technologies	A11001