Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

Huijun Xue; Zhengyan Zhan; Kaining Zhang; Yu Vincent Fu

doi:10.3791/57967

방법 논문

Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

DOI:

10.3791/57967

⸱

2018년 7월 17일

Huijun Xue^*¹^,² , Zhengyan Zhan^*¹ , Kaining Zhang¹^,² , Yu Vincent Fu¹^,²

¹State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, ²Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기, 선물이 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) site-specifically 수정된 λ DNA 기판 및 양자 점 단백질 분류를 사용 하 여 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜.

초록

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형광 현미경 검사 법 단일 분자 수준에서 복잡 한 생물 학적 과정의 메커니즘을 해 부에 큰 기여를 했다. 단일 분자 DNA 단백질 상호 작용을 공부에 대 한 분석에서 고려에 대 한 두 가지 중요 한 요소는: 쉽게 관찰 하 고 적합 한 형광 프로브는 단백질을 라벨에 대 한 충분 한 길이와 DNA 기질. 48.5 kb λ DNA DNA 기판에 대 한 좋은 후보입니다. 양자 점 (Qdots), 형광 프로브 클래스로 장기간 관찰 (시간 분)와 높은 품질 이미지 수집 수 있습니다. 이 논문에서는, site-specifically 수정된 λ DNA를 준비 하 고 라벨 streptavidin 입히는 Qdots와 대상 단백질을 포함 하는 단일 분자 수준에서 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜 선물이. 개념 증명에 대 한 우리 오크 (복잡 한 원산지 인정) 신진 효 모에 관심사의 단백질으로 선택한 TIRFM 사용 하는 ARS (자동으로 복제 시퀀스)와 상호 작용을 시각화 합니다. 다른 형광 프로브에 비해, Qdots photobleaching에 대 한 그것의 높은 안정성 때문에 단일 분자 연구에 분명 한 이점이 있다 하지만이 속성 양적 분석에 응용 프로그램 제한에 주목 한다.

서론

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단백질 및 DNA 사이 상호 작용, DNA 복제, DNA 수리, 전사 등 많은 복잡 한 생물 학적 과정에 필수적입니다. 기존의 접근 이러한 프로세스의 속성에 빛을 발산가, 비록 많은 키 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 최근, 급속 하 게 발전 한 분자 기술로 메커니즘의 일부 해결된¹^,²^,³되었습니다.

주로 단백질 DNA 상호 작용을 실시간으로 시각화에 단일 분자 형광 현미경 검사 법의 응용 프로그램의 형광 탐지 및 형광 프로브 개발에 따라 달라 집니다. 단일 분자 연구를 위해 그것은 형광 탐지 시스템은 주로 상업적으로 사용할 수 있기 때문에 적합 한 형광 프로브 관심사의 단백질을 분류 하는 것이 중요.

형광 단백질 분자 생물학에 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 낮은 형광 밝기 및 photobleaching에 대 한 안정성 많은 단일 분자 분석에 응용 프로그램을 제한합니다. 양자 점 (Qdots)는 작은 발광 나노 입자⁴. 그들의 독특한 광 속성으로 인해 Qdots은 10-20 배 더....

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프로토콜

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1. λ-ARS317 DNA 기판의 준비

DNA 기판 건설 및 포장
1. 소화 Xho을 사용 하 여 네이티브 λ DNA 나 효소; ARS317 신진의 genomic DNA에서 20를 포함 하는 뇌관을 사용 하 여 효 모 543 bp DNA 조각 베어링 증폭 bp 동종 시퀀스의 업스트림 및 다운스트림 Xho나 람다 DNA에서 효소 사이트. 추가 100 ng Xho의 λ DNA와 10 소화 DNA의 ng 동종 재결합 반응 시스템, 10 µ L를 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 반응을 품 어.
2. 재결합 λ DNA 패키지, 재결합 제품으로 람다 포장 추출의 25 µ L을 추가 하 고 90 분 30 ° C에서 반응을 품 어. 그런 다음 람다 포장 추출 반응 관에의 한 추가 25 µ L를 추가 합니다. 계속 품 어 90 분 30 ° C에서 반응.
3. 반응 시스템에 살 균 희석 버퍼 (10 mM Tris HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 m m MgCl₂)의 500 µ L을 추가 하 고 부드럽게 튜브를 거꾸로 여러 번 설정 하 여 혼합. 클로 프롬의 25 µ L을 추가 하 고, 부드럽게 혼합, 4 ° c.에 저장
4. 포장 된 살 균 소의....

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결과

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Qdot 표시 된 오크는 ARS의 상호작용을 시각화 하려면 우리가 먼저 λ-ARS317 DNA 기판 건설. ARS317를 포함 하는 DNA 조각 통합 되었다 Xho에 내가 사이트 (33.5 kb) 네이티브 λ DNA의 동종 재결합 (그림 1A). 재결합 제품 추출 물을 사용 하 여 패키지 된 고 포장된 살 균 소 입자 파운드 플레이트 (그림 1B)에 경작 되었다. 긍정적인 살 균 소 패 PCR에 의해 상영 되었고 (그림 1C)을 시퀀싱에 의해 확인. Λ-ARS317 DNA는 액체 lysates (그림 1D)에서 순화 되었다.

단일 분자 .......

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토론

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여기, 선물이 Qdot 표시 된 단백질 및 흐름 셀에서 TIRFM는을 사용 하 여 site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 관찰 하는 프로토콜. 필요한 단계는 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름-세포 준비, 및 단일 분자 이미징 사이트 수정 포함 됩니다. 주목 해야 한다 두 가지 요점을 확인 하 고 있습니다. 첫째, λ DNA와 관련 된 단계, 예를 들어, 어떤 가능한 손상 감소를 부드럽게 조작 해야 모든 반복적으로 아래로 pipetting으로 혼합을 피하. 둘째,는 coverslip 충분히 깨끗 하 고는 배경 잡음을 최소화 되도록 매우 중요 하다. Coverslip 청소 및 기능화 과정 물, 초순 수준에 도달 해야 하며 공기 먼지 무료. Coverslip 기능화 및 흐름 셀 조립 깨끗 한 벤치에서 실시 하는 것이 낫다.

단백질 DNA 상호 작용을 공부에 대 한 단일 분자 분석 실험,.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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우리 닥터 하 산 Yardimci 감사 하 고 종류의 프랜시스 크릭 연구소의 Dr.Sevim Yardimci 도움이 단일 분자 실험에의 컬럼비아 대학, 박사 에릭 C. 그린의 연구소에서 박사 다니엘 Duzdevich 박사 유지 북경 대학교의 태양과의 Chunlai 첸 박사 칭화 대학 유용한 토론에 대 한입니다. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 31371264, 31401059, CAS 혁신 팀과 뉴턴 고급 친교 (NA140085)에서 왕 사회에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
람다 DNA	뉴 잉글랜드 Biolabs	N3011	저장소 25 μ L 분취량은 -20 ºC입니다.
XhoI 효소	Thermo Fisher Scientific	FD0694
신속 융합 클로닝 키트	Biotool	B22611
MaxPlax Lambda Packaging Extracts		Epicentre MP5110	Bacterial strain LE392MP 이 이 패키지에 포함되어 있습니다.
MgSO₄	Sinopharm 화학 시약 Co., 주식 회사	10013092	모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.
Tris	Amresco	0497-5KG
NaCl	Beijing Chemical works	N/A	모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.
MgCl₂	Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd	10012818
클로로포름	베이징 화학 작품	N/A	모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.
NZ-amine	Amresco	J853-250G
카사미노산	Sigma-Aldrich	22090-500G
PEG8000	Beyotime	ST483
자기 교반 장치	IKA	KMO2 basic
15 mL Eppendorf tube	Eppendorf	30122151	15 mL, sterile, bulk, 500pcs
Rnase	SIGMA	R4875-100MG
Dnase	SIGMA	D5319-500UG
Proteinase K	Amresco	0706-100MG
비오틴화 프라이머	Thermo Fisher Scientific	N/A
T4 DNA 리가제, T4 DNA 리가제, 반응 완충액 (10x)	New England Biolabs	M0202
커버슬립	Thermo Fisher Scientific	22266882
에탄올	Sinopharm 화학 시약 유한 공사	10009259
수산화 칼륨 (KOH)	시그마 - 알드리치	306568-100G
아세톤	열 피셔 사이언티픽	A949-4
H₂SO₄	Sinopharm 화학 시약 유한 공사	80120891	황산
H₂O₂	Sinopharm 화학 시약 10011218		30% 과산화수소
메탄올	시그마-알드리치	322415-2L
아세트산	시그마-알드리치	V900798
APTES	시그마-알드리치	A3648
mPEG (메톡시-폴리에틸렌 글리콜)	리산	mPEG-SVA-5000
비오틴-PEG (비오틴-폴리에틸렌 글리콜)	Lysan	Biotin-PEG-SVA-5000
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	31437-500G
진공 건조기	Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.	IPC250-1
진공 실러	MAGIC SEAL	WP300
다이아몬드 팁 유리 스크라이브	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	70036
유리 슬라이드	세일 브랜드	7101
입구 튜브	SCI (Scientific Commodties INC.)	BB31695-PE/2	내경 0.38mm, 외경 1.09mm.
출구 튜빙	SCI (Scientific Commodties INC.)	BB31695-PE/4	내경 0.76mm, 외경 1.22mm.
양면 테이프	Sigma-Aldrich	GBL620001-1EA
에폭시	LEAFTOP	9005	5분 에폭시
Streptavidin	Sigma-Aldrich	S4762
형광 현미경	Olympus	IX71
주입/철수 프로그래밍 가능한 펌프	Harvard 장치	70-4504
532nm 레이저	Coherent	사파이어 -532-50
640 nm 레이저	Coherent	OBIS-640-100
EMCCD 카메라	Andor	DU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging 분할 광학	Hamamatsu photonics K.K.	A12801-01
TIRF 조명 시스템	올림푸스	IX2-RFAEVA2
60× TIRF 대물렌즈	올림푸스	APON60XOTIRF
쿼드 에지 레이저 이색성 빔스플리터	Semrock	Di01-R405/488/ 532/635-25x36
쿼드 밴드 대역 통과 필터	Semrock	FF01-446/510/ 581/703-25
Dichroic beamsplitter	Semrock	FF649-Di01-25x36
방출 필터	크로마 기술 Corp	ET585/65m
방출 필터	Chroma Technology Corp	ET665lp
FocalCheck 형광, 현미경 테스트 슬라이드 #1	Thermo Fisher Scientific	F36909
SYTOX 오렌지	Thermo Fisher Scientific	S11368
Qdot₇₀₅Streptavidin Conjugate	Thermo Fisher Scientific	Q10163MP	Store 4 º에서; C, 얼지 마십시오.
ATP	Amresco	0220-25G	200 mM ATP 용액을 준비하고, ddH₂O를 사용하여 pH를 7.0으로 조정하고, 10 μ L 분취량은 -20 ºC입니다.
DTT	Amresco	M109-5G	ddH₂O를 사용하여 1M 용액을 준비하고 10 &mu를 저장합니다. l -20 ºC에서 부분 표본.

참고문헌

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Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

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