우리 더 vivo에서 부분 간 미래에 엔지니어링을 공부에 대 한 전제 조건으로 쥐에서 vivo에서 단일 간 엽 관류 모델에 대 한 새로운 수술 기법을 설정 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
기관 공학 이식에 사용 될 수 있다 간 장기 대체를 생성 하는 새로운 전략 이다. 최근, vivo에서 간 엔지니어링, vivo에서 기관 decellularization repopulation 다음, 포함 떠오르고 있다 유망 접근 방식으로 비보 전 간 공학에. 그러나, 수술 후 생존 하지 달성 했다. 이 연구의 목적은 vivo에서 간 엔지니어링에 대 한 전제 조건으로 선택적 간 엽 관류 쥐에서 vivo에서 의 새로운 수술 기법을 개발 하는 것입니다. 우리는 왼쪽된 측면 엽 통해서만 회로 바이패스를 생성합니다. 다음, 왼쪽된 측면 엽은 heparinized 염 분을 끼얹는다. 실험 4 그룹으로 수행 됩니다 (n = 그룹 당 3 쥐) 20 분, 2 시간, 3 h, 그리고 4 헤 생존의 다른 관류 시간으로 색상의 거시적 보이는 변화와 혈액 세포의 조직학 결정된 부재에 따라는 포털 3 인조와 사인, 성공적인 모델 설립에 대 한 지표로 서 가져온 것입니다. 왼쪽된 측면 엽의 선택적 관류, 후 우리는 왼쪽된 측면 엽, 실제로, 아닙니다 빨강에서 희미 한 노란색을 관찰 합니다. 조직학 평가에서 아니 혈액 세포는 문맥, 중앙 정 맥, 그리고는 사인의 지점에 표시 됩니다. 왼쪽된 측면 엽 막힌된 혈관을 재개 후 빨간색으로 바뀝니다. 12/12 쥐 1 주일 이상에 대 한 절차를 살아 남았습니다. 우리는 1 주일 이상 긴 생존 기간 단일 간 엽 관류 비보에 대 한 수술 모델을 보고 처음. 이전 게시 된 보고서와 달리 여기에 제시 된 기법의 가장 중요 한 장점은 관류의 70%의 모든 절차를 통해 유지 됩니다. 이 기술은 설립 vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐, decellularization 및 recellularization를 포함 하 여 기초를 제공 합니다.
서론
장기 이식에 대 한 표시는 지속적으로 확장 하 고 있다. 반면, 장기 기부 속도 장기의 전반적인 품질은 감소, 이식에 대 한 수요 증가에 지도. 간 이식 대기자 명단에 추가 하는 후보자의 수 증가를 계속 (예를 들어, 미국에서 11,340 환자는 2016 년, 추가 된 10,636에에서 비해 2015)1. 상당한 노력에도 불구 하 고 사용 가능한 기관의 수는 임상 요구를 충족 하지 않습니다. 때문에 간 질환의 발병 률 증가, 많은 환자는 기증자 기관 전에 이식 대기자 명단에 말기 간 질환 다 사용할 수 있습니다. 간 기증자 이식에 대 한 거 대 한 수요를 충족 하기 위해 간 조직 엔지니어링 원칙을 적극적으로 되는 사용 하 여 대체 방법을 추구2. 요즘, 간 엔지니어링의 새로 개발된 된 생물 기술 잠재적으로이 부족을 극복할 수 있습니다.
간 엔지니어링 두 단계로 구성 됩니다: acellular 비 계, 발판의 repopulation 다음의 세대. 생물 학적 acellular 간 비 계를 얻으려면 explanted 간 끼얹는다 시스템을 통해 혈관에서 간 세포 물질을 제거할 수 있습니다 또는 비 이온 세제입니다. 대부분의 이전 연구에서 생물 acellular 간 비 계는 나트륨 라우릴 황산 염 및 TritonX100의 조합으로 간 관류에 의해 달성 되었다. 그 결과, 모든 셀 세포 외 매트릭스의 구조를 유지 하는 반면, 제거 되었다. 기관 건설 기계와 성숙한 세포, 간세포, 내 피 세포 선, 및 내 피 세포 또는 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 동시 응용 프로그램의 유무에 관계 없이 기본 hepatocytes 다시 시드해야 했다. 대부분의 연구원은 초점 비보 전 간 엔지니어링3,,45,6,7,8,9,10, 11,12,,1314. 그러나, 대부분의 이전 연구에서 작은 조각의 다시 채울 발판 큐브 다른 heterotopic 이식 사이트에 이식 했다. 몇 가지 연구에서 다시 채울 부분 건설 기계 보조 이식으로 이식 했다. 그러나, 최대한 보고 생존에 72 h8,14했다. 우리가 아는 repopulated 전체 간 이식의 orthotopic 이식은 아직 된 또는 수행에 대 한 게시. 장기 기능과 설계 기관의 이식 그들의 초기에서 여전히 있습니다. 따라서, 공학 비보 전 간 다른 접근은 필요 하다.
Vivo에서 간 공학 간 repopulation 생리 적 조건 하에서 공부 하는 대안을 나타낼 수 있습니다. Vivo에서 간 엔지니어링 비보 전 간 공학에 비해 장점은 매니폴드입니다. Vivo에서 다시 채울 부분 간 발판은 적절 한 온도, 충분 한 산소, 영양소, 및 관류 비보 전 인공 문화 매체와 달리 성장 요인 생리 혈액 관류를 받게 됩니다. 또한, 나머지 부분 정상 간 간장 기능, 주로 장기 생존을 수 있도록 유지 합니다. 이식 비보 전 설계 간 이식 실험 동물의 장기 생존을 유지 하는 그것의 간 기능8의 수 이므로, 우리는 vivo에서 부분 간 engineeringwould 궁극적으로 될 계획을 유망 모델 추가 비보 전보다 더 긴 생존 관찰과 조작된 간의 진화를 연구 하.
최근, 하나의 연구 그룹 (팬 및 동료) 제시, 처음으로, vivo에서 간15엔지니어링의 기술. 그들은 해부학 및 기술 문제에도 불구 하 고 살아있는 쥐에서 바로 열 등 한 간 엽의 절연된 관류 달성. 그들은의 repopulation vivo에서 쥐 주 hepatocyte 셀 라인을 사용 하 여 첫 번째 자가 결과 보고. 그러나, vivo에서 외과 관류 모델의 팬 외. 단점이 있습니다. 그들은 완전히 문맥 및 동물에 심각한 피해를 일으킬 수 있습니다 열 등 한 베 나 정 맥 차단 희생 쥐에서 단일 간 엽 관류 달성. 실험 쥐의 자가 관측 시간 6 시간만에 후 희생 했다. 따라서, vivo에서 간 엽 관류 기술을 더 개선 수술 후 생존을 달성 하기 위해 필요 합니다.
우리 쥐16, hemodynamic 쥐17, 및 간 바이오 모니터링을 위한 포털 정 맥 cannulation 기술 간 해부학의 이전의 연구에 따라 간 엽 관류, 비보에 대 한 새로운 생존 모델 개발 18 , 19. 절차에 대 한 주요 단계 그림 1A - 1E에 나와 있습니다.
이 기술은 기관 질환에 대 한 화학 절제로 약물 주입, vivo에서 decellularization에 의해 기본 연구 부분 장기 치료에 대 한이 실험 vivo에서 관류 모델을 사용 하 고 싶은 사람들을 위해 적당 하다 (예: , 간 암), 세포 배양의 비보 전 2 차원 및 3 차원 비교 decellularized 매트릭스 vivo에서 세포 문화 시스템20,21,,2223 , 24 , 25 , 26, 그리고 vivo에서 decellularization와 repopulation 엔지니어링 간.
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프로토콜
주택 및 실시 하는 모든 절차는 독일 동물 복지 입법에 따라 했다. 모든 거 즈, 덮 음 옷, 그리고 수술 악기 압력가 마로 소독 하 고 수술을 하기 전에 준비 있습니다. 모든 절차는 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.
1. 수술에 대 한 쥐의 준비
- 유도 챔버에 쥐를 놓고 쥐 완전히 마 취 때까지 약 3 분, 0.5 L/분 100% 산소와 4% 증발 isoflurane 쥐를 anesthetize.
- 유도 실에서 쥐를가지고 고 그것의 몸 무게를 측정.
- 복 부에 수술의 모피를 면도.
- 마 취를 추가 2 분 동안 isoflurane 챔버에 동물 다시를 넣으십시오.
- 부정사 위치에 작업 테이블에 쥐를 놓습니다.
- 쥐의 입 지역에 마 취 마스크를 수정 하 고 2% 증발 isoflurane와 0.5 L/min의 유량에서 100% 산소의 지속적인 가스 교류와 취 동물 유지.
- 테이프의 조각을 가진 사지를 수정 합니다.
- 건조를 방지 하기 위해 두 눈에 수 의사 연 고를 적용 합니다.
- 관리 buprenorphine 0.05 mg/kg 피하, 작업 기간 동안 통증을 완화 하.
- 70% 알코올의 2 라운드 뒤 요오드 팅 크의 3 라운드와 복 부의 수술 분야를 소독.
- 장소에 있는 절 개 만든 것입니다만 노출 하는 복 부의 작업 필드를 두고 주변 거 즈 멸 균.
- 쥐의 발가락-핀치 철수 반사 이다 결 석 하는 경우 작업을 수행 하는를 진행 합니다.
2입니다. 개복 술이 쥐의
- 가로 복 부 피부와 근육 절 개를가 위 및 전기 coagulator 사용 하 여 확인 합니다.
- 수정 하 고 4-0 폴 리 프로필 렌 봉합 사를 사용 하 여 머리 쪽으로 칼 프로세스를 당겨.
참고: 주의 간 칼 프로세스 더 나은 폭로를 수직으로 들어올려 하지만 심한 호흡 제한 및 질 식 방지 하기 위해 신중 하 게 진행. - 간 노출 하 두 subcostal 후크 머리 쪽으로 복 부 벽의 양쪽을 당겨 복 막 구멍을 엽니다.
- 십이지 장 및 소장을 건조를 피하기 위해 moistened 거 즈와 복 부 구멍에 커버.
- Moistened 거 즈를 사용 하 여 왼쪽 및 오른쪽 중간로 브를 들어올려 고 간 hilum 더 폭로를 가슴에 대 한 그들을 잡아.
- Stereomicroscope (8 배 확대)에서 쥐를 놓습니다.
- 드롭 일부 따뜻한 식 염 수에 복 부 및 간 및 내장의 표면에 몇 분 마다 전체 절차 동안 건조를 방지 하기 위해.
3. 왼쪽된 측면 엽 내 바이패스 통로의 설립
- 왼쪽된 문맥을 해 부하 고 기지 (그림 2A)에서 6-0 비단 봉합 사로 선.
- 왼쪽된 중간 엽 (그림 2B)에 perfusate의 흐름을 방지 하기 위해 마이크로 클램프 왼쪽된 간 동맥, 왼쪽된 중간 문맥, 왼쪽된 중간 간 동맥, 및 왼쪽된 중간 담 즙 덕트 왼쪽된 담 즙 덕트를 차단 합니다.
- 마이크로 위 왼쪽된 측면 엽 엽의 주변 인 대를 잘라 구분 합니다.
- 마이크로 클램프 (그림 2C)와 왼쪽된 측면 엽의 기지에서 클램핑 함으로써 왼쪽된 측면 간 정 맥을 차단 합니다.
참고: 실수로 왼쪽된 포털 정 맥 뿐만 아니라 클램프를 하지 있는지 확인 합니다. - 사용 하 여 모기 클램프 왼쪽된 문맥 합자를 개최 하 여 정 맥 cannulation 나중에 대 한 적절 한 긴장을 유지.
- 조심 스럽게 24 G 바늘-아리 스토 카 테 터 ( 그림 3A)와 그것을 puncturing 의해 왼쪽된 문맥의 앞 벽에 절 개를 확인 합니다.
참고: 우회를 만들려면 왼쪽된 문맥에 왼쪽된 간 정 맥 혈관 액세스 포인트 필요 합니다. 이 단계에 대 한가 위를 사용 하 여 더 큰 절 개를 만드는 것 보다는 바늘으로 혈관을 puncturing 의해 혈관 액세스를 만드는 데 좋습니다. 이 출혈 하 고 나중에 협 착 증의 위험을 줄여줍니다. - 카 테 터를 철회 하 고 바늘 무료 24-G 카 테 터를 카 테 터의 바늘.
- 관류 튜브 카 테 터 연결, 다른 끝점 40의 15 mL와 20 mL 주사기에 연결 하는 어떤의 U/mL heparinized 염 분 살포 펌프에.
- 튜브와 바늘-무료 안과 밖으로 공기를 추방 하기 위해 튜브를 perfusing에 대 한 펌프를 켭니다.
- 관류 펌프를 해제 합니다.
- 다시는 왼쪽된 포털 정 맥을 통해 정 맥 (그림 3B)에 구멍이 절 개에 바늘 없는 카 테 터를 삽입 합니다.
참고: 사실 때문에 카 테 터를 해결 하기 위한 매우 제한 된 공간, 그것은 시점에서 고정 되지 않습니다. 따라서, 외과 치료를 사용 해야 합니다을 cannulated 테의 변위를 피하기 위해. - 22 또는 24 G 바늘-아리 스토 카 테 터 (그림 3C)와 그것을 puncturing 의해 왼쪽된 측면 간 정 맥의 노출 영역의 여백에 다른 절 개를 신중 하 게 확인 합니다.
참고: 카 테 터 혈관 보다 약간 작은 것이 좋습니다. - 카 테 터를 철회 하 고 바늘 없는 22-G 카 테 터를 카 테 터의 바늘.
- 24 G cannulated 바늘 무료 테 0.5 mL/min의 유량에서 왼쪽된 문맥의 관류 펌프 heparinized 염 분 통해 왼쪽된 측면 엽에 perfuse를 설정.
- 마른 거 즈를 사용 하 여 왼쪽된 측면 간 정 맥의 절 개 주변 밖으로 흐르는 폐기물 액체를 흡수.
- Cannulate는 왼쪽된 측면 간 정 맥을 통해 22 G 바늘 없는 카 테 터, 복 부 내부 오염 (그림 3D)을 최소화 하기 위해 유체 출구 생성 하와 정 맥의 구멍이 절 개.
참고: 그것은 기술적으로 간 엽을 cannulated 카 테 터를 해결 하기 어렵다입니다. 따라서, 의사는 카 테 터의 변위를 피하기 위해 주의 기울여야 한다. 또는 카 테 터와 함께 왼쪽된 측면 간 정 맥 cannulation, 없이 폐기물 액체 또한 마른 거 즈로만 정 맥의 절 개 지역에 흡수 될 수 있다. - 계속 heparinized 염 분 약 20 분 (1 그룹)와 왼쪽된 측면 엽 perfusing 그리고 식 염 수 만으로 2h, 3h, 또는 4 h (그룹 2, 그룹 및 그룹 3, 4, 각각).
- 펌프는 관류 중지를 해제 합니다.
4. 생리 Reperfusion 왼쪽된 측면 엽의
- 두 카 왼쪽된 문맥 및 왼쪽된 측면 간 정 맥에서 떨어져가지고 가십시오.
- 11-0 폴 리아 미드 봉합으로 왼쪽된 포털 정 맥의 절 개를 닫습니다.
- 11-0 폴 리아 미드 봉합과 왼쪽된 측면 간 정 맥의 절 개를 닫습니다.
- 왼쪽된 측면 간 정 맥 unclamp
- Unclamp 왼쪽된 중간 문맥, 왼쪽된 담 즙 덕트, 그리고 왼쪽된 간 동맥.
- 정 맥을 왼쪽된 문맥에 합자를 잘라.
5입니다. 복 부 벽의 폐쇄
- 중단 4-0 흡수 polyglactin 910 봉합으로 봉합 하 여 복 부 벽의 근육 층을 닫습니다.
- 중단 4-0 polydioxanone 흡수 성 봉합 사로 봉합 하 여 복 벽의 피부 층을 닫습니다.
- 복 부를 닫은 후 70% 알코올로 피부 절 개를 치료.
6. 수술 후 치료는 쥐의
- 약 10 분 동안 호흡에 대 한 지구 온난화 패드에 동물을 놓고 새로운 케이지에 넣어.
- Buprenorphine 관리 하루에 연속 3 d postoperatively 고통을 릴리스를 위한 x 0.05 mg/kg 피하 2.
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결과
12 남자 (세 12-13 주) 루이스 쥐 선택적 간 엽 관류의 효과 평가 하는 데 사용 했다. 실험 4 개의 그룹에서 수행 되었다 (n = 3 쥐 그룹 당). 20 분의 다른 관류 기간을 사용 하 여, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 위에서 설명한 단계를 따라 우리가 성공적으로 달성 단일 엽 관류 vivo에서 .
Vivo에서 왼쪽된 측면 엽의 관류:
정확한 해 부 식별 왼쪽된 문맥 왼쪽된 측면 간 정 맥 및 성공적인 왼쪽된 문맥 및 왼쪽 측면 간 정 맥 cannulation heparinized 염 분으로 재 관류 후 확인할 수 있습니다. 성공적인...
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토론
차단 하 고 cannulating 유체 유입으로 카 테 터와 함께 왼쪽된 문맥 및 유체 출구로 다른 카 테 테 르와 왼쪽된 측면 간 정 맥, 우리 성공적으로 생성 한 vivo에서 유체 바이패스 왼쪽된 측면 엽 내 나타내는 기술은 cannulation에 대 한 혈관의 작은 크기와 출혈 발생의 위험이 높은 매우 도전 이다, 비록 그것이 가능 합니다. 4 시간 긴 관류 기간을 겪고도 쥐 쥐가 수술을 견딜 수 보여주는 적어도 1 주 살아 났다.
다음 섹션에서 우리는 3 기술적으로 가장 어렵고 중요 한 단계 및 성공적으로 그들을 마스터 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 분리 하 고 대상된 포털 정 맥 주변 간 실질과의 긴밀 한 공간 관계 때문 왼쪽된 포털 정 맥 결 찰 하는 과정에서 혈관의 절연 출혈 발생의 높은 위험이 있다. 마이크로 포 셉이 위 보다는 사용 하 여 신중 하 게 찢 어 떨어져 연결된 avascular 조직을 둘러싼 왼쪽된 문맥에 의해 왼쪽된 문맥을 분리 ...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자 해부학 연구소에서에서 옌스 Geiling에 게 감사 하 고 싶습니다 내가 쥐 간 해부학의 회로도 도면 생산 예 나 대학 병원.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 관류 펌프 | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| 카테터 | |||
| Versatus-W 카테터 | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74× 19mm |
| 베르사투스-W 카테터 | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9× 25mm |
| 마이크로 수술 기구 | |||
| 마이크로 가위 | F· S&미드닷; L | 번호 14058-09 | |
| 마이크로 serrefine | F· S&미드닷; L | No.18055-05 | |
| 마이크로 클램프 어플리케이터 | F· S&미드닷; L | 번호 18057-14 | |
| 스트레이트 마이크로 펜치 | F&미드도트; S&미드닷; L | 번호 00632-11 | |
| 곡선형 마이크로 펜치 | F· S&미드닷; L | 번호 00649-11 | |
| 마이크로 바늘 홀더 | F· S&미드닷; L | 번호 12061-01 | |
| 일반 수술 기구 | |||
| 표준 시저 | F· S&미드닷; L | ||
| 모기 클램프 | F· S&미드닷; L | ||
| 톱니 모양의 집게 | F· S&미드닷; L | ||
| 이빨이 있는 집게 | F· S&미드닷; L | ||
| 바늘 홀더 | F&미드닷; S&미드닷; L | ||
| 봉합사 | |||
| 4-0 프롤렌 | 에티콘 | ||
| 4-0 에티콘*II | 에티콘 | ||
| 6-0 실크 | 에티콘 | ||
| 11-0 폴리아미드 | 에티콘 |
참고문헌
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