이 프로토콜 마우스 splenocytes를 사용 하 여 분자 시계 유전자 발현을 변경 하는 병원 체 관련 된 분자 패턴을 검색 하는 기술을 설명 합니다.
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방법 논문
병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 Splenocytes 사용 하 여
이 논문에서
요약
초록
유전자 발현을 행동, circadian 리듬 생리학의 거의 모든 측면을 통제 한다. 여기, 우리 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826, 및 열 죽 Listeria monocytogenes 와 마우스 splenocytes 도전 circadian는 분자에 그들의 효과 검사 하는 방법론을 제시 시계입니다. 이전, 연구는 다양 한 모델 (예: 마우스, 쥐, 및 인간)의 구색에서 vivo에서 및 비보 전 접근을 사용 하 여 분자 시계에 LPS의 영향 검토에 집중 했다. 이 프로토콜에는 분리와 시계 유전자 식 후 도전 정량 PCR 통해 평가 하는 방법론으로 splenocytes, 도전 설명 합니다. 이 방법은 시계의 식 변경할 수 있는 다른 분자 뿐만 아니라 분자 시계에 미생물 구성 요소 뿐만 아니라 영향을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 이렇게 애타게 떨어져 어떻게 PAMP 통행세 같이 수용 체 상호 작용에 영향을 미치는 시계 식의 분자 메커니즘을 활용 될 수 있습니다.
서론
생리학 및 행동의 거의 모든 측면에 대 한 24 시간 진동 총괄, 포유류, 마스터 클록은 시상 하 부1,2의 suprachiasmatic 핵 (SCN) 내에 있습니다. Organismal 수준에 생물학 과정을 통제, 이외 마스터 클록도 시체3,,45를 통해 주변 세포 시계를 동기화 합니다. 핵심 이루어져 있다 기간 (Per1-3), 신장의 (Cry1-2), Bmal1을 최소한 3 개의 맞물리는 transcriptional 변환 피드백 루프 분자 시계 기계 장치에 의하여 이루어져 있다, 하는 동안 그리고 시계 유전자6,7. 핵심 분자 시계의 정확한 타이밍을 유지, 게다가 일부 보조 시계 유전자 제품 (예, 레 브 erbα 및 Dbp) 또한 비 시계 유전자의 표현을 규제, ....
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프로토콜
연구 기간 동안 동물 보호 및 치료 건강의 국가 학회 정책 준수, 기관 지침에 따라 되었고 하트포드의 대학 동물 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1입니다. 동물의 유입
참고: 20 주 된 남성 B6129SF2/J 쥐 연구에 사용 됩니다.
- 쥐 라이트 12 h (표준 오버 헤드 화이트 빛)를 끌고가 다/어두운 12 h 주기 2 주 전에 실험에 대 한.
참고: 여기 zeitgeber 시간 (ZT) 0 해당 하에 조명과 ZT12 조명, 다른 모든 환경 요인 (즉, 음식, 물, 그리고 실내 온도)를 유지 하면서 지속적인 21.
2. 악기, 문화 매체, 및 도전 매체 준비
- 압력솥 집게와가 위 해입니다. 알루미늄 호 일 및 고압에 두르고 현미경 슬라이드의 쌍을 바꿈.
- 10%의 최종 농도에 소 태아 혈 청 (FBS)를 추가 하 여 RPMI 1640 배양을 준비 합니다. 다음 PAMPs 문화 매체에 추가 하 여 10 mL 50 mL 튜브에 도전 매체의 준비 (RPMI 10 %FBS); LPS (5 µ g/mL), O....
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결과
마우스 ZT13에 희생 했다, splenocytes 고립 된 비보 전 PAMPs LPS, ODN1826, 또는 HKLM 도전. 3 h 후 RNA 격리, 고 정량 시계, Per2, Dbp, 및 레 브 erbα 당된 컨트롤 셀에 비해 분자 시계 유전자의 상대 식 수준을 평가 하는 데 사용 되었다. PAMP 도전 후 시계 식 레벨 제어 셀 (그림 1A) 식 보다 크게 다른 되지 않았습니다. Per2 식 레벨 LPS와 ODN1826 당된 컨트롤 (그림 1B)에 비해 도전 셀에 크게 상승 했다. LPS는 mRNA 수준 당된 컨트롤 (그림 1
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토론
이 프로토콜 내에서 계량 하 여 유전자 발현을 결정 하는데 사용 되는 RNA의 순도 평가 microvolume 분 광 광도 계를 사용할 수 있습니다. 260에 자외선을 흡수 하는 핵 산 nm, 일반적으로 280에 빛을 흡수 하는 단백질 nm, 다른 잠재적인 오염 물질 RNA 추출 절차 (예, 페 놀) 동안 사용 되는 230에서 감지 하는 동안 nm. 따라서, () 비율 260/280에서 흡 광도 평가 하 여 nm (단백질 RNA) 및 260/230 nm (비 단백질 오염 물질에 RNA) RNA의 품질 평가 될 수 있다. 높은 품질 RNA는 단백질 오염을 나타내는 1.8-2.1, 더 낮은 비율으로 간 A260/280 비율. 순수한 RNA 샘플 2.0의 A260/230 비율이 있을 것 이다.
(즉, Per2, 시계, 레 브-erbα, 및 Dbp), 대상 유전자의 상대적 식을 결정할 때 생 제어 유전자 (유전자는 식에서 수준 차이가 없습.......
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공개 사항
저자는 공개 상관이 있다.
감사의 글
이 작품에 의해 지원 되었다 하트포드의 대학에서 대학 예술과 과학의 학장의 사무실에서 교수 연구 보조금.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 서리 슬라이드 | Fisher | 12-550-343 | |
| 세포 여과기 | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 또는 74106 | |
| RNase-Free DNase 세트 | Qiagen | 79254 | |
| 6웰 세포 배양 플레이트 | Denville | T1006 | |
| 50 mL 튜브 | Corning | 352070 | |
| 15 mL 튜브 | Corning | 352097 | |
| 고용량 cDNA 역전사 키트 | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan 유전자 발현 분석 b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan 유전자 발현 어세이 Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan 유전자 발현 어세이 Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan 유전자 발현 어세이 Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan 유전자 발현 어세이 Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR 기계 StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96웰 반응 플레이트(0.1mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| 통계 분석 소프트웨어 | Prism 7.0a |
참고문헌
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U.
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재인쇄 및 허가
