췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

요약

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

초록

격리 된 췌 장 독도 사용 하 여 실험은 당뇨병 연구를 위한 중요 하지만 독도 비싸고 한정 된 풍부의. 독도 포함 영향을 함수, 구조화 된 아키텍처에 혼합된 셀 인구 그리고 인간의 독도 널리 셀 형식 구성에서 변수. 교양된 독도 공부를 현재 자주 사용 되는 방법 분자 연구 수행 전체 독도, 총괄 한 이종 섬 세포 유형, 또는 현미경 또는 섬 건축을 방해 하는 분산 된 작은 섬 세포에 분자 연구에 포함 됩니다. Vivo에서 섬 연구, 파라핀 끼워 넣어진 췌 단면 네이티브 췌 장 환경에서 셀 관련 결과 평가 하기 위해 강력한 기술입니다. 여러 가지 이점을 제공할 것 이라고 파라핀 단면에 의해 후 문화 독도 공부: 같은 독도 (도 잠재적으로 정확한 같은 독도, 직렬 섹션을 사용 하 여), 셀 형식 관련 측정 및 유지 관리 기본에 여러 결과의 검출 섬-셀 및 셀 층 상호 작용 실험 노출 시 및 분석을 위해. 그러나, 기존 기술을 포함 고립 독도 후 비효율적인, 시간 소모, 소재의 손실에 수 그리 다 문화와 일반적으로 부적당 한 섬 숫자 결과 측정 하는 데 유용 해야 섹션을 생산. 임상 병 리 실험실 셀 블록 준비 시설 기초 연구 실험실에 대 한 허무 하 고 액세스할 수 있습니다. 우리는 강력한 수율 및 독도의 배포 섹션을 생성 하는 개선, 벤치 탑 메서드를 개발 했습니다. 고정된 독도 따뜻한 조직학 agarose 젤에 resuspended 하 고는 독도 평면에서 배포 되는 표준 유리 슬라이드에 플랫 디스크에 pipetted. 표준 탈수 후에 포함, 여러 (10 +) 4-5 µ m 섹션 같은 섬 블록에서 잘릴 수 있다. 이 메서드를 사용 하 여 마우스, 쥐, 인간 시리즈에 조직학 및 immunofluorescent 분석을 수행할 수 있습니다. 이것은 교양된 독도에서 셀 형식 관련, 건축이 그대로 결과 평가 하는 효과적인, 저렴 한, 시간-절약 접근.

서론

췌 장 독도 Langerhans, 인슐린, 순환의 유일한 소스는 당뇨병 mellitus를 공부 하는 수 사관에 대 한 중요 한 조직. 어떤 주어진된 유기 체에서 독도 가변 크기, 셀 유형 주파수, 및 건축^1,2,3있다. Vivo에서 구조와 췌 장 독도의 내 분 비 세포 구성 공부 하는 기존의 전략 췌 장 조직^4,5단면입니다. 콘텐츠의 전체 췌 장 세포의 작은 일부만 구성 하는 독도, 이후 고립 된 독도에 분자 연구 수행 됩니다. 비보 전 섬 문화 영양소에 대 한 응답을 테스트, 실험 유전자 변조 (transfection, 변환), 또는 실험적 치료 내 분 비 세포 생존, 확산, 및 기능을 조절 하는 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공 ^{5 , 6}.

섬 실험 비보 전 종종 전체 독도의 분자 연구 또는 단층

프로토콜

동물 관련 된 모든 절차는 UMass 의료 학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다. 인간의 섬 연구는 인간을 대상의 사용을 포함 하지 않는 때문에 IRB 검토 또는 면제에 대 한 자격 하지 UMass 기관 검토 위원회에 의해 결정 했다.

1. 섬 격리와 문화

1. 독도 분리 하 고 외 분 비 및 ductal 조직 선택의 방법을 사용 하 여 오염에서 분리.
   참고:이 방법은 독도 콜라 ductal insufflation 및 Ficoll 분리¹² (설치류) 또는 통합 섬 배포 프로그램 (IIDP¹³, 인간)에서 후 선적 독도 격리를 사용 하 여 최적화 되었다. 독도 P200 micropipette로 뽑아서 했다.
2. 섬 형태를 최적화 하려면 독도 10 mL 완전 한 섬 매체 (와 10 %FBS, 페니실린/스, 5.5 mmol/L 포도 당 RPMI) 37 ° c.에 5% CO₂ 를 포함 하는 습도 챔버에 밤새 복구 허용 이 단계는 섹션을 얻이 필요가 없습니다,는 독도 더 그대로 복구 기간 후 ( 그림 2참조).

결과

젤 디스크를 준비 하는 단계의 그림된 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 이 젤 디스크 메서드 결과 결과의 의미 있는 정량화를 허용 하는 단일 평면에 배포 하는 독도의 충분 한 수를 포함 하는 파라핀 섹션에서. 그림 2 는 독도 섹션 당 캡처 수를 설명 하기 위해 결과 섹션의 낮은 확대 이미지. 일반적으로, > 250 IEQ 절차, 사용 되었다 때 각 섹션에서 35 독도 했다 표시 하 고 > 10 섹션 (4-5 µ m) 독도 포함 하는 각 샘플에서 가져온. 독도 절차에 대 한 사용의 수를 증가 섹션에서 독도의 수 증가. 섹션에서 독도 구조적으로 다양 하 고 그 새로운 개념을 지 원하는 다양 한 크기의 고 기술 간 섬 차이에 장 님 보다는 섹션을 사용 하 여으로 데이터 흥미로운 얻을 수 있습니다. 방법은 동등 하 게 일 잘 설치류 독도 연구소 (쥐, 마우스)에.......

토론

이 수정된 젤 디스크-기반 포함 메서드는 단순, 저렴 한, 및 섹션 당 독도의 높은 수율을 생성 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 평면 유리 표면에 젤 디스크 구성 동등한 배급에 퍼지는 독도 용이 하 게 잘 정의 된 영역. 평면 디스크에 독도 확산 섹션의 비행기에 많은 독도 배치 하 고, 수확량을 최적화 하 고 적은 독도 사용할 수 있도록의 이점을 제공 합니다. 디스크 두께 수 사관의 요구에 맞게 조정할 수 있습니다. 여러 섹션을 얻을 수 있습니다, 이후 같은 독도의 직렬 섹션 분석할 수 있습니다, 같은 실험 샘플에 측정할 수 있는 뚜렷한 결과의 수를 증가. 여기에 최적화 된 췌 장 독도 대 한, 비록 기술은 작은 조각, 어렵다면 자연, 또는 점성 샘플 과정 그렇지 않으면 어려울 것 이다을 포함 한 다른 낮은 풍부한 자료에 적용할 수 있습니다. 이 메서드는 신선한 고정 독도 대 한 최적화 하 고 다른 유형의 이전 냉동된 독도 등의 재료에 대 한 테스트 되지 않았습니다. 이 섹션은 또한 DNA 또는 RNA를 검출 하기 위하여 교.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL Eppendorf 튜브	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic 스타터 키트	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μ L)	Genesee Scientific	24-430
낮은 바인딩 팁(200 μ L)	Genesee Scientific	24-412
낮은 바인딩 팁(20 μ L)	Genesee Scientific	24-404
낮은 바인딩 팁 (10 μ L)	Genesee Scientific	24-401
10% 포르말린 용액	시그마	HT501128
파라포름알데히드	전자 현미경 과학	15710-S
히트블록	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
아가로스 블루 비즈- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco의 PBS	Life Technologies	14190-144
조직 처리 카세트	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 조직 처리기	Thermo-Shandon LLC
에탄올 200 증거	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
파라핀	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
인슐린 항체	DAKO	A0564
글루카곤 항체	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 2차 항체	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 2차 항체	Life technologies	A11001