Method Article

Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 선물이 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) site-specifically 수정된 λ DNA 기판 및 양자 점 단백질 분류를 사용 하 여 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

형광 현미경 검사 법 단일 분자 수준에서 복잡 한 생물 학적 과정의 메커니즘을 해 부에 큰 기여를 했다. 단일 분자 DNA 단백질 상호 작용을 공부에 대 한 분석에서 고려에 대 한 두 가지 중요 한 요소는: 쉽게 관찰 하 고 적합 한 형광 프로브는 단백질을 라벨에 대 한 충분 한 길이와 DNA 기질. 48.5 kb λ DNA DNA 기판에 대 한 좋은 후보입니다. 양자 점 (Qdots), 형광 프로브 클래스로 장기간 관찰 (시간 분)와 높은 품질 이미지 수집 수 있습니다. 이 논문에서는, site-specifically 수정된 λ DNA를 준비 하 고 라벨 streptavidin 입히는 Qdots와 대상 단백질을 포함 하는 단일 분자 수준에서 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜 선물이. 개념 증명에 대 한 우리 오크 (복잡 한 원산지 인정) 신진 효 모에 관심사의 단백질으로 선택한 TIRFM 사용 하는 ARS (자동으로 복제 시퀀스)와 상호 작용을 시각화 합니다. 다른 형광 프로브에 비해, Qdots photobleaching에 대 한 그것의 높은 안정성 때문에 단일 분자 연구에 분명 한 이점이 있다 하지만이 속성 양적 분석에 응용 프로그램 제한에 주목 한다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 및 DNA 사이 상호 작용, DNA 복제, DNA 수리, 전사 등 많은 복잡 한 생물 학적 과정에 필수적입니다. 기존의 접근 이러한 프로세스의 속성에 빛을 발산가, 비록 많은 키 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 최근, 급속 하 게 발전 한 분자 기술로 메커니즘의 일부 해결된1,2,3되었습니다.

주로 단백질 DNA 상호 작용을 실시간으로 시각화에 단일 분자 형광 현미경 검사 법의 응용 프로그램의 형광 탐지 및 형광 프로브 개발에 따라 달라 집니다. 단일 분자 연구를 위해 그것은 형광 탐지 시스템은 주로 상업적으로 사용할 수 있기 때문에 적합 한 형광 프로브 관심사의 단백질을 분류 하는 것이 중요.

형광 단백질 분자 생물학에 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 낮은 형광 밝기 및 photobleaching에 대 한 안정성 많은 단일 분자 분석에 응용 프로그램을 제한합니다. 양자 점 (Qdots)는 작은 발광 나노 입자4. 그들의 독특한 광 속성으로 인해 Qdots은 10-20 배 더 밝다 고 몇 천 배 더 많은 안정 보다 널리 사용 되는 유기 염료5. 또한, Qdots 있다 큰 Stokes shift (여기 및 방출 봉우리의 위치 사이의 차이)5. 따라서, Qdots 동안 양적 분석에서 이용 될 수 없습니다 오랜 관찰 (시간 분) 및 높은 신호 대 잡음 비율, 이미지의 수집에 대 한 사용할 수 있습니다.

날짜 하려면, site-specifically Qdots와 대상 단백질을 분류 하는 방법은 두 가지: Qdot 활용 된 주 또는 보조 항 체6,,78;의 원조로 또는 대상 단백질 Qdots와 직접, biotin와 streptavidin9,10,11,,1213사이 강한 상호 작용을 기반으로 라벨. Qdots Streptavidin 입히는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리의 최근 연구에서 site-specifically biotinylated 단백질을 높은 효율으로 신진 효 모에 BirA Avi 태그 단백질의 공동 overexpression에 의해 정화 되었다 vivo에서10. 다음 하 고 단일 분자 분석 실험14,15,,1617최적화, 단일 분자 수준의 사용에 Qdot 표시 된 단백질 및 DNA 사이 상호 작용 관찰 TIRFM10.

여기, 우리가 선택한 신진 관심사의 우리의 단백질으로 원래 인식 복잡 한 (오크)을 구체적으로 인식 하 고 자율적으로 복제 시퀀스 (ARS)에 바인딩할 수, 효 모. 다음 프로토콜 TIRFM를 사용 하 여 Qdot 표시 된 오크 ARS와의 상호 작용을 시각화 하는 단계별 절차를 제공 합니다. Site-specifically 수정된 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름 셀 어셈블리 및 단일 분자 이미징의 준비는 설명 합니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. λ-ARS317 DNA 기판의 준비

  1. DNA 기판 건설 및 포장
    1. 소화 Xho을 사용 하 여 네이티브 λ DNA 나 효소; ARS317 신진의 genomic DNA에서 20를 포함 하는 뇌관을 사용 하 여 효 모 543 bp DNA 조각 베어링 증폭 bp 동종 시퀀스의 업스트림 및 다운스트림 Xho나 람다 DNA에서 효소 사이트. 추가 100 ng Xho의 λ DNA와 10 소화 DNA의 ng 동종 재결합 반응 시스템, 10 µ L를 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 반응을 품 어.
    2. 재결합 λ DNA 패키지, 재결합 제품으로 람다 포장 추출의 25 µ L을 추가 하 고 90 분 30 ° C에서 반응을 품 어. 그런 다음 람다 포장 추출 반응 관에의 한 추가 25 µ L를 추가 합니다. 계속 품 어 90 분 30 ° C에서 반응.
    3. 반응 시스템에 살 균 희석 버퍼 (10 mM Tris HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 m m MgCl2)의 500 µ L을 추가 하 고 부드럽게 튜브를 거꾸로 여러 번 설정 하 여 혼합. 클로 프롬의 25 µ L을 추가 하 고, 부드럽게 혼합, 4 ° c.에 저장
    4. 포장 된 살 균 소의 100 µ L 및 100 µ L 세균 LE392MP의 추가 (0.8-에서 교양 1.0 파운드 매체 10 mm MgSO4추가 사용 하 여) 새로운 튜브로. 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    5. 4 mL oftop agar (파운드 매체 + 0.7% agar 10mm MgSO4, 48 ° C에 냉각)으로 살 균 소 박테리아 혼합물의 200 µ L를 추가 합니다. 즉시 튜브를 거꾸로 여러 번 설정 하 여 혼합 하 고 미리 따뜻하게 (37 ° C) 파운드 접시에 부 어.
    6. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어 그리고 λ-ARS317 패 PCR를 사용 하 고 시퀀싱 화면.
  2. 액체 lysates11,18 에서 DNA 기질 정화
    1. 살 균 ddH2O 10 m MgCl2 와 10 nM CaCl2의 200 µ L로 한 패를 선택 합니다. 200 µ L의 박테리아 LE392MP (파운드 매체에서 교양된 하룻밤)와 함께 혼합 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    2. NZCYM의 100 mL에 박테리아 살 균 소 혼합물을 추가 (10 g/L 뉴질랜드-아민, 5 g/L 효 모 추출 물, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino의, 그리고 2 g/L MgSO4·7H2O) 37 ° c.에 7 h에 대 한 문화와 매체 문화에 클로 프롬의 250 µ L을 추가 하 고 다른 10 분 동안 흔들어.
    3. 200 mL 플라스 크에 문화를 전송 합니다. NaCl (1 M 최종 농도)의 5.8 g를 추가 하 고, 해산 저 어 30 분 동안 얼음에 품 어.
    4. 셀 파편 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심. 200 mL 플라스 크에는 상쾌한을 수집 하 고 10% 말뚝8000 (m/V) 추가. 자석 교 반 장치에 의해 해산 하 고 30 분 이상 얼음에 품 어 저 어.
    5. 살 균 소 침전에 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심. 제거는 상쾌한.
    6. 살 균 소 희석 버퍼의 2 mL에 침전을 resuspend. 15 mL 튜브로 전송 하 고 RNase (최종 농도 20 µ g/mL)의 10 µ L 및 DNase (최종 농도 5 µ g/mL)의 40 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    7. 0.3의 2 개 mL를 추가 M Tris HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1.25 %SDS, 15 µ L 성분 K (최종 농도 10 µ g/mL). 10 분 동안 65 ° C에서 품 어.
    8. 사전 냉각된 칼륨 아세테이트 (3 M, pH 4.8)의 2 개 mL를 추가 하 고 10 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.
    9. 불용 성 물질을 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 8000 x g에서 원심.
    10. 에 상쾌한 소 프로 파 놀의 0.7 x 볼륨을 추가 합니다. 거꾸로 여러 번 튜브를 설정 하 여 혼합 하 고 실내 온도 (RT)에 2 분 동안 품 어.
    11. DNA를 침전 하는 RT에 10 분 동안 8000 x g에서 원심. 제거는 상쾌한.
    12. 일단 70% 에탄올 10 분에 대 한 8000 x g에서 원심 분리 하 여 제거는 상쾌한 DNA를 씻어.
    13. 부드럽게, 500 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 m m EDTA, pH 8.0)를 사용 하 여 DNA elute 그리고 1.5 mL 튜브에 DNA를 전송.
    14. 두 번 페 놀을 사용 하 여 DNA를 추출: 10 분에 대 한 8000 g에서 원심 분리 하 여 클로 프롬.
    15. 0.7 x 볼륨 소 프로 파 놀과 침전. 거꾸로 튜브, 부드럽게 내려와 10 분 동안 8000 x g에서 원심 회전 하 여 혼합.
    16. 한 번 70% 에탄올으로 씻어, 테의 200 µ L에서 resuspend. DNA 농도 측정 하 고 12.5 µ g aliquots에-20 ° C에서 저장.

2. λ-ARS317 DNA Biotinylation

  1. Biotinylated oligonucleotides phosphorylate를 (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-비오 틴-3') 출신의 왼쪽된 끝에 보완 λ DNA, oligonucleotides ddH2O, 1 µ L의 리가 버퍼, x 10의 7.5 µ L, T4 PNK의 0.5 µ L의 1 µ L (100 µ M)를 추가. 3 h 37 ° C에서 반응을 품 어.
  2. Λ-ARS317 phosphorylate, λ-ARS317의 12.5 µ g, 3 µ L 리가 버퍼 x 10의 추가, T4 PNK ddH2O 30 µ L의 총 볼륨의 1 µ L 3 h 37 ° C에서 반응을 품 어.
  3. Λ-ARS317와 oligonucleotides anneal, phosphorylated oligonucleotides의 0.5 µ L, ddH2O, phosphorylated λ-ARS317 관에 10 × 리가 버퍼의 25 µ L의 195 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 거꾸로 설정 하 여 혼합 하 고 65 ° C 블록 히터, 고 하자 블록에 33 ° C 아래에 샘플 쿨 5 분 턴에서 품 어.
  4. Λ-ARS317와 oligonucleotides 선, T4 DNA 리가의 1 µ L와 ATP (200 m m)의 0.63 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 거꾸로 설정 하 여 혼합 하 고 하룻밤 실 온에 2 시간 또는 4 ° C에서 품 어. 1 개월에 4 ° C에서 저장 합니다.
    참고: 헤어 지는 DNA를 방지 하려면 모든 혼합 단계 할 수 하 여 부드럽게 튜브 거꾸로, 펫을 사용 하 여 혼합 하는 대신.

3. Coverslip 청소 및 기능화

  1. 청소 하는 Coverslip
    1. 4 착 색 항아리 (5 coverslips/병)에 장소 20 coverslips 에탄올, 30 분 동안 sonicate 고 초순 H2O 3 시간 coverslips를 헹 굴.
    2. 1 M 수산화 칼륨 (KOH), 30 분 동안 sonicate 고 초순 H2O 3 시간 coverslips를 헹 굴. 에탄올 및 코 쥡니다 한 번 반복 합니다.
    3. 30 분 동안, 아세톤과 sonicate 고 다음 초순 H2O 철저 하 게 린스 (3 번 이상).
      참고: 아세톤 제거 해야 합니다 철저 하 게 rinsing 초순 H2O, 여 때 실수로 고생 솔루션 (아세톤) 등 유기 용 매 혼합 폭발이 발생할 수 있기 때문에14.
    4. 피 라 솔루션에는 coverslips를 배치 (H2의 3:1 혼합 등4 과 30% H2O2)와 1 시간 동안 95 ° C에 품 어.
      참고: 피 솔루션은 높은 활력과 침식, 그래서 신중 하 게 사용. 준비할 때 피 솔루션, 500 mL 유리 비 커에 H2O2 의 50 mL를 먼저 추가 하 고 그래서 H2의 150 mL를 추가 합니다4 비 커에 천천히.
    5. 5 번 초순 H2O coverslips를 헹 구 십시오. 다음 각 coverslip 초순 H2O 3 비 커 가득 초순 H2O를 사용 하 여 철저 하 게 세척 하 고 건조 coverslip는 coverslip의 가장자리에서 종이 사용 하 여. 얼룩 항아리에는 coverslip를 놓고 30 분 동안 coverslip 110 ° C 오븐에서 철저 하 게 건조 합니다.
      1. 메탄올을 가진 coverslip 린스 고 얼룩 단지 110 ° C 오븐을 다시는 coverslip 철저 하 게 건조 합니다.
        참고:는 coverslip 철저 하 게 건조 매우 중요 하다, 물19존재는 일단 항 가능한 표면 구조를 많이 있을 것 이다 때문에.
  2. Coverslip 기능화
    1. 실 란 솔루션의 70 mL을 추가 (93% 메탄올, 아세트산, % 및 2 %5 항) 각 항아리에 뚜껑을 나사와 하룻밤 실 온에서 항아리를 두고.
    2. 워시와 3.1.5, 건조 오븐에서 그들을 배치 하는 대신 철저 하 게 질소 가스를 사용 하 여 coverslips를 제외 하 고 단계에 설명 된 대로 coverslips를 건조.
    3. 0.1 m M 신선한 만든 NaHCO3 (pH 8.2) 1 mL에 150mg mPEG (methoxy-폴 리 에틸렌 글리콜)의 biotin-말뚝 (biotin-폴 리 에틸렌 글리콜)의 6 mg를 철저 하 게 분해. 17 다음 원심 분리기, 불용 성 못을 제거 하는 1 분 동안 000 x g.
      참고: 갓 만든된 NaHCO3 은 준비; pH를 조정할 필요가 있다.
    4. 상자에 silanized coverslips를 놓고 두 개의 작은 coverslips silanized coverslips의 두 끝 위에 넣어. 100 µ L silanized coverslip의 중앙에 못 솔루션의 플라스틱 그리고 다른 silanized coverslip 상단에 배치.
    5. 습기가 유지 상자에 일부 초순 h 조2O를 추가 하 고 어둠 속에서 적어도 3 h 말뚝 솔루션 coverslips를 품 어. 야간 보육도 사용할 수 있습니다.
    6. Coverslip 쌍을 분리 하 고 기능성된 표면 얼굴 유지, 린스 초순 h 조2O를 사용 하 여 광범위 하 게, coverslips 질소 가스와 함께 그들을 건조.
    7. 표시 마커 펜, 기능성된 측면 얼굴, 상자에 넣어에 저장 하는 상자 진공 desiccator 1 개월 유지를 사용 하 여 모서리 중 하나에 coverslips의 기능성된 측면.
    8. 긴 시간 동안에 coverslips를 저장 하 한 coverslip 모자에 1 개의 구멍을 뚫고 50 mL 튜브에 다음 비닐 봉지에 튜브를 넣어 놓고 진공 실러를 사용 하 여 가방을 봉인 합니다. 이 방법에서는, coverslips는 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 약 3 개월.

4. 흐름 셀 조립

  1. 양면 테이프 (30 m m × 12 m m)는 주먹을 사용 하 여 조각의 센터에서 15 m m × 2 m m 채널을 절단.
  2. 양면 테이프의 종이 쪽을 벗기십시오 고 두 개의 구멍을 유리 슬라이드에 붙여 넣습니다. 기포 제거를 누릅니다. 우리의 경험을 바탕으로, 그것은 쉽게 양면 테이프의 플라스틱 측면 보다 종이 쪽을 벗 하 여 기포를 제거 하.
  3. 4 기능성된 coverslip (60 m m × 24 m m)를 잘라 조각 (30 × 12 mm) 다이아몬드로 만들어진 유리를 사용 하 여 학자, 하 고 질소 가스를 사용 하 여 파편을 제거. 기능성 유지 해야 측면 얼굴.
  4. 이중 면 테이프의 플라스틱 면을 벗기십시오 고 기능성된 coverslip에 슬라이드를 붙여 넣습니다. 기포는 coverslip와 테이프를 제거 하려면을 살짝 누릅니다. 철저 하 게 공기 방울을 제거 버퍼 했다 그것으로 펌핑 하는 동안 누출에서 흐름 세포를 보호할 수 있습니다.
  5. 입구와 출구 배관에 삽입 작은, 큰 구멍, 각각. 에폭시를 사용 하 여 튜브를 수정 합니다.
  6. Streptavidin (0.2 mg/mL)의 20 µ L 주사기를 사용 하 여 수동으로 흐름 세포로 펌프 하 고 10 분 동안 RT에서 품 어. 블로킹 버퍼10 streptavidin, 대체 흐름 세포로 펌프 그리고 실내 온도에서 보관.

5. 단일 분자 시각화

  1. 532 nm 레이저와 640 nm 레이저를 사용 하 여 동시 여기 빨간색과 형광 현미경 테스트 슬라이드 # 1에서 a 5와 빨강의 초점 맞춤 얻을. 듀얼 파장 광학 (참조 테이블의 재료)를 분할 이미지를 생산.
  2. 흐름 세포를 현미경에 놓고 10 mL 스프링 자동된 주입/철수 프로그래밍 가능 펌프에 설치 된 더 이상 배관 연결 콘센트 배관 연결.
    참고: 주사기를 흐름 셀의 입구 배관에서 버퍼를 인출 하는 방법 아래에 언급 하는 흐름 셀으로 버퍼를 펌핑.
  3. 공기를 신속 하 게 제거 하 여 흐름 셀에 버퍼 차단이 되었는지 확인 흐름 셀에 500 µ L/min에서 블로킹 버퍼를 펌프. 그리고 흐름 세포에 200 µ L/min에서 블로킹 버퍼를 펌프 콘센트 튜브 입구 배관 및 흐름 셀에서 기포를 완전히 제거를 플립.
    참고: 모든 버퍼 흐름 셀으로 펌핑 해야 될 degassed 진공 desiccator에 사용 하기 전에 적어도 15 분 동안.
  4. 블로킹 버퍼의 80 µ L로 biotinylated λ-ARS317 DNA의 0.5 µ L을 추가 하 고 2 분 25 µ L/min 흐름 셀에 펌프. 다음 50 µ L/분의 속도로 차단 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 λ-ARS317 DNA 플러시.
  5. 흐름 세포에 블로킹 버퍼를 제거 하 50 µ L/min의 속도로 버퍼10 바인딩 200 µ L 펌프.
  6. 0.2 µ L streptavidin 입히는 Qdot705 (1 µ M)의 추가 및 biotinylated 오크의 0.2 µ L (1.2 µ M) 튜브로 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 다음 버퍼 튜브에 바인딩 20 µ L을 추가 하 고 얼음에 놓습니다. 오크 Qdot705 의 최종 농도 약 10 nM.
  7. 2 µ L 오크 Qdot705 의 추가 (10 nM), DTT (100 m m), 바인딩 버퍼의 96 µ L로 ATP (200 m m)의 1 µ L의 1 µ L. 오크 Qdot705 의 최종 농도 0.2 nM.
  8. 흐름 셀에 10 µ L/min의 속도로 0.2 nM 오크 Qdot705 의 20 µ L를 펌프. 100 µ L/min의 속도로 바인딩 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 과도 한 오크 Qdot705 의 밖으로 플러시. 다음 100 µ L/min의 속도로 DNA 기판 얼룩 흐름 셀으로 30 nM SYTOX 오렌지 펌프 바인딩 버퍼.
  9. 오크 Qdot705 신호를 자극 하 고 SYTOX 오렌지 스테인드 DNA 신호 각각 405 nm 레이저와 532 nm 레이저를 사용 하 여. 쿼드-밴드 대역 통과 필터 (FF01-446/510/581/703-25)를 사용 하 여 100 µ L/min 흐름으로 신호를 동시에 관찰 하 고 프레임 당 100 ms와 EM CCD로 이미지를 기록 합니다. 다양 한 분야에서 20 이미지 스택을 수집 합니다.

6. 데이터 분석

  1. 캘리포니아 대학교 샌 프란 시스 코 박사 론 베일의 연구소에 의해 개발 된 이미지 플러그인 (OI_cut_RGBmerge)를 기반으로 하는 새로운 플러그인, 스스로 의해 수정 되는 피지 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 자르기.
    1. 이미지 (512 × 512 픽셀)의 스택 이미지 (256 × 256 픽셀)의 2 개 더미로 자르기. 하나는 532 nm 레이저 흥미로운 결과, 그리고 다른 한 405 nm 레이저 흥미로운 결과.
  2. 피지-이미지-스택-Z 프로젝트 (평균 강도)를 사용 하 여 61 순차적인 이미지를 처리 합니다.
  3. 측정 길이 (LDNA) DNA와 dna의 DNA에 오크 Qdot705 (L오크) 바인딩 사이트에서 거리의 끝을 수동으로 곁.
  4. L오크/LDNA 의 결과 계산을 사용 하 여 excel r, 부트스트랩 메서드를 사용 하 여 데이터를 분석 그리고 히스토그램을 생성, 가우스 배급에 맞게.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qdot 표시 된 오크는 ARS의 상호작용을 시각화 하려면 우리가 먼저 λ-ARS317 DNA 기판 건설. ARS317를 포함 하는 DNA 조각 통합 되었다 Xho에 내가 사이트 (33.5 kb) 네이티브 λ DNA의 동종 재결합 (그림 1A). 재결합 제품 추출 물을 사용 하 여 패키지 된 고 포장된 살 균 소 입자 파운드 플레이트 (그림 1B)에 경작 되었다. 긍정적인 살 균 소 패 PCR에 의해 상영 되었고 (그림 1C)을 시퀀싱에 의해 확인. Λ-ARS317 DNA는 액체 lysates (그림 1D)에서 순화 되었다.

단일 분자 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 선물이 Qdot 표시 된 단백질 및 흐름 셀에서 TIRFM는을 사용 하 여 site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 관찰 하는 프로토콜. 필요한 단계는 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름-세포 준비, 및 단일 분자 이미징 사이트 수정 포함 됩니다. 주목 해야 한다 두 가지 요점을 확인 하 고 있습니다. 첫째, λ DNA와 관련 된 단계, 예를 들어, 어떤 가능한 손상 감소를 부드럽게 조작 해야 모든 반복적으로 아래로 pipetting으로 혼합을 피하. 둘째,는 coverslip 충분히 깨끗 하 고는 배경 잡음을 최소화 되도록 매우 중요 하다. Coverslip 청소 및 기능화 과정 물, 초순 수준에 도달 해야 하며 공기 먼지 무료. Coverslip 기능화 및 흐름 셀 조립 깨끗 한 벤치에서 실시 하는 것이 낫다.

단백질 DNA 상호 작용을 공부에 대 한 단일 분자 분석 실험,...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리 닥터 하 산 Yardimci 감사 하 고 종류의 프랜시스 크릭 연구소의 Dr.Sevim Yardimci 도움이 단일 분자 실험에의 컬럼비아 대학, 박사 에릭 C. 그린의 연구소에서 박사 다니엘 Duzdevich 박사 유지 북경 대학교의 태양과의 Chunlai 첸 박사 칭화 대학 유용한 토론에 대 한입니다. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 31371264, 31401059, CAS 혁신 팀과 뉴턴 고급 친교 (NA140085)에서 왕 사회에 의해 지원 되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
람다 DNA뉴 잉글랜드 BiolabsN3011저장소 25 μ L 분취량은 -20 ºC입니다.
XhoI 효소Thermo Fisher ScientificFD0694
신속 융합 클로닝 키트BiotoolB22611
MaxPlax Lambda
Packaging Extracts		Epicentre MP5110Bacterial strain LE392MP
이 이 패키지에 포함되어 있습니다.
MgSO4Sinopharm 화학 시약 Co., 주식 회사10013092모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical worksN/A모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.
MgCl2Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd10012818
클로로포름베이징 화학 작품N/A모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.
NZ-amineAmrescoJ853-250G
카사미노산Sigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
자기 교반 장치IKAKMO2 basic
15 mL Eppendorf tubeEppendorf3012215115 mL, sterile, bulk, 500pcs
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
비오틴화 프라이머Thermo Fisher ScientificN/A
T4 DNA 리가제, T4 DNA 리가제, 반응 완충액 (10x)New England BiolabsM0202
커버슬립Thermo Fisher Scientific22266882
에탄올Sinopharm 화학 시약 유한 공사10009259
수산화 칼륨 (KOH)시그마 - 알드리치306568-100G
아세톤열 피셔 사이언티픽A949-4
H2SO4Sinopharm 화학 시약 유한 공사80120891황산
H2O2Sinopharm 화학 시약 1001121830% 과산화수소
메탄올시그마-알드리치322415-2L
아세트산시그마-알드리치V900798
APTES시그마-알드리치A3648
mPEG
(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)		리산mPEG-SVA-5000
비오틴-PEG
(비오틴-폴리에틸렌 글리콜)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
진공 건조기Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
진공 실러MAGIC SEALWP300
다이아몬드 팁 유리 스크라이브ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES70036
유리 슬라이드세일 브랜드7101
입구 튜브SCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2내경 0.38mm, 외경 1.09mm.
출구 튜빙SCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4내경 0.76mm, 외경 1.22mm.
양면 테이프Sigma-AldrichGBL620001-1EA
에폭시LEAFTOP90055분 에폭시
StreptavidinSigma-AldrichS4762
형광 현미경OlympusIX71
주입/철수
프로그래밍 가능한 펌프		Harvard 장치70-4504
532nm 레이저Coherent사파이어 -532-50
640 nm 레이저CoherentOBIS-640-100
EMCCD 카메라AndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
분할 광학		Hamamatsu photonics K.K.A12801-01
TIRF 조명 시스템올림푸스IX2-RFAEVA2
60× TIRF 대물렌즈올림푸스APON60XOTIRF
쿼드 에지 레이저 이색성
빔스플리터		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
쿼드 밴드 대역 통과 필터SemrockFF01-446/510/
581/703-25
Dichroic beamsplitterSemrockFF649-Di01-25x36
방출 필터크로마 기술 CorpET585/65m
방출 필터Chroma Technology CorpET665lp
FocalCheck 형광, 현미경 테스트 슬라이드 #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX 오렌지Thermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Streptavidin ConjugateThermo Fisher ScientificQ10163MPStore 4 º에서; C, 얼지 마십시오.
ATPAmresco0220-25G200 mM ATP 용액을 준비하고, ddH2O를 사용하여 pH를 7.0으로 조정하고, 10 μ L 분취량은 -20 ºC입니다.
DTTAmrescoM109-5GddH2O를 사용하여 1M 용액을 준비하고 10 &mu를 저장합니다. l -20 ºC에서 부분 표본.

References

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