실험실 토끼에 하드 진드기 감염의 다양 한 모델

요약

우리는 단단한 진드기 실험실 토끼에 먹이를 간단 하 고 다재 다능 한 시스템을 개발 했습니다. 우리의 힘 드는 비 프로토콜 쉽게 액세스할 수 재료를 사용 하며 다양 한 실험 설정의 요구 사항에 따라 조정 될 수 있다. 메서드를 사용 하면 편안 하 게 모니터링 및 수 유 기간 틱의 샘플링 수 있습니다.

초록

틱 연구에 있는 동물의 사용은 다양 한 하드 틱 식민지의 유지 보수를 포함 하 여 실험실에서 실험 목적에 대 한 중요 합니다. 틱에서 (계란)를 제외 하 고 모든 발달 단계는 hematophagous, 하 고 그들의 수명 주기의 성공적인 완료에 대 한 필수적입니다 때 그들의 척 추가 있는 호스트에 연결 된 혈액 식사를 취득 합니다. 여기 토끼에 단단한 진드기의 먹이를 쉽게 열 수 있는 캡슐을 사용 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 제안된 된 방법의 이점은 그것의 간명, 짧은 기간 및 특정 실험 요구 사항을 요구에 가장 중요 한 것은 다양 한 조정 포함 한다. 메서드를 사용 하면 가능 하 게 (다양 한 크기)의 여러 챔버를 사용 하 여 여러 단계 또는 다른 실험적인 그룹의 전반적인 동물 요구를 줄이면서 먹이 허용 같은 동물에. 비 자극 하 고 쉽게 액세스할 수 재료를 사용 수 수 쉽게 실험에서 발견 및 입양에 대 한 제공 또는 재사용 윤리적인 프로토콜 허용 하는 경우 동물에 불편을 최소화 합니다.

서론

단단한 진드기 (Ixodidae) 느린 먹이 절지동물으로 잘 알려져 있으며, 몇 일 동안 호스트에 연결할 수 있습니다 또는 주, 종에 따라 발달 단계¹. 이러한 의무 hematophagous 절지동물 다양 한 박테리아, 원생 동물, 바이러스 등 전염 성 요원의 벡터 이며, 따라서 인간과 동물 건강¹에 상당한 위험을 제시. 때 틱 생물학을 공부 하거나 평가 하는 새로운 제어 방법, 먹이 체계는 효과적인 틱의 설립은 효과적으로 실험을 디자인 하 고 연구의 목적은 달성 중요 합니다. 최근, 여러 인공 틱 먹이 시스템 (살아있는 동물의 사용을 피하고) 개발된^2,,34 이었고 그들은 가능한 사용 해야 합니다. 그러나, 이러한 시스템 틱 살아있는 동물에 먹이 완전히 대체할 수 없어 그리고 그들은 과학적 연구에 필요한 많은 생리 조건에 대 한 적절 한 대체 되지 않습니다. 따라서, 어떤 경우에 실험 동물 호스트의 사용은 실험 결과의 관련성을 보장 하기 위해 중요 합니다.

실험실 뉴질랜드 토끼 여러 ixodid 틱 종^5,6,7,,89에 대 한 가장 적합 한 하 고 액세스할 수 있는 호스트를 나타났습니다. 틱 토끼에 먹이의 두 가지 일반적인 전략이 자주 사용 되었습니다: a) 면 천이나 양말^6,7, 덮여 토끼 귀에 먹이 그리고 b) 먹이 면 가방⁹, 나일론 병¹⁰ 또는 내 오프 렌 실¹¹ 토끼의 뒤에 붙어. 토끼의 귀에 먹이 우아한 시스템 때문에 아니다 특히 초기 단계, 애벌레 (nymphs) 진드기 수 크롤 링 하 고 외가도, 동물에 대 한 불편 하 고 틱 먹이의 복구의 모니터링에 깊은 연결 부풀어 오른 틱 어려운입니다. 이 시스템은 또한 대표 하는 동물에 대 한 상당한 불편 엘리자베스 칼라, 보호 양말에 의해 완전히 포함 하는 귀에 두 틱 그룹에 제한. 다른 시스템^9,10,11 는 확실히 더 고급 하드 틱 식민지 유지 보수에 적합. 그러나, 그들은 먹이 챔버의 크기/모양 대 뿐만 아니라 토끼에 실험 그룹의 숫자에 제한 됩니다. 또한, 이러한 프로토콜은 종종 다리 긁 고 손질을 방지 하기 위해 엘리자베스 목걸이의 사용을 피하기 위해 후면 토끼 다리를 절 필요 합니다.

여기 우리는 엘리자베스 목걸이 필요 없다 또는 실험 기간 동안 다리를 절 재킷, 다시 적용 하는 토끼에 붙어 폐쇄 실에서 단단한 진드기의 여러 그룹을 먹이, 힘 드는 비 간단 하 고 매우 효과적인 방법을 제안 합니다. 특히, 우리의 시스템을 에틸렌-비닐 아세테이트 (EVA) 거품 시트 모기 망 하 고 빠른 응고 (3 분) 비 자극 하는 라텍스 접착제로 다시 면도 토끼에 붙어에서 만든 탄성 캡슐을 사용 합니다. 이 기술은 원하는 크기 또는 모양, 여러 캡슐의 첨부 파일을 허용 하 고 실험 후 몇 주 동안 토끼는 완. 시스템은 주로 nymphal 및 성인 하드 틱 단계에 적합 하지만 약간 수정 그것 애벌레도 먹이 대 한 사용할 수 있습니다. EVA 거품 기반 방법 하드 틱 먹이 척추 호스트, 예 양 (는이 종이에 대안 중 하나로 표시 됩니다)의 다른 유형에 적응 수 있습니다.

프로토콜

참고:이 연구에서 토끼 유지 되었다 음식 표준 장에 고 광고 libitum 음식, 환경 및 산업 보건 및 안전 (ANSES) 공인 동물 시설 Maisons-Alfort, 프랑스에서의 프랑스 기관에서 제공 하는 물. 동물 두 번 매일 어떤 비정상적인 피부 반응, 건강 문제 또는 합병증에 대 한 두 명의 경험이 풍부한 기술자에 의해 감시 되었다. 실험 방 진드기의 우발적인 탈출을 피하기 위해 더블 양면 테이프와 출입구의 내부 프레임으로 확보 했다. 방법이 최선 두 사람이 한 팀으로 작동 하지만 단일 한 경험 있는 사람에 의해 힘으로 완료할 수 있습니다. 대부분 토끼 유 순 하 고 침착 하지만, 긴장의 표시를 조작 하는 동안 발생할 수 있습니다. 그는 토끼가 손상 되지 자체 고군분투 하 여 되도록 수동 구속 눌러 부드럽게 한 손으로 목의 아저씨의 다른 한편에서 지 원하는 하는 동안 수행할 수 있습니다 뒷. 6 개월 된, Rambouillet 여성 양 유지 했다 생물 의학 연구 (CRBM) 시설에 대 한 센터에서 Alfort 국립 수의학 학교 (ENVA)에서 어디 물과 음식을 제공 된 ad libitum, 그리고 그것은 매일 두 번 확인 했다.

참고: 우리의 실험실 토끼와 양 틱 각각 동물 실험 맨이 Anses/ENVA/UPEC, 허가 번호 01741.01 및 11/10/16-5B, 윤리 위원회에 의해 먹이 대 한 사용할 수 있는 권한을 받았다. 우리가 우리의 실험에만 병원 체 무료 틱을 사용,이 연구에 사용 된 모든 토끼 화이트 래빗 협회, 파리, 프랑스를 통해 채용을 위해 제안 되었다.

1입니다. 캡슐의 준비

1. EVA 거품 시트 (그림 1A)에서 캡슐의 원하는 크기를 잘라. 외부 라운드 (그림 1B) 토끼 피부에 붙이는 때 실수로 분리를 최소화 하기 위해 캡슐의 모서리.
   참고: 캡슐의 프레임 두께 이어야 한다 약 8 m m. 5 m m 두꺼운 거품 시트를 사용 하 여 애벌레, 님프, 및 작은 틱 성인 종 Ixodes. 1 cm 두께 거품 시트는 Amblyomma sp., Hyalomma sp., 캡슐의 크기 변화 등 성인 틱 실험 요구 사항에 따라 큰 크기에 적합 합니다. 예를 들어 20 Ixodes 성인 커플, 200 님프, 또는 1000 애벌레, 우리가 사용 하 여 내부 캡슐 크기 5 x 5 cm², 6 x 7 cm² 또는 7 x 9 cm²각각.
2. 절단 폭 8 m m 자동 접착 걸이의 부착 테이프 ( 재료의 표참조) 하 고 준비에 바 폼 프레임 (그림 1C)에 그들을 스틱.
3. 커트 접착 루프에서 같은 크기 스트립 ( 재료의 표참조) 테이프와 고리 양쪽에 바인딩할 EVA 폼 프레임 (그림 1D)에 연결.
4. EVA 거품 프레임의 크기를 잘 모기 망 (메쉬 크기 보다 작은 50 µ m)의 적절 한 크기를 잘라내어 자동 접착 루프 (그림 1E , 1F)에 충실. 필요한 경우에 돌출부를 잘라.
   참고:이 유형의 캡슐 캡슐의 다른 씰링 시스템은 애벌레 먹이 (보충 그림 1)에 걸린 통해 애벌레의 우발적인 탈출을 방지 하기 위해 필요 하지만 님프와 성인 하드 진드기 종의 먹이 사용할 수 있습니다. 후크 및 루프 사이드입니다.

2. 진드기 감염 전에 토끼의 준비

1. 토끼 뒤와 측 클리퍼 (그림 2A)와 함께 사용할 수의 영역을 면도.
2. 준비 된 캡슐의 전체 표면에 비 자극 라텍스 접착제를 적용 하 고 1 분 (그림 2B)에 대 한 기다립니다.
3. (그림 2C 및 2D) 약 3 분 동안 손가락으로 (모서리)에 특히 피부에 눌러 캡슐을 붙입니다.
   참고: 둘 이상의 캡슐 gluing 때 (그림 2E 와 2F) 그들 사이 적어도 5 mm 공간을 유지 있는지 확인 합니다. 우리가 일반적으로 척추의 영역을 피하기 위해 하지만 필요한 경우에 사용할 수 있습니다.
4. 약간 피부에 그들의 부착을 시각적으로 확인 하는 캡슐을 들어올립니다. 하는 경우 연결 되지 않은 지역, 주걱을 사용 하 여 접착제를 적용 하 고 또 다른 3 분에 대 한 누릅니다.
5. 자 켓 손상 (그림 2G)을 방지 하기 위해 토끼의 뒷 발에 보호 테이프를 적용.
   참고:이 단계는 선택적 이며 주로 자 켓 손상, 하지 손상 틱 캡슐을 방지 하기 위해.
6. 입구를 통해 앞 다리를 놓고 있는지 토끼 남아 편안 하 게 호흡 하는 목 강화 토끼 자 켓을 입었다. 이 단계에서 탄성 인클로저를 통해 뒷 다리를 배치 하지 고 지퍼 오픈 (그림 2H)를 두고.

3. 진드기 감염

1. 바늘-엔드 자르고 면 (그림 1G)으로 연결 된 플라스틱 주사기 (1 또는 5 mL에 따라 개인의 수)으로 진드기를 놓습니다. 적은 양의 진드기 감염 될 경우, 집게를 사용 합니다.
   참고: 눈금 식민지 유지 보수 허용 부풀어 오른된 틱 female(s) 후속 해칭 당시 애벌레의 힘 드는 조작 하지 않도록 하는 고무 밴드¹² 에 의해 싸여 모기 망으로 덮여 주사기 (5 또는 10 mL) 안에 그들이와 산란은 (그림 1H) 호스트에 적용 됩니다. 또한, 완전히 부풀어 오른된 애벌레 주사기에 갈 다를 수 있습니다 (추가 그림 1I; 5 또는 10 mL)로 nymphs 토끼의 직접적인 감염에 대 한.
2. 주사기를 놓고 오픈 통해 캡슐에 깊은 코너와 주사기 플런저를 추진 하 여 진드기를 예방. 천천히 트위스트 토끼 피부 쪽으로 플런저는 플런저에 연결 된 나머지 진드기를 제거 하 고 동시에 (그림 2나) 캡슐에서 꺼내.
   참고: 몇몇은의 개인 캡슐, 크롤 링 하는 경우 반환 그들 집게를 사용 하 여.
3. 후크 및 루프 테이프를 refastening 캡슐을 닫습니다.
4. 재킷의 zip 탄성 인클로저 폐쇄 후면에는 토끼의 뒷 다리를 놓습니다.
   참고: 안락을 보장 하 고 또한 재킷에 씹는 피하기 위하여 집게 손가락 재킷의 목과 토끼 사이 들어갈 수 있는 확인 합니다.
5. 토끼 케이지 (그림 2J)을 반환 합니다.
   참고: 감염에서 시간 충만 틱 컬렉션을 다른 틱 종 및 발달 단계 마다 다. 예를 들어 Ixodes scapularis 및 Ixodes ricinus, 님프, 어른과 애벌레 먹이의 기간은 6-9, 3-4 및 2-3 일, 각각. 실험실 조건에서 29 다른 하드 틱 라이프 사이클에 대 한 참조 목록 (2016)⁹레빈과 Shumacher에서 찾을 수 있습니다.

4. 수집 및 진드기의 모니터링

1. 토끼 케이지에서 벤치에 고 재킷의 압축을 풉니다.
2. 부드럽게 손으로 토끼를 제 지. (그림 2 K 및 2 L) 후크 및 루프 테이프 잠금과 여 캡슐을 열고 부풀어 오른된 애벌레 (보충 그림 1) 또는 플라스틱 접시로 nymphs 이나 성인 (그림 2L 집게를 사용 하 여 진드기를 수집 ). 진드기는 필요한 경우 부분적으로 (하지 충만) 먹이, 틱 트위스터 또는 집게를 사용 하 여 그들을 분리.
   참고: 단계 3.1에서에서 참고 하시기 바랍니다 틱 식민지를 유지 하는 경우. 특정 틱 종에 따라 부풀어 오른된 틱 적절 한 습기 조건과 온도 유지 합니다.
3. 필요한 경우, 캡슐을 후크 및 루프 테이프 refasten.

5입니다. 토끼의 복구

1. 캡슐에서 모기 망을 완전히 제거 하 고 토끼 (그림 2M)에 자 켓을 두고.
2. 3-4 주 기다려 하 고 부드럽게 정돈 모서리 (그림 2N) 중 하나에 의해 캡슐을 제거 하려고 합니다. 만약 캡슐 아직도 단단히 부착 하 고, 1 주일 후이 단계를 반복 합니다.
3. 자 켓과 토끼 감 금 소에 복구 하자를 제거 합니다.
   참고: 캡슐이 해제 되 면 비정상적인 반응에 대 한 토끼의 피부를 확인 하십시오. 일반적으로 치료 필요 하지만, 자극의 경우 부드럽게 로션을 사용할 수 있습니다.
4. 프로토콜 및 실험 허용, 복구 된 토끼 (그림 2O)를 재사용 하 또는 입양에 대 한 제공 수 있습니다.
   참고: 토끼 표시 되었습니다 반복된 틱 침입¹³;에 한번 노출 진드기 저항을 취득 따라서, reinfestations는 실험에 필요 하지 않으면를 권장 하지 않습니다.

결과

여기 우리가 처음으로 하드 체크 EVA 폼에 먹이의 상세한 단계-의해 단계 방법 제안 면도 토끼의 뒤에 적용 하는 캡슐 자 켓 (그림 1 및 그림 2)에 의해 보호. 이 프로토콜은 다양 한 종류의 실험에 적합 때 동일한 호스트에 다른 틱 그룹이 필요 하 고 단단한 진드기의 대량 양육을 위해 또한 사용 될 수 있습니다. 먹이 주로 실험실에서 성공 틱 틱 개인의 체력과 기술 자체 보다는 특정 틱 종 토끼 호스트의 적합성에 의존 합니다. EVA 폼을 사용 하 여 우리의 시스템 캡슐 다시 토끼에 붙어 양 (같은 실험실 호스트의 다른 유형에 대 한 적응 시킬 다양 한 하드 틱의 다른 발달 단계 종 (표 1) 및 5 월 또한 먹이 때 매우 성공적인 수 입증 된 그림 3

토론

이 전체 프로토콜의 가장 중요 한 단계 면도 피부에 단단히 캡슐 접착제입니다. 이러한 이유로, 적어도 3 분 동안 일정 한 압력은 모서리에 특히 중요 합니다. 그것은 그들을 적용 하는 것이 중요 때 캡슐에 틱 접종, 동안을 피하기 위해 틱 탈출 씰링 오픈에서 반대 구석으로 깊은. 실험을 계획할 때 모든 캡슐 씹는 또는 긁 적 손상을 방지 하려면 재킷에 의해 보호 됩니다 있는지 확인 합니다. 재킷의 목 지역 토끼 편안 하 게 유지 하지만 충분히 느슨한 씹는 방지 하기 위해 꽉 충분히 있는지 확인 합니다.

설명된 방법의 주요 장점 중 하나는 그것의 단순과 크기 면에서 그 수정 이며 캡슐의 번호를 사용할 수 있습니다. 우리의 실험 동안 피부에서 캡슐의 초연 하지 관찰 되었다. 그러나, 가끔 손상 재킷 (안 캡슐)의 토끼에 의해 발생할 수 있습니다.

토끼에서, 캡슐에 완벽 하 게 부풀어 오른 분리 틱 (주로 미 숙 단계 애벌레와 님프 등...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
뉴질랜드 토끼 (2.5-3.5 kg)	찰스 리버	스트레인 코드 571
Rambouillet 양	현지 공급자-진드기 없는 농장	여성 6개월 된
EVA 폼 5mm 두께	코스프레 샵	EVA-PE451kg (950mm x 450mm)	10 mm PE45 kg 폼은 코스프레 샵에서 대형 성인 진드기 종에 사용할 수 있습니다.
폼 시트 9" X 12" 6 mm-화이트	아마존	FOAMSHT6-20	6 mm-EVA 폼 ca는 코스프레 샵의 폼 대신 아마존을 통해 주문할 수 있습니다
전체 길이 토끼 재킷	하버드 장치, Inc.	620077- 중형, 6270078 - 대형
비독성 라텍스 접착제	눈물 수선공	패브릭 & 가죽 접착제
튜블러 코튼 정형외과 스타키넷	BSN Medical	9076 (12-15 cm 넓이)
모기메시	Loisirs Creatifs	매우 미세한 필터 나일론 메쉬 패브릭	메시 크기가 50 미만인 모기 메시 또는 커튼 재질; m이 적합합니다.
백혈질	BSN 의학 S.A.S	LF 72361-02
접착 훅 앤 루프 테이프	AIEX 스토어	AIEX 39.37 피트 / 12m 후크 및 루프 자체 접착 테이프 롤, 20mm 너비, 흰색	Fullfiled 아마존
빠른 건조 접착제	픽스투트	초강력 접착제

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