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방법 논문

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

17.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57971

⸱

2018년 7월 27일

 ,  , 
1The Autophagy Team, Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 측정 하기 위한 간단 하 고 잘 검증 된 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 전체 셀룰러 LDH 수준에 비해 sedimentable 셀 분수에 젖 산 효소 (LDH)의 비율을 측정에 기반.

초록

대량 autophagy 더블/멀티 membrane 구조에 autophagosomes 되 나 큰 부분의 세포질의 격리에 의해 특징입니다. 여기이 프로세스를 모니터링 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 일반적인 결과 및 경작된 한 포유류 세포의 다양 한 종류에서 autophagy 유도 조건 방법의 실험적인 검증 제공 됩니다. 대량 autophagy, 동안 autophagosomes cytosol, 그리고 그로 인하여 또한 다른 autophagic 화물 함께 녹는 cytosolic 단백질 격리. LDH는 안정적이 고 높은 비 선택적으로 autophagosomes에 분리 된 풍부 하 고, 녹는 cytosolic 효소 이다. LDH 격리의 양에 따라서 대량 autophagic 격리의 양을 반영합니다. 우리 cytosolic LDH, sedimentable의 효소 활동의 측정에 의해 뒤에서 sedimentable를 효과적으로 분리 하는 분류 electrodisruption-기반 프로토콜을 사용 하는 효율적이 고 정확 하 게 확인 하려면 LDH 격리 셀에, 전체 셀 샘플 대의 분수 Autophagic 격리 sedimentable 그에서 치료 세포 치료 셀에 LDH의 비율을 빼서 결정 됩니다. LDH 격리 분석 결과의 장점은 그것은 다른 방법에 반대 생 화물의 autophagic 격리의 양적 측정 하거나 격리 프로브 또는 반 양적 protease의 소성 식 포함 제공 autophagy 마커 또는 수용 체의 보호 분석입니다.

서론

Autophagy ("먹는 자"에 대 한 그리스어) 세포내 물질의 vacuolar lysosomal 저하에 대 한 진화 보존된 과정 이다. 효 모와 인간 autophagy 중요 autophagy 관련 ("ATG") 유전자의 발견 즉시 실현 그 autophagy 인류 건강 및 질병 (의학 또는 생리학에 있는 노벨상 2016에 의해 인정에 중요 한 역할을 담당 요시노 리 Ohsumi) autophagy 빠르게 되고있다 세포 생물학1,2에서 가장 심각 하 게 공부 과정 중 하나.

Macroautophagy ("autophagy" 라 함)은와 효과적으로 격리 하는, 이중 또는 다중 membrane 구조 ("autophagosomes")에 세포내 막 cisternae ("phagophores")의 접는 확장 특징은 휩 싸이 세포질의 나머지에서 자료. Autophagosomes와 리소좀의 융합에 내부 autophagosomal 막과 분리 된 화물은 저하 고 재활용. Autophagosomes 무작위 (비 선택적 autophagy)와 선택적 (선별 autophagy) 매너 세포질 물질을 격리 수 있습니다. 대량 autophagy 대부분 비 선택적이 고 선택적 autophagy의 혼합을 나타냅니다.

1960 년대와 70 년대 ("형태"의 시대 autophagy 연구)에서 autophagic 격리 주로 ultrastructural 분석을 통해 평가 했다. 1980 년대에서 1990 년대 ("생 화 확 적인 시대") 당 Seglen와 동료의 시작-누가 주 쥐 hepatocytes에서 autophagy 공부-양적 autophagic 격리 활동3를 측정 하는 첫 번째 방법을 개발. 이 분석 실험을 사용 하 여, Seglen 정의 autophagic lysosomal 통로가4,5의 다른 단계를 특징, 발견 만들어낸 amphisome6 (endosome autophagosome 퓨전의 제품), 그리고 처음 autophagy 조절7인 산화 단백질의 역할을 설명 합니다. 그러나, 1990 년대에서 ATGs ("분자 시대")의 발견과 포유류 ATG8 단백질의 첫 번째 특성, 후 microtubule 관련 단백질 1A/1B-라이트 체인 3 (LC3) 20008, ATG 단백질에 대 한 표식으로의 사용에에서는 autophagic 과정 신속 하 게 얻은 인기, 그리고 더 오래 되 고 더 힘 드는 생 화 확 적인 방법 뒤에 남았다. 사실, 지난 18 년 동안, 서쪽 오 점 및 LC3의 형광 현미경 분석 되었다 지금까지 가장 인기 있는 (그리고 많은 경우에) 공부 하는 포유류 세포에서 autophagy의 의미. 장점은 상대적으로 완화는 이러한 방법을 밖으로 실행 될 수 있다입니다. 단점은 저거 카트 구성 요소 (LC3)을 공부 하 고 실제 autophagic 화물 보다는. 이 상태 또는 격리 대 통로 통해 LC3의 유량과 화물의 유량의 관계를 매우 명확 하지 때문에 오히려 심각한 단점입니다. 사실, 우리는 대량 화물 유동 조건에서 높은 수준에서 유지 될 수 있다 나타났습니다 셀9에 활용 된 LC3의 존재에도 불구 하 고 아무 LC3 플럭스입니다. 또한, 우리는 대량 autophagy 효율적인 LC3 고갈에 의해 영향을 받지 않습니다 이며 따라서 가능성이 LC3 독립적인9시연. 이 찾는 나중 LC3 노크 아웃 연구10,11, 또한 나타낼 Parkin 종속 mitophagy (미토 콘 드리 아의 선택적 autophagy) LC310,11의 독립에 의해 확인 됐다 .

요약 하자면, 분명 있다 autophagic 활동을 모니터링 하 화물 기반 분석에 대 한 필요. 최적으로 적용, 정의 그리고 수행 하기 쉬운 이러한 분석 광범위 하 게 되어야 합니다. 지난 몇 년 동안 우리는 198012, 당 Seglen에 의해 개발 되었다 sedimentable, autophagic 공포 포함 된 셀을 cytosolic LDH의 전송 측정 기반 LDH 격리 분석 결과에 특별 한 관심을가지고 분수입니다. LDH는 안정, 수용 성 cytosolic 단백질 phagophores enwrap 세포질 화물 때에 압수 쉽게 공동. LDH의 격리 따라서 autophagic 격리의 일반적인 척도 이다. LDH는 autophagic lysosomal 통로가12에 의해 독점적으로 저하 됩니다. 따라서, lysosomal 저하 억제제, 예를 들어, bafilomycin A1 존재 (Baf)13, 실험적인 치료 효과 직접 autophagic 격리 활동에 변경 반영. 저하 억제제의 부재, LDH 격리와 저하에 변경의 그물 효과 측정할 수 있습니다.

LDH는 매우 고 편 모든 세포 유형에 표현 때문에 효소 분석 결과14,15LDH 수준을 정확 하 게 정해질 수 LDH 격리 분석 결과 광범위 하 게 적용 됩니다. 그러나, 원래12 프로토콜-기본 쥐 hepatocytes에 설립-오히려 소모 되었고 시작 물자로 만든 전기 방전 커패시터의 높은 금액을 요구. 단계별 방식으로, 우리는 점차적으로 변형 분석 결과 쉽고 다양 한 방법으로. 첫째, 원래 프로토콜 포유류 세포 라인16에 사용 하기 위해 적응 시켰다. 둘째, 방법은 실질적으로 downscaled3,9이었다. 셋째, 프로토콜의 여러 단계에서 탈락 했다,17단계 힘 드는 밀도 쿠션을 포함 하 여. 이 동시에 샘플 (즉, 적은 약 15 시작 당 12-잘 접시에서 한 우물을 사용 하 여 샘플16 당 10 cm 접시를 사용 하 여 원래 시작 지점에서 메서드의 더욱 상세화를 사용 소재)17. 넷째, 우리는 주문 품 전기 방전 커패시터17를 대체할 수 있는 상업 electroporation 기구 발견.

여기 우리의 최신 프로토콜의 LDH 격리 분석 결과, 이전에 게시17 비교 방법의 몇 가지 더 단순화를 포함 하는 제공 됩니다. 또한, 다른 세포 유형의 수에서 얻은 전형적인 결과 집합이 표시 되 고 중요 한 것은, 유전자 뿐 아니라 약리 최저 및 녹아웃 접근을 사용 하 여 메서드의 실험적인 검증의 여러 줄 제공 됩니다. 전체 프로토콜의 전체 흐름 체계를 위해 그림 1을 참조 하십시오.

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프로토콜

1. 셀 시드 및 치료

  1. 셀에 대 한 선호 문화 매체를 사용 하 여 37 ℃에서 5% CO2 습도 인큐베이터에서 75 cm2 조직 배양 플라스 크에 문화 부착 셀에 입력 합니다. 근처 합칠 셀 계층에 도달할 때까지 성장 하는 세포 수 있습니다.
    참고: 사용 하 여 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) LNCaP, HEK293, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs), 비제이에 대 한 보충 RPMI 1640 매체 MCF-7 및 RPE-1 셀.
    1. 워시 3 mL 37 ° C 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), pH 7.4와 셀. 3 mL 0.25% (w/v) 트립 신-ethylenediaminetetraacetate (EDTA), PBS를 장착 하 고 세포 분리 (2-5 분) 때까지 37 ° C에서 5% CO2 습도 인큐베이터에 플라스 크를 품 어.
    2. 10%를 포함 하는 7 mL 문화 매체와 분리 된 셀 resuspend FBS. 혼합 10 µ L 셀 서 스 펜 션 약 수 10 µ L 0.4 %Trypan 파랑 microcentrifuge 튜브에서 0.5-20 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여. 동일한 피 펫 팁을 사용 하 여 즉시 계산 챔버 슬라이드를 작성 하 고 자동화 된 셀 카운터에 셀.









  1. figure-protocol-1

  2. figure-protocol-2

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결과

프로토콜을 사용 하 여 여기에 설명 된, LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, 헬러, VCaP, H3122, Hec1A를 포함 하 여 다른 포유류 세포 선의 수에 대량 autophagic 격리 활동 MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ, 및 LNCaP 세포 측정 했다. 격리 (에 완전 한, 영양분이 풍부한 매체), 기저 조건 평가 또는 셀에 심하게 굶 어 혈 청 및 아미노산 (한 보 나 fide autophagy 유도 조건22). 결과 표시 LDH 격리 활동 기아 상태에서 다른 셀 라인, LAPC4, DU145, Huh7에서 거의 감지 수준에서 배열에 걸쳐 광범위 하 게 다릅니다 PNT2 LNCaP 셀 (그림 2에에서 ~1.6%/h를 (데이터 표시 되지 않음) 세포

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토론

요약, 여기에 설명 된 프로토콜 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 모니터링 하는 안정적이 고 광범위 하 게 적용 메서드를 나타냅니다. 원래 방법12,16에 비해, 우리 몇 가지 불필요 한 단계를 제거, 몇몇 나머지 단계를 단순화 하 고 상당한 상세화 도입. 결과적으로, 프로토콜은 크게 관련 비용 및 시간-효율성, 향상 하 고 같은 양의 샘플 이제 원래 프로토콜에 비해 절반 이하로 시간에 처리 될 수 있습니다. 24 샘플에 대 한 2-3 단계 (주 1) 필요 더하기 준비의 약 ½ h 효율적인 작업의 3 h ~ 2 h에서 4 (주 2) 단계를 수행할 수 있습니다 반면 (시간 견적을 모든 필요한 버퍼 미리 준비). 1 일반적으로 앞에 세포 치료, Baf 가진 3-4 h 외피 또는 autolysosomal LDH 저하의 다른 억제제를 포함 하 여 하루에 분석 결과 이후 이틀 연속에 분석 결과 분할 편리 하다. 그...

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공개 사항

저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.

감사의 글

이 작품 연구 위원회 노르웨이, 오슬로의 대학, 앤 더 스 년 재단, 난센 재단, 그리고 헨릭 Homan의 메모리에 유산에 의해 재정적으로 지원 되었다. 우리 박사 벅 미즈시마는 ATG5에 대 한 감사 + + MEFs와 ATG5-/-MEFs, 박사 마사 아키 고마쓰는 ATG7에 대 한 + + MEFs 및 ATG7/MEFs, 및 박사 시즈 아키라는 ATG9A에 대 한 + + MEFs 및 ATG9A/MEFs. 우리는 건설적인 방법 론 적 토론에 대 한 기술 지원과 O. Seglen 당 박사에 대 한 프랭크 Sætre을 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 및 2 mL 마이크로 원심분리 튜브 Eppendorf211-2130 및 211-2120
12웰 플레이트 Falcon353043
Accumax  세포 분리 솔루션Innovative Cell TechnologiesA7089-20 ° C 몇 년 동안, 그리고 몇 달 동안 냉장고에서
Bafilomycin A1엔조BML-CM110-0100DMSO
BJ 세포ATCCCRL-2522통로에서 사용 < 30
소 혈청 알부민 (BSA)VWR422361V
버커 계수 챔버Fisher Scientific139-658585
백작 세포 계수 챔버 슬라이드ThermoFisher ScientficC10228
백작 II 자동 세포 계수기ThermoFisher ScientficAMQAX1000
버커 계수 챔버용 커버 유리Fisher Scientific139-658586
Criterion Tris-HCl 젤, 4– 20 %, 26 웰, 15 &마이크로; L, 13.3cm x 8.7cm (W x L) Bio-Rad3450034
DTTSigma-AldrichD0632
Earle's Balanced Salt solution (EBSS)Gibco24010-043conatains 0.1% glucose
EDTASigma-AldrichE7889
Electroporation cuvette (4 mm)Bio-Rad1652088
Exponential decay wave electroporatorBTX Harvard 장치  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS)SigmaF7524RPMI 1640 매체
HEK293 세포: ATCCCRL-1573
ImidazoleSigma-Aldrich5675065 mM 용액을 고압 멸균하고 몇 달 동안 냉장고에 보관
인큐베이터; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubatorNuAireNU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentThermoFisher13778150
LNCaP cellsATCCCRL-1740< 30
3-메틸 아데닌 (3MA)시그마-알드리치M9281재고 100 mM in RPMI in -20 °C.  재고를 65°C로 가열하십시오. C 10분 동안, 최종 농도 10mM에서 사용
Refridgerated MicrocentrifugeBeckman Coulter Life Sciences368831
소프트 모드 기능이 있는 Refridgerated MicrocentrifugeEppendorf 에펜도르프 5417R 
MRT67307 염산염(ULKi)시그마-알드리치(Sigma-AldrichSML0702ULK 키나아제 활성을 억제합니다. DMSO에서 디졸브합니다.
MaxMat 다중 분석기 기기Erba DiagnosticsPL-II
MCF7 셀ATCCHTB-22
NADHMerck-Millipore1.24644.001
NycodenzAxis-Shield1002424
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermoFisher31985062
Phosphate-buffered Saline (PBS)Gibco20012-019
피펫 팁 3 (0.5-20 &마이크로; L)VWR732-2223Thermo Fischer ART 배리어 팁
피펫 팁(1-200 &마이크로; L)VWR732-2207 Thermo Fischer ART 배리어 팁
피펫 팁(100-1,000 µ L)VWR732-2355 Thermo Fischer ART 배리어 팁
피펫ThermoFisher4701070Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407-10X5MG멸균 H2O에서 1 mg/mL 원액을 제조합니다. 이 솔루션은 -20 °에서 안정적입니다. C 최소 1년 동안.
PyruvateMerck-Millipore1066190050
RPE-1 세포 (hTERT RPE-1)ATCCCRL-4000
RPMI 1640Gibco21875-037
SAR-405ApexBio A8883은 포스포이노시티드 3-키나아제 클래스 III(PIK3C3)을 억제합니다. DMSO에서 디졸브합니다.
소음기 네거티브 컨트롤 #1 선택 (siCtrl)ThermoFisher/Ambion4390843
소음기 ATG9 표적 siRNA (siATG9A) 선택ThermoFisher/Ambions35504
소음기 FIP200 표적 siRNA (siFIP200) 선택ThermoFisher/Ambions18995
소음기 ULK1 표적 siRNA (siULK1) 선택ThermoFisher/Ambions15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)ThermoFisher/Ambions18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)ThermoFisher/Ambions22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)ThermoFisher/Ambions24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)ThermoFisher/Ambions22387
인산나트륨 일염기성 이수화물(NaH2PO4 • 2H2O) Merck-Millipore1.06580.1000
인산나트륨 이염기성 이수화물(Na2HPO4 • 2H2O) Prolabo28014.291
설탕VWR443816T물 중 10% 최종 농도; 0.45 &마이크로를 통해 필터링; m 필터를 걸러서 몇 달 동안 냉장고에 보관하십시오
ThapsigarginSigma-AldrichT9033은 SERCA ER Ca2+ 펌프를 억제합니다. DMSO에서 디졸브합니다.
트리톤 X-405 Sigma-AldrichX4051% final
Trypan Blue stain 0.4%Molecular ProbesT10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)Gibco25200-056
Tween-20Sigma-AldrichP22870.01% final
에 용해 의 10 % 최종 농도 use at passage )

참고문헌

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