Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

Tim M. Curtis; Declan McLaughlin; Michael O'Hare; Joanna Kur; Peter Barabas; Gordon Revolta; C. Norman Scholfield; J. Graham McGeown; Mary K. McGahon

doi:10.3791/57944

방법 논문

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

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DOI:

10.3791/57944

⸱

2018년 7월 14일

Tim M. Curtis^*¹ , Declan McLaughlin² , Michael O'Hare¹ , Joanna Kur¹ , Peter Barabas¹ , Gordon Revolta¹ , C. Norman Scholfield³ , J. Graham McGeown⁴ , Mary K. McGahon^*²

¹Centre for Experimental Medicine, Queen's University of Belfast, ²Centre for Biomedical Sciences (Education), Queen's University of Belfast, ³Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Naresuan University, ⁴School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University of Belfast

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

초록

망막은 상당한 혈액 공급을 필요로 하는 높은 metabolically 활성 조직. 망막 순환 안 배는 대뇌를 공급 하는 동안 내부 망막을 지원 합니다. 당뇨병 성 망막 증을 포함 하 여 수많은 시력을 위협 하는 장애에 기여 하는 망막 관류에 변경, 녹 내장 및 망막 정 맥 않기. 망막이 안구 질병 동안 변경 되는 방법을 통해 혈액 흐름의 제어에 관련 된 분자 메커니즘을 이해 이러한 조건의 치료에 대 한 새로운 목표의 식별 될 수 있습니다. 망막 arterioles, 망막의 주요 저항 혈관 이며 따라서 luminal 직경에서 변화를 통해 망막 hemodynamics 조절에 핵심적인 역할을 담당할. 최근 몇 년 동안, 우리는 다양 한 세포 생리학 연구를 포함 하는 응용 프로그램에 대 한 적당 한 쥐 망막에서 arterioles 격리 하기 위한 방법을 개발 했습니다. 이 준비는 이미 혈은 망막에 제어 방법과 눈 질병 중 발생 하는 주요 변경 사항 중 일부를 식별 하기 위해 우리 수 있다에 새로운 통찰력을 얻을 시작 됩니다. 이 문서에서는, 우리는 쥐 망막 arterioles의 고립 위한 방법을 설명 하 고 패치 클램프 전기 생리학, 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 그들의 사용에 대 한 프로토콜을 포함. 이러한 혈관 PCR-서 부 럽 고 immunohistochemistry-기반 연구에 사용 하기 위해 의무가 있습니다.

서론

비정상적인 혈 시력을 위협 하는 다양 한의 병 인에 연루 되어 이후 중요 한 목표는 망막에 혈액 흐름을 제어 하는 방법을 이해 망막 질병¹^,²^,³, ⁴. 제공 안 망막 신경 그리고 glial 세포, 망막 순환 arterioles 망막 venules 그리고 마지막으로 혈관⁵모 세관을 통과 하 고 망막 동맥에서 혈액의 모든 최종 동맥 배열을, 있다. 망막에 혈액 흐름의 망막 동맥, arterioles 톤 후 모 세관 venules⁶^,⁷^, 및 망막 모세 혈관의 벽에 있는 pericytes의 수축 성 활동에 의해 통제 된다 ⁸. 망막 혈관 음색의 제어는 복잡 하 고 다양 한 분자와 호르몬, 순환 혈액 가스를 포함 한 주변 망막 조직 하 고 순환 시스템에서 입력에 의해 변조 및 vasoactive 물질에서 발표는 망막 혈관 내 피와 macroglia⁹^,^,¹⁰¹¹. 망막 arterioles 망막의 작은 동맥 가지 단일 층의 혈관 평활 근 세포의 구성와의 내부 안 감 경도 배열 내 피 세포¹²^,¹³^, ¹⁴. 이러한 혈관 망막 순환 내 혈관 저항의 주요 사이트를 형성 하 고 따라서 망막 혈액 흐름의 로컬 제어에서 중요 한 역할. 망막 arterioles dilating 또는 변화 혈관 평활 근 수축¹⁰^,¹⁵^,¹⁶에 의해 중재 luminal 그들의 직경을 constricting에 의해 망막에 모 세관 혈액의 흐름을 조절 합니다. Arterioles 규제는 망막을 통해 망막 관류 필요 준비 arteriolar 평활 근 세포를 액세스할 수 있으며 가능한 생리 적 조건에 가깝게에서 공부 하는 분자 메커니즘을 이해.

고립 된 망막 혈관의 비보 전 준비 아직도 그들의 기능 및 기본 피와 상호를 유지 하는 동안 혈관 평활 근 세포에 대 한 액세스를 제공 합니다. 격리 된 용기를 사용 하 여 현재까지 대부분의 연구는 큰 소 또는 돼지 동맥 혈관 (60-150 µ m)에 집중 했다. 이러한 상용 와이어 또는 혈관 평활 근 세포 수축 메커니즘¹⁷^,¹⁸의 약리 심문 수 있도록 압력 myograph 시스템에 장착할 수 있습니다. 이러한 준비 정상적인 조건에서 망막 혈관 생리학의 우리의 지식에 크게 기여 했다. 몇 가지 연구는 그들의 작은 직경으로 작은 실험실 동물에서 분리 된 망막 arterioles 사용 (~ 8-45 µ m) 기존의 myography 시스템¹⁹^,²⁰^,^,²¹²²에 그들의 사용을 방지. 그러나 중요 한 이점,, 작은 실험 동물에서 혈관을 사용 하 여 유전자 변형, 유전자 변형 및 망막 질환 모델의 넓은 가용성 이다. 작은 실험실 동물 개입 연구 비보에 대 한 더 많은 의무가 있습니다.

여기 우리는 분리 하 고 압력 myography 실험 쥐 망막 arterioles cannulating에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 캘리포니아^{2 +} 이미징 및 전기 생리학 프로토콜 사용 하 여 이러한 혈관도 자세히 나와 있습니다. 이러한 추가 혈관 평활 근 수축 및 망막에 혈액 흐름의 규칙으로 통찰력을 제공할 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 실험 영국 동물 (과학적인 절차) 행위 1986 년에 포함 된 지침에 따라 수행 했다 그리고 여왕의 벨파스트의 대학 동물 복지와 윤리적 검토 기관에 의해 승인 했다.

1입니다. 망막 Arterioles의 격리

참고: 다음 프로토콜 망막 arterioles 격리 하는 데 사용 됩니다. 이 방법은 쥐 망막 arterioles 최적화 하지만 마우스 망막에와 함께 사용할 수 있습니다. 그러나 마우스를 사용 하는 경우, 혈관의 수익률은, 낮은입니다.

낮은 Ca^{2 +} 표 1에서 같이 행 크 스 (LCH)를 포함 하는 솔루션을 확인 합니다.
참고:이 솔루션은 4 ° C에서 최대 3 일 동안 저장 될 수 있다 (LCH 저장 사용 하 여, 확인 그것은 실내 온도에 equilibrates와 pH는 사용 하기 전에 올바른).
이전에 망막의 급속 한 서를 보장 하기 위해 조직의 컬렉션 다음 장비 조립: 집게 (무딘) 1 유리의 2 세트, 해 부 접시 (Petri 접시 실리콘 코팅), 단일 깨끗 블레이드, 곡선된가 위, 집게 톱니 파스퇴르 피 펫 (불 부드러운 하지만 하지 좁은 팁에 광택), 1 회용 플라스틱 피 펫 (조리개를 증가 손질 하는 팁 ~ 5-7 m m), 1 유리 라운드 하단 테스트 튜브 (5 mL)과 홀더. 약 50 mL LCH 유리 비 커에 가만히 따르다 하 고 폐기물 체액을 가만히 따르다을 두 번째 비 커를 준비.
주: 사양 및 제조 업체 정보에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오.
CO₂ 심장 찔린 다음 exsanguinate를 사용 하는 쥐를 안락사 (피하기 자 궁 경관 탈 구 또는 뇌 진 탕이 눈에 있는 혈관을 손상 될 수 있습니다). 톱니 모양의 포 셉으로 눈 꺼 풀을 철회 다음 곡선된가 위를 사용 하 여 시 신경에 통해 궤도 근육 주위를 잘라. 부드럽게가 위 나머지 첨부 파일을 극복 하도록 궤도에서 눈을 추출 합니다.
눈 LCH 솔루션 (눈 수송 될 수 있다 얼음 LCH의 솔루션에서에 필요한 경우) 해 부 접시에에 놓습니다. 무뚝뚝한 겸 자에의 한 세트를 사용 하 여 궤도 근육 첨부 파일 또는 시 신경;을 개최 하 여 접시에 눈을 고정 앵커 포인트 눈 안정 sclera에 가능한 한 가까이 있는지 확인 합니다.
블레이드를 사용 하 여, ora 참나무 따라 각 막 극복 하 고 집게와는 sclera에 부드럽게 눌러 렌즈를 제거 합니다.
반 대칭 광학 디스크 통해 눈 컵을 잘라. 사용 하 여 폐쇄 집게 부드럽게 '브러시' 광학 디스크에 남아 있는 첨부 파일을 제거 하도록 하는 아이피의 두 반쪽에서 망막에 밖으로. 두 번째 눈으로 과정을 반복 하 고 해 부 망막 LCH 매체의 플라스틱 피 펫 및 작은 하락을 사용 하 여 시험 관으로 전송.
플라스틱 피 펫을 사용 하 여 작성에 LCH와 테스트 튜브 ~ 5 mL 망막 바닥에 침전 하 고.
씻어 조직 약 3 번을 제거 하 여 ~ 4 mL 튜브와 신선한 LCH 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 추가에서 솔루션의. 필요한 경우, 외부 조직 매 다 인 대, 유리 체, 머리카락 등을 제거 합니다.
유리 조직 피펫으로에 집착 하지 않도록 LCH와 파스퇴르 피 펫 (광택된 끝)의 내부를 세척. 동일한 피 펫을 사용 하는 시험 관에서 솔루션의 약 4 mL를 제거 합니다. 신선한 LCH의 약 2 개 mL를 추가 합니다.
부드럽게 해리 (triturate) 유리의 끝을 통해 조직의 여 망막 천천히 플라스틱 및 내용에는 시험 관 추방. 참고,이 단계에서 거품을 소개 하지 않으려고 합니다.
1.10 단계를 반복 하 여 약 2-3 m m²의 크기에는 망막 나누어진다.
LCH의 약 2 mL를 피펫으로의 내부를 세척 하 고는 시험 관으로 이것을 추방. 내용을 아래 5-10 분 이상 정착을 허용 합니다.
조직 조각 때까지 약 1 m m² 크기에 좀 더 힘과 1.10-1.12에 설명 된 대로 분쇄 과정을 반복 합니다. 또, 5-10 분에 대 한 정착을 조직을 수 있습니다.
내용을 완전히 무 균 하 고 망막의 아무 조각 남아 때까지 반복 단계 1.10-1.12 제 3 더 많은 힘과 시간 (솔루션 외관에서 하얀 될 한다).
참고:이 기술은 최대 8 arteriolare 세그먼트 (상대적으로 그대로 남아 있는 몇 가지와 주변 neuropile의 무료)를 얻을 것입니다 / 8-45 µ m 직경 및 200-2500 µ m 길이에서 측정 하는 격리.
생리 녹음 실에는 격리의 작은 수량을 전송 하거나 세포내 캘리포니아^{2 +} 농도 ([캘리포니아^{2 +}]_i; 참조 섹션 3)의 측정을 위한 형광 염료를 추가 합니다. 눈 컵 및 동물 폐기물의 처리에 대 한 로컬 규칙에 따라 격리 프로세스 중에 제거 하는 솔루션의 나머지의 처분.
참고: 지금까지 즉시 분리 후에 실험 하는 것이 좋습니다 동안에 잉여 격리 8 h까지 4 ° C에서 저장할 수 있습니다.

2. arteriolar 압력 Myography

참고: Arteriolar 압력 myography 장비 그림 1A, B 와 재료의 테이블에대 한 자세한를 사용 하 여 다음과 같이 수행 됩니다.

망막 배 homogenate의 약 수를 전송 (1-2 mL; 섹션 1에 의하여 고립) 생리 녹음 실로 (부분적으로 채워진 명목상 캘리포니아^{2 +}무료 행 크 스의 솔루션; 0Ca^{2 +}행 크 스 '; 표 1참조)의 단계에는 거꾸로 현미경. 실험 전에 적어도 5 분 동안 녹음 챔버의 하단에 정착 하는 혈관을 남겨 주세요.
시각적으로 식별 arterioles > 200 µ m 길이에 선박을 cannulated 수 오픈 엔드를 소지 하 녹음 실에서 스캔 (선박 종류의 추가 탐구 결과 섹션에서). 보기의 필드의 위치는 센터에 있는 배입니다. 없는 적당 한 용기 있는 경우, 단계 2.1에 의하여 녹음 실로 선박 homogenate의 또 다른 약 수를 전송.
선박 미세 집게를 사용 하 여 작은 텅스텐 와이어 슬립의 한쪽 끝을 앵커 (75 µ m 직경 고 ~ 길이에 2-4 m m) 선박 배치 ( 그림 1C(i) 참조). 이 집게에는 와이어를 잡고 하 고 녹음 실 위에 집게를 찾습니다.
1. 현미경 집게의 해당 그림자를 식별, 와이어 명백한 될 때까지 목욕에는 집게를 낮은. 오픈 엔드에서 선박 약 200 µ m 와이어를 놓고 하 고 혈관의 긴 축에 수직인 와이어를 놓습니다.
  참고: 텅스텐 와이어의 무게 distally cannulation 및 가압 중 luminal 내용의 흐름을 중지 하는 선박을 가리고 충분 하다.
가압 정 라인 오픈 엔드 욕조에 걸쳐 가로로 거짓말 같은 되는 녹음 챔버 내 적당 한 위치에 이동 ( 그림 1C(ii-4) 참조). 이렇게 부드럽게 와이어 집게; 내 추가 섹션 occluding 텅스텐 와이어 슬립을 이끌어 그것은 돌이킬 수 없는 집게를 준수 것으로 되를 만지지 마십시오.
(오래 되 세그먼트)에 대 한 필요한 경우, 추가 추가 텅스텐 와이어 전표는 그릇 같은 혈관의 폐색과 열린 끝 사이의 거리는 더 이상 200 µ m; 이 가압 시 시야 이동 되를 방지할 수 있습니다. 배는 어떤 측면, 하는 경우이 또한 추가 텅스텐 와이어 전표로 차단 한다. 측면 지점 가려진 수 없습니다 경우 선박 폐기.
0Ca^{2 +}행 크 스 외부 망막 조직을 제거 하 고 따뜻한 목욕을 생리 적인 온도 37 ° C에서 챔버 perfuse
참고: 표준 중력 먹이 목욕 관류 및 인라인 히터 시스템은이 목적을 위해 사용할 수 있습니다 ( 그림 1A참조). 외부 Ca^{2 +} 보장의 제거 이후는 arterioles 유지 확대, 0Ca^{2 +}행 크 스 ' cannulation 절차를 촉진 하기 위하여 사용.
Filamented 붕 규 산 유리 모 세관 (cannulated 될 그릇의 직경에 따라 팁 직경 3 ~ 10 µ m; 좁은 뉼 필요; 테이블의 자료를 보고 작은 혈관)에서 가압 뉼 조작 사용 하는 microelectrode 끌어당기는 고 0Ca^{2 +} 행 크 스의 솔루션으로 다시 채우십시오. 정 맥의 칼 팁 cannulation 촉진을 향해 부드럽게 테이퍼는 확인 합니다.
Y 커넥터 및 3-방향 탭;를 통해 10 mL 주사기에 부착 된 피 펫 홀더에 캐 뉼 러를 탑재 이것은 압력 시스템, 팔에 부착 된에 다른 측면-Y-커넥터의 압력 계를 사용 하 여 기록 되 고 압력을 사용 (참조 그림 1B).
참고: '도우미' 피 펫 cannulation 과정을 지원 하기 위해 필요 합니다. 0.5의 팁 직경 microelectrode 끌어당기는 사람에는 붕 규 산 유리 모 세관 피 펫 조작-2 µ m. 무 겁 게 불 폴란드어는 microforge를 사용 하 여 피 펫 (종종 닫힐 때까지).
신중 하 게 위치 도우미 피펫으로 혈관의 긴 축에 직각에 가까운 3 축 기계 조작자를 사용 하 여 오픈 엔드 ( 그림 1D참조). 바로 위에 선박, 하지만 그것에 감동 하지 도우미 피 펫을 놓습니다.
선박의 오픈 끝 cannulation 피펫으로 위치 ( 그림 1D 및 2A(i) 참조) 좋은 micromanipulator;를 사용 하 여 위치는 오프닝에 인접 한 팁 (20 X)에서 현미경에 초점의 비행기를 조정 하 여 평가. 때 그릇 끝 정 팁 모두 동시에 정 위치 올바르게 cannulation에 대 한에 초점에는 ( 그림 2A(ii) 참조).
가압 정 좋은 micromanipulator의 x 축 컨트롤을 사용 하 여 선박 조리개에 사전 ( 그림 2A(iii) 참조). Y 축 따라 정 이동 하 여 cannulation의 성공을 평가 합니다. 정 맥 혈관 내에서 유지 되는 경우 그것은 성공적으로 cannulated ( 그림 2A(4) 참조)입니다. 정 배; 위에 될 것입니다 경우에 정 맥 혈관의 이상으로 이동, 그렇다면 단계 2.10 2.11 z 축에는 더 낮은 단계에서 정 맥으로 반복 합니다.
성공적인 cannulation 시 부드럽게 억제 되는 선박에 도우미 피펫으로 낮은. Arteriolar 벽 안내 도우미 피펫으로와 가압 정에 동시에 cannulation 피펫으로 고급 추가 약 30-50 µ m의 거리에 선 루멘으로 ( 그림 2A(v, vi) 참조).
참고:이 절차는 동시, 통제 운동의 두 조작자 (도우미 피 펫은 정 배 루멘으로 이동 하는 동안은 정 쪽으로 이동)을 필요로 높은 성공률을 달성 하기 위해 광범위 한 연습을 요구할 것 이다.
2mm 캘리포니아^{2 +} 를 포함 하는 정상 행 크 스에 목욕 솔루션 변경 ( 표 1참조) 37 ° c.에 일반적으로이 되 고 가압 정 주위 단단한 물개를 형성의 약간의 축소로 인해. 도우미 피펫으로 다음 선박에서 이동할 수 있습니다.
15 분 보기 USB 카메라 (및 이미지 수집 소프트웨어)를 사용 하 여 배 현미경에 부착 하 고 선박 경계와 (참조 외부 intraluminal 공간을 최대화 하기 위해 초점을 조정에 대 한 개발을 단단한 물개를 허용 그림 2B). 0.5-에서 선박 이미지 5 프레임/s.
0 mmHg에서 녹음의 1 분 후 가압 정 맥에 연결 된 3-방향 탭을 닫아 원하는 수준 intraluminal 압력을 증가 ( 그림 1B참조) 주사기를 통해 시스템에 긍정적인 압력의 작은 금액을 적용. 압력은 압력 계에 변화를 관찰 합니다.
참고: 압력 수에 추가 될 단계 현명한 패션 100 mmHg 또는 값 예 40 mmHg ( vivo에서망막 arteriolar 압력에 가깝게)²³. 배 빠르게 성공적인 cannulation 확인 팽창 한다. 참고, 압력 유도 vasoconstriction (즉, 조직적 응답) 이후 15 분 동안 개발할 것입니다 하지만 이러한 혈관의 작은 크기 때문에이 되지 않을 수 있습니다 항상 시각적으로 감지.
신중 하 게 분명 한 누수에 대 한 초기 가압 중 선박을 모니터링 합니다. 누출의 소스는 되 안쪽 쪼개진된 쪽 지점 또는 정 맥의 부적 절 한 씰링에서 발생 수 있습니다.
1. Intraluminal 내용을 떠나 선박에 대 한 감시. 더 작은, 보다 적게 명백한 누수는 압력 계에 압력에 있는 하락으로 시간이 지남에 명백한 될 수 있습니다. 만약에 가능 하다 면, 추가 텅스텐 와이어 전표는 정을 방해 하지 않도록 주의 복용으로 개방을 막다. 추가 분석에서 분명 한 누설 준비를 제외 합니다.
이전에 선박 또는 다음, (전 수 결정, 후자 수 효과의 분석 하는 동안 조직적 톤의 개발에 대 한 효과 실험의 목적에 따라 15 분 가압 관심 abluminally의 약 적용 에 정상 상태 조직적 톤). 전형적인 약물 전달 시스템은 그림 3A에서 그림입니다.
1. 관심의 배 부분에 수직인 배달 콘센트 (같이 그림 1D) 거리에 위치 ~ 500 µ m 되도록 돌의 배 멀리 콘센트는 최적에 직각 완전히 superfuse 지역 (참조 그림 3B). 관류에 변경 할 물리적으로 선박을 방해 하지 확인 하십시오.
실험의 완료, 다음 적용 0Ca^{2 +} 행 크 스 '의 솔루션 극대 같은데요 수동 직경을 결정 하는 선박을 포함 하는 10 µ M wortmannin (myosin 경 쇄 키 니 아 제 억제 물).
참고: cannulation 인감의 강도 시험 될 수 있다 실험의 결론에서 intraluminal 압력을 발생 시켜 > 100 mmHg. 대부분의 혈관이 높은 압력 단단한 물개를 나타내는에 연결 된 유지 됩니다.
가장자리 감지를 사용 하 여 arteriolar 직경의 변경 내용을 추적 하는 오프 라인 분석 수행 (제안 된 소프트웨어에 대 한 재료의 표 참조). 혈관 사이의 비교에 대 한 수동 직경 되 직경 정상화.

3. 캘리포니아^{2 +} 영상

참고: 격리 된 망막 arterioles 기존의 (microfluorimetry)에 대 한 준비가 그리고 confocal 캘리포니아^{2 +} 로 이미징 다음과 같습니다 (장비 재료의 테이블에에서 대 한 자세한 사용).

섹션 1에서에서 설명한 대로 5 mL 유리 시험관에서 망막 homogenates를 준비 합니다. 망막 homogenate의 1 mL를 추가 오전 Fura-2 (microfluormetric 캘리포니아^{2 +} 녹음) 또는 오전 Fluo-4 (confocal 캘리포니아^{2 +} 영상) 5 µ M의 최종 농도 (빛에서 보호); 염료 지표 부드러운 근육 세포에 우선적으로 로드합니다.
2 h flicking 튜브의 측면에 대 한 어둠 속에서 실 온에서 다시 망막 조직을 중단 모든 15-20 분을 유지 합니다. 그 후, 희석 LCH 솔루션을 로드 하는 염료를 더 줄이기 위해 함께 homogenate 1:4.
참고: 배 유지 가능한 최대 6 h (4 ° C에서 어둠 속에서 저장) 하는 경우; 그러나 실험 내부 세포에 있는 염료의 구획 또는 시간이 지남에 따라 염료의 압출의 영향을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 개시는 것이 좋습니다.
캘리포니아^{2 +} microfluorimetry 또는 confocal 현미경 시스템에 연결 된 거꾸로 한 현미경의 스테이지에는 유리 바닥 녹음 실로 (부분적으로 LCH 가득 함) 망막 homogenate의 1-2 mL를 전송 합니다.
1. 녹음 실로, 텅스텐 와이어 전표 (50 µ m 직경, 길이 2-4 m m)와 간격에 걸쳐 arterioles 흐름의 방향에 수직인 앵커 ~ 100-200 µ m 선박 길이 따라 간격 ( 그림 3C참조) 설명 하는 비슷한 기술을 사용 하 여 2.3 단계.
37 ° c.에 정상적인 Ca^{2 +} 행 크 스의 솔루션과 목욕 perfuse 그림 3C 에서 그림으로 마약 배달 아울렛 놓고 약물을 혈관 적용할 단계 2.17에서에서 설명한 대로.
기존의 Ca^{2 +} 이미징, 340/380 nm 빛 기름 침수 UV 목표 (예를 들어, 100 X, NA 1.3)를 통해 선박을 조명 하 고 수집 510에서 내보낸된 형광 광자 광 전 증폭 관 관 (PMT) 계산을 통해 nm.
각 실험의 끝에, 냉각 하는 MnCl를 포함 하는 솔루션으로 배 여 배경 형광을 측정 ( 표 1참조). 배경-수정 형광 비율 (R-F340/F380)를 사용 하 여 분석을 위해 또는 세포내 캘리포니아^{2 +} ([캘리포니아^{2 +}]_i)를 사용 하 여 변환할 R_분 그리고 R_최대 측정 (참조 표 1; 적용된 전에 냉각 하는²⁴) 및 Grynkiewicz 공식²⁵.
Confocal 캘리포니아^{2 +} 이미징, Fluo-4 로드 혈관 자극 488 nm 및 캡처에 어느 라인에서 490-535 nm에서 결과 형광 방출 스캔 모드 (xt) 또는 xyt 스캔 모드 (512 x 512 픽셀, 제안된 pinhole 300 nm). 시간 t에 기록 하는 형광을 측정 표준화 = 0 (F/F₀). [캘리포니아^{2 +}]_i 변화 약물 응용 프로그램 또는 가압 오프 라인으로 특정 지역에서 관심사 (ROIs)의 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 평가 합니다.
필요한 경우 Ca^{2 +} 이미징 압력 myography를 수행 합니다.
참고: 위의 설명은 unpressurized 혈관;에 대 한 최적화 되었습니다. 그러나 그것은 Ca^{2 +} 이미징 압력 myography와 같이 결합 하 여입니다.
1. 섹션 1에 의하여 arterioles 격리 합니다. 3.1-3.2 단계에 의하여 캘리포니아^{2 +} 표시기 염료를 넣습니다. 녹음 실에는 arterioles 전송 및 2에 의하여 cannulate. 설치 절차 동안 빛에 노출 제한 하는 것을 주의.
2. 측정 캘리포니아^{2 +} 3.5 또는 3.7 위의 단계에 따라. 압력 선박 및 캘리포니아^{2 +}_. 의 측정을 반복 혈관 직경의 동시 측정 캘리포니아^{2 +} 측정 및 장비 사용의 모드에 따라 달라 집니다.
  참고: confocal 캘리포니아^{2 +} 측정에 대 한 그것은 필요할 수 있습니다 빛을 긴 노출 동안에 염료의 표백으로 인해 이미지 별도 지역 사전 및 후 가압 하.

4. 패치 클램프 전기 생리학

참고: 전체 셀 및 단일 채널 녹화는 개별 arteriolar 부드러운 근육 세포는 여전히 (를 사용 하 여 테이블의 자료에 대 한 자세한 장비)는 다음과 같이 그들의 부모 arterioles 내에 포함 된에서 가능 하다.

분리 하 고 1, 2.3 및 3.3 단계에 설명 된 대로 녹음 실에서 망막 arterioles 앵커. 패치 클램프 기록, 전표는 텅스텐 와이어 그릇 따라 200-800 µ m 간격 간격.
기저 lamina는 되 주변을 제거 하 고 인접 한 부드러운 근육 세포와 패치 클램핑 이전 기본 내 피 세포 전기 연결을 푸십시오. 이렇게 하려면 superfuse 효소 솔루션 (표 1) 필요한 동안 37 ° C에서의 순차적 시리즈와 선박.
참고: 효소 노출의 기간 쥐 망막 arterioles 최적화 (효소, ~ 8 분, 콜라, ~ 12 분)와 약물 전달 시스템 (우리의 설정에 ~ 1 mL/min)의 흐름 속도 사용 되는 효소의 일괄 처리의 단위 활동에 따라 달라 집니다.
내 피의 시각적 분리에 소화의 수준을 평가 하 고는 콜라 동안 부드러운 근육 층 그림 4에 표시 된 단계. 세포 층의 분리 ( 그림 4B에서 같이) 관찰은, 일단 적용 DNAse I 솔루션 (~ 4 분) 다음 정상적인 Ca^{2 +} 행 크 스의 솔루션과 목욕 솔루션의 교체에 의해 소화를 종료.
신중 하 게 그릇의 표면 따라 잘 집게의 닫힌된 끝을 스윕하여 기저 lamina 주변 neuropile의 모든 나머지 가닥을 제거 합니다.
당겨 유리 모 세관 (자료 테이블), 피 펫 솔루션 (표 1) 채우기 폴란드어 및 패치 클램프 headstage의 피 펫 홀더에 안전 하 게 장소. 녹음 실에 관하여 45 ° 각도로 피펫으로 놓고 동력된 micromanipulator에 거친 설정을 사용 하 여 선박을 향해 전진 합니다.
혈관 벽에서 튀어나와 부드러운 근육 세포를 선택 하 고 그 표면에서 볼 수 무료입니다 ( 그림 4B참조). 패치 피 펫의 끝의 셀 세로로 놓고 고를 micromanipulator의 벌금/느린 움직임을 사용 하 여 점차적으로 낮은 평활 근 막으로 접촉.
1. 셀과 셀 운동과 수집 소프트웨어에서 막 (도장) 테스트 프로토콜을 사용 하 여 측정 피 펫 저항에 있는 변화에서 시각적으로 피 펫 사이의 접촉을 평가 (0에서 5-10 mV 부정적인 단계 mV, 주파수 25khz; 참조 그림 5A(i)) .
때 인감 저항 5-fold 증가 했다 (예를 들어, 10 m ω; 2에서 상승 그림 5A (ii)) 부정적인 압력 정도에 적용 y-커넥터, 3-방향 탭, 주사기와 피 펫 소유자에 연결 된 튜브를 통해 피 펫 소유자의 뒷면 ( 그림 1B를 참조 arterioles의 가압에 사용 되는 비슷한 방식으로 조립,).
gigaseal까지 부정적인 압력의 반복 (> 1 GΩ 저항; 수집 소프트웨어에서 막 테스트에 표시 된 대로)가 형성 (그림 5A(iii)). Note,이 과정은 1-5 분 걸릴 수 있습니다. gigaseal 형태로 실패, 신선한 패치 피 펫을 사용 하 여 패치 클램프를 다른 셀을 선택 합니다.
잠재적인 지주 (일반적으로 0,-40 또는-80 mV) 수행 되는 실험에 의하여 수집 소프트웨어를 통해 셀에 적용 됩니다.
연구 (에 셀) 현재 구성에 단일 채널 활동. 또는, 빠르게 셀 표면에서 패치 피펫으로 gigaseal 형성 후 제거 하 여 완전히 패치를 생성 합니다.
1. 막의 자유로운 끝이이 조건 하에서 다시 anneal 수 피펫으로 조작 (거친 설정)의 급속 한 수직 운동을 통해 목욕에서 제거. 피 펫 팁 내부만 패치를 떠나 개혁된 멤브레인을 제거 하는 초승달을 통해 신속 하 게 반환 합니다.
수집 소프트웨어 5 KHz를 샘플링 주파수를 설정 하 고 레코드 채널 활동을 연속 녹화 모드 활성화. 소프트웨어 또는 앰프를 통해 필요한 경우 전압 변경 적용 됩니다.
필요한 경우, 단계 2.17에서에서 설명한 선박/막 패치 약물 적용 됩니다.
막 스트레치가 필요한 경우 3-방향 탭 및 y-커넥터를 통해 압력 계에 부착 된 주사기를 사용 하 여 피 펫의 후부에 부정적인 압력을 적용 됩니다.
단일 채널 녹음 오픈 확률 및²⁶표준 절차 따라 단일 계수에 대 한 분석.
전체 셀 현재 테이블의 자료에 의하여 풀 및 폴란드어 펫을 기록, 암포 B를 포함 하는 피 펫 솔루션 작성 (DMSO의 50 µ L에 암포 B의 3 mg을 추가 전체 셀 피 펫 솔루션의 1 mL를 3 6 µ L이 추가, 혼합 sonicate) 고 단계 4.6 4.9에 의하여 물개를 형성 한다.
암포 B의 포함으로 인해 전체 셀 액세스 피 펫 팁 내 막 파열 필요가 있다. 주어질 것 이다 점차적으로, 수집 소프트웨어에서 막 테스트 프로토콜을 사용 하 여 액세스를 모니터링 (-40에서-20 mV 단계 mV, 샘플 주파수 25khz; 그림 5B참조).
용량 성 과도 일부 소프트웨어에서의 자동화 된 피팅 액세스 저항 및 셀 커패시턴스 (또는 과도의 상대적 감소 평가 될 수 있다 눈으로)의 실시간 측정을 생성 합니다. 일단 액세스 저항 < 15 m ω가, 시리즈 저항 보상 (그림 5C) 앰프에 전체 셀 매개 변수 다이얼 (커패시턴스와 직렬 저항)을 사용 하 여 수행 합니다.
1. 이렇게 하려면 자동된 피팅 값 초기 설정 다이얼 ( 그림 5C(ii) 참조)를 사용 하 여 다음 시리즈 저항 보정 다이얼 (예측 및 수정 앰프에서 사용 가능한 경우)를 증가 전체 셀 보상을 재정리 용량 성 과도 줄이면서 ( 그림 5C(iii) 참조).
2. 하지 통해 보상 ( 그림 5C(iv)에서 같이)를 돌보는. 일반적으로, 직렬 저항 천공된 패치 모드 (최대 설정에 대 한 지연 보상 필요)에서 75%로 보상 가능 하다.
사용할 수 없는 자동된 피팅 이면 설정 전체 셀 매개 변수 15 pF와 15 ω (일반 값이이 셀에 대 한) 다이얼 고 다음 그림 5C(ii)와 같이 출력을 생성 하 여 시작 합니다. 시리즈 저항 보정 다이얼 ~ 75%로 증가 하 고 그림 5C(iii)에 의하여 전체 셀 매개 변수 다이얼을 조정.
실험 시작 전에 수동 보상 후 셀 커패시턴스 측정 초기 자동된 피팅 또는 다이얼에서 note.
참고:이 값 셀 크기에 전류를 정상화 하는 데 사용 됩니다. 직렬 저항에 대 한 보상은 액세스 패치도 암포 B의 추가 설립으로 개선 하기 위해 계속 수 실험 중 조정 될 필요가 있습니다.
2.17 단계에서 설명한 대로 약 배 적용 됩니다. 실험 요구 사항에 따라 전압 프로토콜 (단계 또는 경사로)를 적용 합니다.
참고: 일반 전압 단계 프로토콜, 0.1-1 기간, s는 지주 로부터 적용 됩니다 10-20 mV에 잠재력 증가 마다 5-10 s 전류 전압 활성화의 제품군을 생산 하. 또는 램프 프로토콜을 사용 하 여 천천히 전압을 램프에 의해 하나의 '스윕' 전압의 시리즈에서 전류를 측정 (100-200 mV/s)에서 예를 들어, 80에-80 mV (모든 5-10 s 적용) 경사로 동안 10 mV 간격 현재 오프 라인 샘플링.
패치 클램프 기록 다음과 같이 Ca^{2 +} 이미지를 결합 하는 것이 가능 하다. 섹션 1에 의하여 arterioles 격리 합니다. 3.1-3.2 단계에 의하여 캘리포니아^{2 +} 표시기 염료를 넣습니다. 섹션 4에 의하여 녹음 실에서 탑재 합니다. 이 절차 동안 빛에 노출 제한 하는 것을 주의.
참고: 그것을 날짜를 하지 않은 압력 myography 연구는 지하실 멤브레인와 선박 무결성의 손실 때문에 효소 분리 과정에서 하는 패치 클램프 결합 가능

결과

그림 6A 는 쥐 망막 혈관 트리 그리기 회로도 보여준다. 첫 번째 순서 (30-45 µ m), 두 번째 순서 (20-30 μ m), 그리고 미리 모 세관 arterioles (8-20 µ m)의 직경 범위 확인 되었습니다 실험적으로 우리의 실험실에서 쥐 망막 전체 마운트 준비 immunohistochemically 표시의 confocal 영상으로 α-부드러운 근육 걸 (그림 6B)에 대 한 망막의 분리, 시 주, 보조 및 사전 모 세관 arterioles 확인할 수 있습니다 그들의 구경과 혈관 평활 근 세포의 배열에 따라. 첫 번째 및 두 번째 순서 arterioles 밝은 분야 현미경 검사 법, 아래 비슷한 시각 나타나지만 그들의 크기 (그림 6 c) 기준으로 구분할 수 있습니다. 미리 모 세관 arterioles 준비에 있는 작은 동맥 배 이며 혈관 평활 근 섬유의 그들의 엷 배열 때문에 쉽게 인식할 수 있습니다. 격리 된 arterioles 모세 혈관과는 절연 내 venules에서 명확 하 게 분화 될 수 있다. 모세 혈관, 소 구경 (4-10 µ m 직경에서) 혈관의 meshwork venules는 얇은 벽 및 평활 근 세포 검사 (그림 6 c) 부족으로 명백 하다. 기본, 보조 및 사전 모 세관 arterioles는 압력 myography, 캘리포니아^{2 +} 이미징 및 패치 클램프 연구에 적합 합니다.

그림 7 에 기본 쥐 망막 되는 cannulated 되었습니다 압력 myography 실험 intraluminal 압력 40 mmHg를 보여 줍니다. 되 다음 0Ca^{2 +} 행 크 스 포함 10 µ M wortmannin의 추가 하기 전에 조직적 톤의 개발에 대 한 선박의 수동 직경을 얻을 수 있도록이 압력에서 유지 됩니다. 그림 7A 실험 과정 중 다양 한 시간 지점에서 되는의 photomicrographs를 보여줍니다. 풀 타임 코스 레코드를 시간이 지남에 따라 혈관 직경에서 변화를 보여주는 그림 7B 사용자 정의 만든된 가장자리 탐지 소프트웨어²⁷을 사용 하 여에서 플롯 되어 있다. 가압 시 즉시 선박 열립니다 있는 다음 뒤에 15 분의 0Ca^{2 +} 행 크 스 ' 추가 후 정상 수준에 도달 하는 활성 조직적 수축/wortmannin 솔루션 열립니다 비슷한 수준에 다시 배 즉시 초기 압력 단계 다음 관찰. 위에서 설명한 대로 약 전에 혈관 또는 다음 가압 조사 개발 및 유지 보수 이러한 선박에 조직적 톤의 기본 메커니즘을 적용할 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 이전 표시 스트레치 활성화 일시적인 수용 체 잠재력 Vanilloid 2 (TRPV2) 채널 및 L-T-타입 전압-문이 캘리포니아^{2 +} 채널 먼저에서 조직적 톤 개발 촉진에 중심 역할을 담당할 고 두 번째 주문 쥐 망막 arterioles²⁰^,^,²¹²². 우리는 또한 그 큰 전도성 캘리포니아^{2 +} 활성화 칼륨 채널 (BK 채널)¹⁹^,²⁸ K_v1 포함 된 전압 개폐 K⁺ 채널 법 반대에 조직적 활동을 보고 이러한 선박, 이후 각 채널에 대 한 구체적인 억제제의 추가 트리거 vasoconstriction (그림 ℃).

그림 8 이전에 망막 arterioles 그리고 vasoconstrictor 펩 티 드, endothelin-1 (외 1) 다음 노출에 전통과 confocal Ca^{2 +} 이미징의 예를 보여줍니다. 기존의 fura 2 기반 녹음 (그림 8A), 동부 표준시-1 (10 nM) 복 형 증가 elicits [캘리포니아^{2 +}]_나 망막 arteriolar 부드러운 근육 층에, 더 낮은 뒤는 초기 과도 컴포넌트의 구성 된 지속 구성 요소입니다. 우리는 이전 바인딩과 그물에서 캘리포니아^{2 +} 출시 및 캘리포니아^{2 +} 세포 외 공간, 각각²⁹에서 유입 되 고 과도 하 고 지속적인 구성 요소 특징 이다. Fluo-4 기반의 confocal 캘리포니아^{2 +} 이미지 동부 표준시-1 세포 수준에서의 효과의 더 상세한 그림을 제공합니다. 이 실험에서는 매끄러운 등급 글로벌 [캘리포니아^{2 +}]_나 반복적인 비동기 [캘리포니아^{2 +}]_나 의 활성화를 자극 하는 동부 표준시-1에서 우리의 microfluorimetry 연구 결과에서 관찰 된 변화는 분명 (그림 8B, C;^{용기 벽을 따라 이웃 망막 arteriolar 평활 근 세포에서 진동 30}).

그림 9 는 망막 arteriolar 평활 근 세포에서 단일 채널 및 전체 셀 패치 클램프 기록의 예를 보여줍니다. 날짜 하려면, 우리는 두 셀에 및 내부 단일 채널 패치 클램프 기록²²^,²⁸밖으로 실행 했다. 그림 9A, B 예를 들어 표시는 이전에 녹음 하는 셀에 패치 클램프 (패치 피 펫에 부정적인 압력을 적용 하 여 생성 된) 다음 막 스트레칭. 이 특정 패치 기계 스트레치에 의해 활성화 되는 두 개의 채널을 포함 합니다. 우리는 이전이 현재 TRPV2 채널 기 공 차단 항 체²²를 사용 하 여 저해 수 있습니다 시연 했다. 채널 (249.71 pS)의 단일 계수 TRPV2³¹에 의해 중재 되 고이 전류와 일치 이기도 합니다.

전체 셀 전압 활성화 전류 전압 단계 프로토콜을 사용 하 여 evoked 수 있습니다. 그림 9C A 형 K⁺ 전류 전압 활성화 이러한 접근 방식을 사용 하 여 기록의 가족을 보여준다. 이러한 전류 될 분명 다른 큰 전류가이 세포에 존재 하는 때 (예를 들어, 보 리 및 Ca⁺-Cl^- 현재 활성화) 특정 약리 에이전트³²^,³³를 사용 하 여 차단 됩니다. 일반적으로 비-또는 약하게 전압 종속 이온 채널을 통해 전류 전압 램프 프로토콜을 사용 하 여 검사 합니다. 우리를 식별 하 여 당뇨 스트레치²² 및 채널 촉진제 (그림 9D) 망막 arteriolar 부드러운 근육 세포에 의해 활성화 하는 TRPV2 전류 특성 같은 프로토콜을 이용 했다.

그림 10 듀얼의 압력을 보여줍니다 myography 고 confocal 캘리포니아^{2 +} 영상 기본 쥐 망막 되에 적용. 동부 표준시-1 가압 트리거 비슷합니다 개별 평활 근 세포에서 [캘리포니아^{2 +}]_i 진동의 주파수 관찰. 우리는 이전이 진동 캘리포니아^{2 +} (지역화 된 Ca^{2 +} 출시 이벤트) 불꽃와 조직적 톤²⁰의 생성을의 변론에 의해 트리거되는 나타났습니다.

figure-results-1
그림 1 . 압력 쥐 망막 arterioles에 myography에 대 한 실험적인 체제. A) 실험 장비는 거꾸로 한 현미경, 목욕 perfusate 3 축 기계 및 마이크로 컨트롤러, 압력 계, 정 홀더, 공기 테이블에서 선 히터를 포함 합니다. B) 회로도 cannulating 피 펫과 녹음 실에서 관심의 그릇의 최적 배치를 보여주는. 이 다이어그램은 또한 가압 장비 기본 설정을 설명합니다. C) 회로도 고정 및 추가 텅스텐 와이어 전표 좋은 집게에 개최를 사용 하 여 선박을 이동 하는 과정을 표시. (i) 1^세인트 슬립 가리고 선박을 드롭. (ii, iii) 추가적인 전표를 사용 하 여 이동 가려지는 슬립 (화살표로 방향) 및 (iv)에 표시 된 최적의 방향으로 배를 동반. D) 회로도 cannulation 이전 배열 텅스텐 와이어 슬립, 도우미 피 펫 및 선박에 관하여 정 맥 경색의 최적의 위치를 보여주는. 약물 전달 시스템의 콘센트의 거리에 위치 ~ 약물 응용 프로그램 동안 운동 아티팩트를 줄이기 위해 선박에서 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2
그림 2 . 압력 myography cannulation 과정. A) Photomicrographs (ii)-(v) 그리고 다음 cannulation (vi) 중 (i), 이전 녹음 실에서 아래로 정박 망막 되 보여주는. 녹색 화살표 도우미 피 펫의 이동 방향을 나타냅니다 파란색 화살표는 정 맥의 이동 방향을 나타냅니다. B) Photomicrograph로 빨간색으로 강조 표시 된 가압 중 조직적 활동의 기록에 대 한 최적의 영역을 보여주는. Note, 빛과 용기 벽의 대비를 증가 초점 조정 가능 자동된 분석을 위한 선박 가장자리의 더 나은 추적. 눈금 막대 나타냅니다 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 3 . 마약 배달. A) 장비 솔루션 저수지 3 방향 도청에 의해 제어 및 3 축 기계 조작에 연결 된 다중 채널 전달 매니폴드에 연결을 보여주는 약물 전달에 사용. B) 다이어그램 보여주는 약물 전달의 최적의 수직 위치 매니폴드 녹음 실에 관하여. 그릇의 C) Photomicrograph 마약 배달 콘센트의 이상적인 위치를 보여주는 녹음 실에서 내려 정박. 눈금 막대 나타냅니다 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 4 . 패치 클램프에 대 한 망막 arterioles의 효소 소화 기록합니다. 빛 (A) 전에 망막 되의 현미경 사진 (B) 효소 소화 후. 기본 내 피 세포 (ECs)에서 부드러운 근육 세포 (SMCs)의 물리적 분리 (화살표로 표시) note 패치 위한 적합 한 부드러운 근육 세포는 별표와 함께 표시 됩니다. 눈금 막대를 나타냅니다 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 5 . 채널 및 전체 셀 패치 클램프 기록. 테스트 전류 A) 그림 '테스트 인감' 프로토콜 중 관찰 때: (i) 패치 피펫으로 외부 입욕 매체, (ii) 피 펫 팁은 혈관 부드러운 근육 세포 플라즈마 막 접촉 들어가고 (iii) 흡입은 gigaseal 형성 수 있도록 피 펫의 뒷면에 적용 됩니다. 피 펫 용량 보상 패치 클램프 증폭기를 사용 하 여, 다음 단일 채널 전류 지금에 셀 구성에 기록 될 수 있습니다 또는 막의 패치가 신속 하 게 철수 ' 인사이드-아웃 ' 패치는 만들려고 피펫으로 여 excised 수 있습니다. B) 현재 변경 암포 B 전체 셀의 적용 하는 동안 셀 내부에 전기 접근의 개발과 관련 된 천공 패치 클램프 기술 (i): (ii)로, 막으로 암포 B 파티션 액세스 저항 폭포와 커패시턴스 전압 단계를 hyperpolarizing 동안 elicited (-40-60 ~에서 mV) 더 크게; (iii) 일단 액세스 저항 (R_를) < 15 m ω, 보통 gigaseal 형성 다음 5-10 분 소요, 떨어진 실험 가능 하다. 전체 세포 기록, 액세스 저항 및 셀 커패시턴스 C) 전에 관련 다이얼을 사용 하 여 패치 클램프 증폭기에 보상 해야 합니다. 패치 클램프 소프트웨어 자동된 기능에 의해 제공 되는 액세스 저항 및 셀 커패시턴스의 값이이 과정을 가이드 도움을 사용할 수 있습니다: (i) 보상 B(iii);에 강조 표시 된 영역에서 가져온 이전 과도 커패시턴스를 보여줍니다 (ii)에서는 감소 커패시턴스 과도 일반적으로 관찰 때 액세스 저항 및 커패시턴스 보상; (iii) 시리즈 저항 보상 수정 해야 합니다 다음 최대 75% 및 액세스 저항 및 커패시턴스 보상 결과 과도 비교적 이어야 한다 그런을 미세 하 게 동등한 동안 현재의 고원 수준 아래와 위의 진폭에 단계입니다. (4) 주의 해야 액세스 저항은 하지 이상의 보상을 (과도의 '둥글게'의 존재로 표시), 확인 하는 액세스 계속 실험의 과정을 개선 하는 경우 가끔 발생할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-6
그림 6 . 고립 된 쥐 망막 arterioles의 식별. A) 그림 쥐 망막 microvascular 나무의 배치를 보여주는. B) 공초점 이미지 쥐 망막 arterioles 및 평면 마운트 준비에서 venules의 αSMA에 대 한 스테인드 (빨간 핵은 푸른 스테인드; 규모 바 대표 50 µ m). 절연된 1 °, 2 °와 미리 세관 arterioles, 모 세관 네트워크와 venule의 C) 가벼운 현미경 (규모 바 대표 10 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-7
그림 7 . Arteriolar 압력 myography 녹음. 휴식 (약 35.6 µ m) 직경, (ii) 가압 시 팽창, 조직적 vasoconstriction 및 (iv) 팽창 때문에 10 µ M wortmannin 0Ca에서 추가 개발 (iii) cannulated 망막 되 보여주는 (i)의 A) 이미지^{2 +}행 크 스의 솔루션. 스케일 바 대표 10 µ m. B) 시간 코스 (2.5 프레임/s로 샘플링) A에 표시 된 전체 실험에 대 한 혈관 직경의 줄거리. 다른 되 정상 조직적 톤 (직경 38.7 µ m) Kv1 채널 억제제 correolide (10 µ M)과 보 리 채널 억제제 iberiotoxin의 효과 보여주는 아래에서 C) 직경 추적 (100 nM) (0.5 프레임/s로 샘플링). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 8 . 동부 표준시-1 [캘리포니아^{2 +}]의 효과 _난 쥐 망막 arterioles에 활동 신호. A) 기존의 fura 2 기반 녹화에 글로벌 [캘리포니아^{2 +}]_나외-1 (10nM)의 효과 보여주는. 기초 [캘리포니아^{2 +}]_나 는 82이 1 ° 되에 nM. B) 공초점 xt Fluo-4 기반의 이미지 [캘리포니아^{2 +}]_나 세포 수준에서에 동부 표준시-1의 효과 보여주는. B에서 표시 셀 단위로 정규화 된 형광 강도 (F/F₀)의 C) 줄거리 이 그림 Tumelty 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 허가 함께 ³⁰ . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-9
그림 9 . 단일 채널 및 쥐 망막 arteriolar 부드러운 근육 세포에서 전체 셀 패치 클램프 기록. A, B) 셀에 단일 채널 녹음 같은 막에서 (A) 이전 패치 및 패치를 부정적인 압력 (-45 mmHg)의 응용 프로그램 (B) 동안 플라스틱. 패치에 존재 하는 두 개의 채널 (단일 현재 12.81 pA; 단일 계수 249.71 pS) 스트레치 조건 하에서 활성화에 상당한 증가 표시 하는. 상단 패널에서 선택된 영역에서 낮은 패널 (ii) 기본 빠른 시간에 표시 (i) 됩니다. 억제제 BK 및 캘리포니아^{2 +}의 존재 전체 셀 모드에서 A 형 K⁺ 채널 전류 (i)의 C) 가족 기록-Cl^- 채널 억제제, 20 mV 전압 스텝 증가-80 사이 elicited 활성화 mV + 80 ~ mV (ii)입니다. D) 전체 셀 전류 (i)-80 사이 경사로 전압 하 여 elicited mV와 80 mV (검은 선) 하기 전에 (빨간 선) 응용 프로그램은 TRPV2 채널 길 항 제 델타-9-tetrahydrocannabinol (Δ9-마리화나)의 동안. 사용 하는 전압 램프 프로토콜 (ii) 하단 패널에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-10
그림 10 . 이전에 캘리포니아^{2 +} confocal 영상 및 쥐 망막 되의 가압 다음. (I) (A)에서 망막 arteriolar 부드러운 근육 세포의 대표적인 confocal xt 스캔 unpressurized와 (B) 가압 조건 같은 선박의 별도 영역에서 얻은. (ii) 변경 정규화 된 형광 (F/F₀)에 기록 된 개별 셀-e, (i), 표시 된 시간에 대 한 플롯. 별표는 개별 subcellular 캘리포니아^{2 +} 불꽃 가압 후 주파수에서 증가 하 고 세포질 캘리포니아^{2 +} 진동 하 summate를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

화합물 (mM)	낮은 Ca^{2 +} 행 크 스 '	0Ca^{2 +} 행 크 스 '	일반 행 크 스 '	절연 효소 프로 테아 제	절연 효소 콜라	절연 효소 DNAse	솔루션을 끄다	Rmin 솔루션	Rmax 솔루션	셀 연결 Extracellular 솔루션	셀 연결 피 펫 솔루션	전체 셀 세포 외 솔루션	전체 셀 피 펫 솔루션
물 순도 (저항)	≥15 MΩ.cm	≥15 MΩ.cm	≥15 MΩ.cm	≥15 MΩ.cm	≥15 MΩ.cm	≥15 MΩ.cm	≥15 MΩ.cm	≥15 MΩ.cm	≥15 MΩ.cm	≥15 MΩ.cm	≥18 MΩ.cm	≥15 MΩ.cm	≥18 MΩ.cm
NaCl	140	140	140	140	140	140	140	140	140			140
kCl	6	6	6	6	6	6	6	6	6			6	138
D-포도 당	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5
MgCl₂	1.3	1.3	1.3	1.3	1.3	1.3	1.3	1.3	1.3	1.3	1.3	1.3	1
HEPES	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
CaCl₂	0.1		2	0.1	0.1	0.1			10	2	2	2	0.2
EGTA								4					0.5
MnCl							10
Ionomycin									0.01
코										140	130
D-Gluconic 산										130	130
NaOH											10
Penitrem A										0.0001	0.0001	0.0001
4-aminopyridine											10
Nimodipine											0.01	0.01
부정맥											0.1
9-anthracenecarboxylic 산												1
암포 B													300-600 μ g mL^-1
효소 유형 XIV				~0.01% (0.4-0.6 mg/40 mL)
콜라 종류 1A					0.1% (6mg/60 mL)
DNAse I						20 구 (20 ml에서 1 MU/mL 주식의 20 μ)

pH	7.4	7.4	7.4	7.4	7.4	7.4	7.4	7.4	7.4	7.4	7.4	7.4	7.2
으로 적정	NaOH	NaOH	NaOH	NaOH	NaOH	NaOH	NaOH	NaOH	NaOH	트리 스	트리 스	NaOH	코

표 1. 외부의 예제를 포함 하 여 실험에 사용 되는 솔루션의 구성 및 피 펫 솔루션 사용 단일 채널 (TRPV2) 및 전체 셀 (A 형) 전류.

토론

위에서 설명한 프로토콜 연습을 필요로 하지만 최소한의 문제 해결 달성 되어야 합니다. 평균 하루에 우리 6-8 사용할 arterioles 고립에서 얻을 것이 고 3-4 성공적인 실험을 달성. 그러나 문제가 발생 하는 경우, 성공률을 개선 하기 위해 취할 수 있는 몇 가지 단계가 있습니다. 때때로 우리는 발견, 어린 쥐 (< 8 주)를 사용 하는 경우에 특히 arterioles의 수익률 낮은 될 수 있습니다. 이 문제를 회피, 단계 1.12-1.14 단계는 분쇄의 각 사이 망막 조직 (500g x 10-30 s) centrifuging 좋습니다 것 이다. 이 종종 혈관의 수율을 개선 하는 데 도움이 하지만 준비 내 세포 파편의 양을 증가.

때 혈관 압력 myography 연구에 대 한 cannulating arterioles 수 분기 가까운 죽 습 되었습니다가지고 있는 모든 사이드 지점에 대 한 신중 하 게 확인 하기 중요 하다. 이 실험 동안 누설의 일반적인 원인 및 압력의 손실을 나타냅니다. [캘리포니아^{2 +}]_나 프로토콜 함께 발생할 수 있는 주요 문제는 염료 로드의 수준 이다. 불 쌍 한 염료 로드 일반 Ca^{2 +} 항상성 장애에 결과 오버 로드 하는 동안 낮은 신호 대 잡음 비율, 리드. 이러한 문제 중 하나에의 가능성을 줄이기 위해, 망막 homogenate의 작은 약 수를 제거할 수 있습니다, 하 고 격리 된 선박 로드 프로토콜 동안 정기적으로 검사 합니다. 사업 패치 클램프 실험, gigaseal 형성의 성공률도 높은 방법에 의존 하는 경우 기저 lamina 소화 되어 있다. 때 처음이 프로토콜 테스트 또는 사용 하 여 새로운 많은 효소의 효소 소화 농도/기간 조정 필요할 수 있습니다. 충분히 기초를 제거 하는 충분 한 소화 보장 한다 내 피 및 평활 근 층의 분리를 신중 하 게 모니터링 액세스 laminal. 주의 깊은 모니터링 하는 것은 또한 혈관 수축 시작으로 매니 페스트 수 있습니다-소화를 방지 하는 데 필요한입니다. 이 경우, 평활 근 세포는 종종 패치 클램프 기록에 대 한 너무 약 합니다. 효소를 적용할 때 그것은 DNAse를 포함 하는 것이 중요 내가 DNA에서 해방의의 제거를 보장 하기 위해 손상 된 세포 격리 과정. DNA 파편은 끈 적 원인과 (4.4 단계), 청소 과정의 최종 단계는 되에 고착을 겸 종종 선박 손실의 결과로. 혈관 청소 기술적으로 어려운 이며 가장 높은 최고의 가능한 팁 직경의 닫힌된 집게의 부드러운 연소 움직임 확대 (20 X)에서 수행 됩니다. 스윕, 사이 랩 롤과 집게 청소.

강조,이 원고에 설명 된 프로토콜의 개발 뒤에 주요 동기 망막 혈관 질환 중 혈 중단 왜 이해를 했다. 날짜를 우리의 작품의 대부분은 당뇨병 안구 질환²⁸^,³³에 집중 했다. Arterioles 섹션 1에에서 설명 된 방법을 사용 하 여 당뇨병의 실험적인 설치류 모델의 망막에서 격리 될 수 있습니다. 실험에서 당뇨병 동물에서 분리 된 망막 arterioles 때 그것은 밀접 하 게 비보에혈관에 의해 경험 hyperglycemic 조건 복제 하려고 하는 것이 중요. 이러한 이유로, 우리가 일반적으로 우리의 절연 및 25 m m 실험적인 솔루션에서 D-포도 당 수준을 인상 것입니다. 혈관 지하실 막 두껍게 당뇨병³⁴^,³⁵동안 망막 혈관에 잘 인식 된 현상입니다. 동물을 사용 하 여 장기간 당뇨병 (> 1 개월 질병 기간) 때 증가 효소 농도 또는 소화 시간 종종 필요 패치 클램프 기록 방법의 응용 프로그램을 활성화 합니다.

비보 전 을 사용 하 여 중요 한 제한 절연 망막 arterioles 망막 혈관 생리학을 공부 하 고 이상 주변 망막 neuropile의 손실 이다. 망막 폐해 및 신경 세포의 제거는 세포 생리학 연구에 대 한 망막 혈관 평활 근 세포에 쉽게 액세스할 수 있습니다,. 비록 vasoactive 중재자에 대 한 혈관의 응답 부재 및 망막의 존재에서 극적으로 변경할 수 있습니다. 조직입니다. 아데노신 트라이-인산 염 (ATP)의 작업은 예를 들어이 포인트의 좋은 그림을 제공합니다. 고립 된 쥐 망막 arterioles, ATP 트리거의 추가 선박³⁶의 강력한 수축, 그대로 neuropile의 존재에 혈관 팽창³⁷. 따라서, 가능 하다 면, 우리가 일반적으로 시도 비보 전 망막 전체 마운트 및 선박 직경 및 혈액 흐름¹⁶^,³⁷ 의 측정 vivo에서 를 사용 하 여 우리의 고립된 되 준비에서 주요 연구 결과 유효성을 검사 하 . 주의 새로운 방법을 최근 작은 arterioles³⁸^,³⁹ 비보 전전체 끼얹는다 돼지 망막 모세 혈관을 공부 하 고 대 한 나왔다. 이러한 준비 크게 망막 neuropile 망막 arteriolar 및 모 세관 톤을 조절 하는 방법 및 망막 haemodynamics에 변화 망막에 신경 활동을 조절 하는 어떻게의 우리의 이해를 향상 시킬 가능성이 있다.

이 문서에서 설명 하는 절차는 이해 arteriolar 부드러운 근육 세포 생리학에 대 한 고립 된 쥐 망막 arterioles의 사용에 초점을 맞추고 있다, 하지만 우리는 현재 프로토콜에 내 피 세포 기능 연구 활성화를 개발합니다 이러한 선박입니다. 예비 작업에서 우리는 캘리포니아^{2 +} 이미징 및 연구 기록 patchclamp 의무가 가능한 내 피 세포 튜브를 망막 arteriolar 세그먼트의 효소 소화 수정에 성공 되었습니다. Intraluminal 배달, 약물의 사용, 양쪽 끝에 격리 arterioles cannulation 수도 미래에 이러한 선박에 조사를 사용 피 종속 vasodilatory 응답.

공개 사항

박사 조 안 나 Kur Medtronic (트윈-도시, 미네소타, 미국)의 직원은 지금, 그녀의 현재 작업을 충돌 하지 않는 여기에 제시 된 그.

감사의 글

이 문서에서 설명 하는 프로토콜의 개발은 다음 자금 지원 기관에서 교부 금에 의해 지원 되었다: BBSRC (BB/I026359/1), 시력 (1429와 1822), 소아 당뇨병 연구 재단 (2-2003-525), Wellcome 신뢰 (074648/Z/04)에 대 한 싸움 영국 심장 재단 (PG/11/94/29169), HSC R & D 부문 (STL/4748/13) 및 MRC (MC_PC_15026).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Beakers	Fisherbrand	15409083	또는 모든 등가 제품
곡선 가위	Fisher Scientific	50-109-3542	또는 모든 등가 제품
일회용 플라스틱 피펫/전사	Sarstedt	86.1174	6mL가 가장 좋지만 다른 크기도 허용됩니다; 조리개를 넓히기 위해 팁을 제거하십시오
해부 현미경	Brunel Microscopes Ltd		또는 어떤 등가 제품
겸	World Precision Instruments	Dumont #5 14095	이에 상응하는 미세 집게
파스퇴르 피펫	Fisherbrand	11546963	마찰을 줄이기 위해 화염 연마되었지만 팁을 좁힐 정도는 아님
페트리 접시	Sigma-Aldrich	P7741	또는 모든 등가 10cm 제품
피펫 젖꼭지	Fisherbrand	12426180	또는 모든 등가 제품
정제수 공급	Merek	Milli-Q 통합 정수 시스템	또는 모든 등가 시스템
라운드 바닥 시험관	Fisherbrand	14-958-10 B	5 mL; 모든 등가 제품
Seratted forceps	Fisher Scientific	17-467-230	또는 모든 등가 제품
단일 가장자리 블레이드	Agar Scientific	T585	또는 어떤 등가 제품
Sylgard	Dow Corning	184	또는 어떤 유연한 표면
테스트튜브 랙	Fisherbrand Derlin 10257963		또는 어떤 등가 제품
압력 myography
3축 기계식 조작기	Scientifica	LBM-7	x2(또는 등가 제품)
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에어 테이블	기술 제조 회사	클린 벤치	또는 모든 등가 제품
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분석 플러그인	Myotraker		imageJ에 대한 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 사용자 정의 플러그인 무료로 다운로드 할 수
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집게 유리 바닥 녹음 챔버	Warner Instruments	64-0759	또는 모든 등가 제품
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다중 채널 전달 매니폴드	과학적인	관류 연필	또는 어떤 동등 제품
패치 소프트웨어	분자 장치	Pclamp v10.2	또는 어떤 동등 제품
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전체 셀 피펫 유리	Warner Instruments	GC150TF-7.5	또는 모든 등가 제품
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x40 렌즈	Nikon	40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2	또는 모든 등가 제품
Y-커넥터	World Percision Instruments	14012	또는 모든 등가 제품
Ca²⁺ 이미징
3방향 탭	Cole-Parmer	UY-30600-02	또는 모든 등가 제품
3축 기계식 매니퓰레이터	Scientifica	LBM-7	또는 모든 등가 제품
수집 소프트웨어	케언 리서치 주식회사	획득 엔진 V1.1.5	또는 모든 등가 제품; 미세 형광 측정
에어 테이블	기술 제조 회사	클린 벤치	또는 어떤 동등 제품
컨포칼 이미징을 위한 분석 소프트웨어	이미지 J	https://downloads.imagej.net/fiji/	무료 이미징 소프트웨어
컴퓨터	Dell	Optiplex 7010	또는 어떤 동등 제품
컨포칼 현미경	Leica Geosystems	SP5	또는 모든 등가 제품; 공초점
디지털 온도계	RS	206-3722	또는 모든 등가 제품
미세 집게	Dumont	No. 7	모든 초미세 집게
유리 바닥 녹음 챔버	Warner Instruments	64-0759	또는 모든 등가 제품
인라인 히터	맞춤 제작		상업 등가 SH-27B 솔루션 하버드 장치의 인라인 히터
반전 현미경	Nikon	Eclipse TE2000	또는 모든 등가 제품; 미세 형광 측정
Monochromator	케언 리서치 주식회사	Optoscan	또는 어떤 등가 제품; 마이크로 플루오리 메트리
멀티 채널 전달 매니폴드	Automate Scientific	Perfusion Pencil	또는 어떤 등가 제품
피펫 필러	BD Plastipak	1mL	주사기를 가열하여 컨
포칼 현미경 용	Leica Geosystems	LAS-AF 버전 3.3.	또는 모든 등가 제품; 공초점
흡입 펌프	Interpet	AP1	역전 벨로우에 의한 변환된 통기 펌프
주사기	BD Plastipak	20mL Luer-lok	또는 모든 등가 제품
텅스텐 와이어	어드벤트	W557418	50μ m 직경
Tygon 튜빙	VWR	기타 크기
수조	Grant	Sub Aqua 12 Plus	또는 모든 등가 제품
x100 렌즈	Nikon	x100 N.A. 1.3 오일	또는 모든 등가 제품; 미세 형광 측정
x20 렌즈	Nikon	20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17	또는 모든 등가 제품; 미세 형량 측정
x20 렌즈	Leica Geosystems	HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D	또는 모든 등가 제품; 공초점
x4 렌즈	Nikon	4x/0.10, WD 30, ∞/-	또는 모든 등가 제품; 미세 형량 측정
x63 렌즈	Leica Geosystems	HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS ∞/0.17/E	또는 모든 등가 제품; 공초점
Y-커넥터	World Percision 기기	14012	또는 모든 등가 제품
< 강한>피펫 < / 강>			< 강> 실험 용 피펫 제작을위한 사양 및 설정 < / >
도우미 피펫	World Percision Instruments	IB150F-3	내경 : 0.86 mm 램프 : 261 압력 : 300 열 : 280 당기기 : 0 속도 : 56 시간 : 250 사이클 수 : 4 팁 직경 : 0.5-2 μ m < / > 연마 : 예 < br / > 최종 저항 : >10 M & Omega;
캐뉼레이션 피펫	World Percision instruments	TW150F-4	내경: 1.17 mm 램프: 290 압력: 300 열: 280 당기기: 0 속도: 58 시간: 150 주기 수: 4 팁 직경: 3-10 μ m 연마: no 최종 저항: < 1 M&오메가;
온 셀 패치	World Percision 기기	IB150F-3	내경 : 0.86 mm 램프 : 261 압력 : 300 열 : 280 풀 : 0 속도 : 56 시간 : 250 사이클 수 : 4 팁 직경 : 0.5-2 μ m 연마: yes 최종 저항: >5 mΩ
전체 셀 패치	Warner Instruments	GC150TF-7.5	내경: 1.17 mm 램프: 296 압력: 200 열: 287 당김 : 0 속도: 50 시간: 250 주기 수: 4 팁 직경: 2-3 μ m 연마: 도움이 되지만 반드시 필요한 것은 아님 최종 저항: 1-2 MΩ

. 자 있습니다 DMSO 유리 바닥 녹음 챔버 벨로우즈 짐 역 USB 카메라 피펫 내부 직경으로 당기는

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