방법 논문

병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 Splenocytes 사용 하 여

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DOI:

10.3791/58022

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2018년 7월 24일

1Department of Biology, University of Hartford

이 논문에서

요약

이 프로토콜 마우스 splenocytes를 사용 하 여 분자 시계 유전자 발현을 변경 하는 병원 체 관련 된 분자 패턴을 검색 하는 기술을 설명 합니다.

초록

유전자 발현을 행동, circadian 리듬 생리학의 거의 모든 측면을 통제 한다. 여기, 우리 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826, 및 열 죽 Listeria monocytogenes 와 마우스 splenocytes 도전 circadian는 분자에 그들의 효과 검사 하는 방법론을 제시 시계입니다. 이전, 연구는 다양 한 모델 (예: 마우스, 쥐, 및 인간)의 구색에서 vivo에서 및 비보 전 접근을 사용 하 여 분자 시계에 LPS의 영향 검토에 집중 했다. 이 프로토콜에는 분리와 시계 유전자 식 후 도전 정량 PCR 통해 평가 하는 방법론으로 splenocytes, 도전 설명 합니다. 이 방법은 시계의 식 변경할 수 있는 다른 분자 뿐만 아니라 분자 시계에 미생물 구성 요소 뿐만 아니라 영향을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 이렇게 애타게 떨어져 어떻게 PAMP 통행세 같이 수용 체 상호 작용에 영향을 미치는 시계 식의 분자 메커니즘을 활용 될 수 있습니다.

서론

생리학 및 행동의 거의 모든 측면에 대 한 24 시간 진동 총괄, 포유류, 마스터 클록은 시상 하 부1,2의 suprachiasmatic 핵 (SCN) 내에 있습니다. Organismal 수준에 생물학 과정을 통제, 이외 마스터 클록도 시체3,,45를 통해 주변 세포 시계를 동기화 합니다. 핵심 이루어져 있다 기간 (Per1-3), 신장의 (Cry1-2), Bmal1을 최소한 3 개의 맞물리는 transcriptional 변환 피드백 루프 분자 시계 기계 장치에 의하여 이루어져 있다, 하는 동안 그리고 시계 유전자6,7. 핵심 분자 시계의 정확한 타이밍을 유지, 게다가 일부 보조 시계 유전자 제품 (예, 레 브 erbα 및 Dbp) 또한 비 시계 유전자의 표현을 규제, 즉, 시계 제어 유전자 (CCGs)6 , 7.

기능성 분자 시계 다양 한 면역 조직 (예를 들어, 비장 및 림프절)8 셀 (예를 들어, B 세포, 수지상 세포, 대 식 세포)8,9에서 설명 했습니다. 이 세포를 감지 하 고 응답 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs), 수용 체 통행세 같이 (TLRs)10등 타고 난 면역 인식 수용 체를 통해 보존된 미생물 구성 요소. 날짜 하려면, 13 기능 TLRs는 설명, 세균성 세포 벽 구성 요소, flagellar 단백질, 핵 산 미생물10등 미생물 성분 인식 하는. PAMP, lipopolysaccharide (LPS), TLR4에 의해 인식 하는 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소 organismal와 분자 수준에서 circadian 리듬 변경 표시 되었습니다. 예를 들어 vivo에서 LPS의 빛 같은 위상 지연 마우스11 활동에 의해 측정 된 유도 도전과 SCN에 간 현장에서 교 잡 그리고 양이 많은 PCR에 의해 결정으로 감소 된 시계 유전자 발현에 쥐12에서 각각. vivo에서 도전 LPS와, 후 인간의 말 초 혈액 백혈구13 및 피하 지방 조직14 의 분석 통해 정량 측정으로 여러 시계 유전자의 바꾸 인된 표현을 밝혔다. 마지막으로, 인간의 세포와도 마우스 복 막 대 식 세포의 LPS 도전 비보 전 시계 식 정량14측정으로 변경.

여기, 우리 PAMPs LPS, ODN1826 (를 포함 하는 합성 oligonucleotides CpG 모티브 unmethylated)의 영향을 평가 하기 위해 프로토콜 설명 및 열 죽 Listeria monocytogenes (HKLM)에 의해 인식 TLR4, TLR9, 그리고 TLR2, 각각,에 분자 시계 유전자 식 마우스 splenocytes에. 프로토콜에는 마우스 splenectomy splenocyte 격리 및 도전, RNA 추출, cDNA 합성, 정량 여러 시계 유전자의 표정을 평가 하 포함 되어 있습니다. 이 프로토콜 면역 세포와 아주 작은 동물의 많은 수의 적시 취득 또는 세포 조작, 다음 수 있는 비보 전 다양 한 PAMPs와 도전. 분자 시계 변조 면역 응답8,,1516의 다양 한 측면을 보여줘 왔다, 그러므로, 분자 시계의 대부분의 적절 한 시간에 따른 변형 자유로울 것는 면역 응답입니다. 또한, 이후 circadian 리듬의 붕괴는 심각한 병 리17,18,,1920으로 이어질 수 있습니다., 그것은 연구자 도전 splenocytes의 넓은 범위에 대 한 관심의 있을 수 있습니다. 분자 시계에 그들의 영향을 평가 하 고.

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프로토콜

연구 기간 동안 동물 보호 및 치료 건강의 국가 학회 정책 준수, 기관 지침에 따라 되었고 하트포드의 대학 동물 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.

1입니다. 동물의 유입

참고: 20 주 된 남성 B6129SF2/J 쥐 연구에 사용 됩니다.

  1. 쥐 라이트 12 h (표준 오버 헤드 화이트 빛)를 끌고가 다/어두운 12 h 주기 2 주 전에 실험에 대 한.
    참고: 여기 zeitgeber 시간 (ZT) 0 해당 하에 조명과 ZT12 조명, 다른 모든 환경 요인 (즉, 음식, 물, 그리고 실내 온도)를 유지 하면서 지속적인 21.

2. 악기, 문화 매체, 및 도전 매체 준비

  1. 압력솥 집게와가 위 해입니다. 알루미늄 호 일 및 고압에 두르고 현미경 슬라이드의 쌍을 바꿈.
  2. 10%의 최종 농도에 소 태아 혈 청 (FBS)를 추가 하 여 RPMI 1640 배양을 준비 합니다. 다음 PAMPs 문화 매체에 추가 하 여 10 mL 50 mL 튜브에 도전 매체의 준비 (RPMI 10 %FBS); LPS (5 µ g/mL), ODN1826 (5 µ g/mL), Listeria monocytogenes 열 사망 (108 HKLM/mL), 또는 다른 PAMP 제안된 농도에.
  3. 문화 매체와 도전 매체 물 욕조에 37 ° C에 따뜻하고 실 온에서 약 70 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.2) 계속.
  4. 얼음에 10 mL 피 펫 및 50 mL 튜브를 피펫으로 원조를 사용 하 여 문화 매체의 10 mL를 추가 합니다.
  5. 미생물 오염을 방지 하기 위해 비 커에가 위와 집게를 해 부의 100 mL 비 커와 장소 끝에 70% 에탄올의 약 30 mL를 추가 합니다.
  6. 50 mL 튜브에 버퍼 실내의 모든 1 ml (후드 연기) 10 µ L β-Mercaptoethanol을 추가 하 여 RNA 격리에 대 한 세포의 용 해 버퍼 준비. 필요한 (600 µ L 당 약 1 x 106 셀로 구성 된 샘플) 될 금액만 확인 합니다.
    참고: 버퍼 실내의 RNA 추출 키트 실리 카 막에 RNA의 바인딩을 지 원하는 구성 요소입니다.

3. Splenocyte 절연 및 도전

  1. 그들의 원래 감 금 소에 그들을 유지 하 고 계속 호흡 중지 후 1 분 CO2 를 공급 3 L/분의 유량에 케이지를 CO2 를 추가 하 여 마 취 법을 통해 특정 zeitgeber 시간에 마우스를 안락사.
  2. 두개골의 기지에서 목의 양쪽에 엄지와 검지 손가락을 배치 하 여 자 궁 경부 전위를 통해 죽음을 확인 합니다. 또는 눌러 두개골의 기지에서 막대 (를 사용 하 여 다른 손) 신속 하 게 당기면 꼬리 또는 두개골22에서 자 궁 경부 척추의 분리를 일으킬 뒷 다리 사지의 기지.
  3. 70% 에탄올과 종이 타월로 닦아 마우스 트렁크를 스프레이. 다시 하 고 그것의 오른쪽으로 약간 기울어진에 마우스를 놓습니다. 버려야 모피, 해 부를 사용 하 여가 위, 마우스의 왼쪽된 측면을 따라에 대 한 중간 앞, 뒤 다리 사이.
  4. 집게를 사용 하 여, 복을 신중 하 게 만들 비장의 손상 수 없습니다 절 개. 집게로 비장을 제거 하 고 얼음에 문화 미디어의 약 10 mL를 포함 하는 살 균 50ml 튜브에 배치. 나머지 동물에 대 한 반복 합니다.
    참고: 비장은 신장 콩의 색상 이며 길고 신장 보다 아첨.
  5. 문화 매체의 2 mL와 함께 한 비장 작은 멸 균 페 트리 접시에 전송.
    1. 두 메 마른 서 리 낀된 슬라이드의 젖 빛된 부분 사이 그것을 연마 하 여 비장을 균질. 만약에 가능 하다 면, 계속 문제 및 셀 매체에 균질 화 과정.
    2. 일단 철저 하 게, 40 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 튜브에는 splenocytes를 포함 하는 문화 매체의 2 개 mL를 피펫으로 무 균.
    3. 나머지 spleens 문화 매체와 셀 멤브레인 두르고 슬라이드의 새로운 쌍, 50 mL 튜브를 사용 하 여 위의 단계를 반복 합니다.
  6. 각각 10 mL/튜브의 전체 볼륨에 대 한 splenocytes를 포함 하는 50 mL 튜브의 감기 문화 매체의 8 mL를 추가 합니다. 당 밀리는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수를 결정 합니다.
  7. 6 잘 배양 배지를 약 1 x 106 셀/잘을 추가 합니다. 셀 추가 실험을 위해 사용 되 고 다른 PAMPs의 번호에 해당 하는 컨트롤을 포함 하는 우물의 수를 잘 합니다. 각 우물에 문화 매체의 또는 도전 매체의 3 mL 3 mL를 추가 합니다.
  8. 5% CO2 3 시간에서 37 ° C에서 번호판을 품 어.
  9. 잘 사용 하 여 1000 µ L 피펫으로 팁 P1000 micropipette에 연결 된 아래에서 세포를 다쳤어요. 15 mL 튜브에 동일한 1000 µ L 피펫으로 팁을 사용 하 여 셀을 포함 하는 매체를 전송 합니다.
  10. 실 온에서 5 분 동안 167 x g 에서 원심 분리를 통해 셀 작은 상쾌한을 제거 하 고 PBS의 5 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척.
  11. 작은 셀 5 분 동안 167 x g 에서 두 번째 시간, 상쾌한, 제거 하 고 셀 펠 릿을 위하여 세포를 lyse 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L를 추가. 그런 다음 RNA 격리를 진행 합니다.

4. RNA 분리 및 cDNA 합성

  1. 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 키트를 사용 하 여 splenocytes에서 RNA를 분리 하 고 '옵션'에 열 DNA 소화를 수행.
  2. CDNA 합성 전에 cDNA 합성 키트의 농도 범위 내에서 최적의 RNA (최대 2 µ g) 인지 확인 하는 microvolume 분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 농도 결정 합니다.
  3. 각 제조업체의 지침에 따라 역방향 전송 키트를 사용 하 여 샘플의 종합 cDNA. RNA의 10 µ L를 사용 하 여 각 20 µ L 총 반응 볼륨에서 샘플에 대 한. 반전 녹음 방송 (thermocycler 실행) 완료에 추가 20 μ H2O 각 반응에.
  4. P10 또는 P20 micropipette 준비는 cDNA를 0.5 mL 튜브에는 몇 가지 컨트롤 샘플 (예를 들어, 5에서 10 µ L의 총 2 샘플 µ L)에서 mRNA를 풀을 사용 하 여 표준 커브를 생성 합니다.
    1. 10 µ L 2 x 역전사 마스터 믹스를 추가 합니다.
    2. 반전 녹음 방송의 완료에 표준 곡선에 대 한 희석 시리즈에 사용 시작 농도 ("1") 될 것입니다 반응 관에 H2O 10 µ L을 추가 합니다.
    3. P100 또는 P200 micropipette를 사용 하 여 지정 하는 10-1, 10-2, 10-3, 그리고 10-44 개의 0.5 mL 튜브에 물 45 µ L을 추가 하 여 10 희석 시리즈 (1 ~ 10-4)를 수행 합니다.
      1. P20 micropipettor, 아래로 pipetting으로 믹스를 사용 하 여 첫 번째 튜브 (10-1)에 "1" 시작 농도의 5 µ L를 추가, 여러 번 다음 튜브에 10-1 튜브에서 전송 5 µ L 지정 10-2 와 혼합.
      2. 5 µ L 10-3 을 지정 하는 튜브에 10-2 관에서 P20 micropipette를 사용 하 여 전송 및 혼합. 5 µ L 10-4 지정 관에 10-3 관에서 P20 micropipettor를 사용 하 여 전송 및 혼합.

5. 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)

  1. 정량에 의해 mRNA 수준의 상대 정량을 확인 합니다. 내 실험에서 "정량-상대 표준 곡선" 및 "TaqMan" 화학을 선택. 변경 10 µ L. 반응 볼륨 플레이트 레이아웃 (예:대상 유전자, 표준 곡선, 기자, 등)에 관련 된 정보를 입력 합니다.
  2. 0.5 µ L의 뇌관/조사 분석 결과, 유전자 표현 마스터 믹스의 5 µ L, H2O 2 µ L 및 2.5 포함 되도록 반응 준비 µ L의 cDNA (10-100 ng).
    1. 반응, 표준 곡선에서 그들을 포함 하도록 확인 하 고 중복 계정을 2 추가 반응에서 각 반응이 수행 부정적인 컨트롤의 숫자에 의해 (cDNA)를 제외 하 고 위의 시 약의 각각 곱하여 마스터 믹스를 준비 대 한 pipetting 변화.
    2. 피펫으로 7.5 µ L는 micropipette 또는 멀티 채널 피 펫 96-잘 반응 판에 미리 결정 된 우물에 준비 된 마스터 믹스의. 피펫으로 미지수 및 표준에 대 한 적절 한 우물에 cDNA의 2.5 µ L 및 2.5 µ L H2O 부정적인 제어 우물에의.
    3. 다양 한 분자 시계 유전자에 대 한 입문서/조사 분석을 포함 하 고 또한 내 생 컨트롤 (예를 들어, β-말라)에 대 한 분석 결과 포함 합니다.
  3. 상대 식 값을 결정 하기 위해 각 복제에 대 한 상대적인 평균 수량을 계산 후, 각 샘플에 대 한 β-걸에 대 한 평균 상대 수량으로 대상 유전자에 대 한 평균 상대 수량 분할.

6. 통계 분석

  1. 통계 분석 소프트웨어를 사용 하 여 열 통계 옵션 아래 프로그램으로 데이터를 입력 합니다. 일방통행 ANOVA Dunnett의 포스트 hoc 테스트 컨트롤 대 PAMP 도전 후 시계 유전자 발현의 의미 값 간의 차이 평가 하기 위해 선택 합니다.

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결과

마우스 ZT13에 희생 했다, splenocytes 고립 된 비보 전 PAMPs LPS, ODN1826, 또는 HKLM 도전. 3 h 후 RNA 격리, 고 정량 시계, Per2, Dbp, 및 레 브 erbα 당된 컨트롤 셀에 비해 분자 시계 유전자의 상대 식 수준을 평가 하는 데 사용 되었다. PAMP 도전 후 시계 식 레벨 제어 셀 (그림 1A) 식 보다 크게 다른 되지 않았습니다. Per2 식 레벨 LPS와 ODN1826 당된 컨트롤 (그림 1B)에 비해 도전 셀에 크게 상승 했다. LPS는 mRNA 수준 당된 컨트롤 (그림 1

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토론

이 프로토콜 내에서 계량 하 여 유전자 발현을 결정 하는데 사용 되는 RNA의 순도 평가 microvolume 분 광 광도 계를 사용할 수 있습니다. 260에 자외선을 흡수 하는 핵 산 nm, 일반적으로 280에 빛을 흡수 하는 단백질 nm, 다른 잠재적인 오염 물질 RNA 추출 절차 (예, 페 놀) 동안 사용 되는 230에서 감지 하는 동안 nm. 따라서, () 비율 260/280에서 흡 광도 평가 하 여 nm (단백질 RNA) 및 260/230 nm (비 단백질 오염 물질에 RNA) RNA의 품질 평가 될 수 있다. 높은 품질 RNA는 단백질 오염을 나타내는 1.8-2.1, 더 낮은 비율으로 간 A260/280 비율. 순수한 RNA 샘플 2.0의 A260/230 비율이 있을 것 이다.

(즉, Per2, 시계, 레 브-erbα, 및 Dbp), 대상 유전자의 상대적 식을 결정할 때 생 제어 유전자 (유전자는 식에서 수준 차이가 없습...

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공개 사항

저자는 공개 상관이 있다.

감사의 글

이 작품에 의해 지원 되었다 하트포드의 대학에서 대학 예술과 과학의 학장의 사무실에서 교수 연구 보조금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
서리 슬라이드Fisher12-550-343
세포 여과기Fisher22363547
Lipopolysaccharide InvivoGenltrl-eklps
ODN1826InvivoGenTlrl-1826-1
HKLMInvivoGenTlrl-hklm
RPMI 1640Gibco11875-093
PBSGibco20012-043
RNeasy Mini KitQiagen74104 또는 74106
RNase-Free DNase 세트Qiagen79254
6웰 세포 배양 플레이트DenvilleT1006
50 mL 튜브Corning352070
15 mL 튜브Corning352097
고용량 cDNA 역전사 키트ThermoFisher4368814
TaqMan 유전자 발현 분석 b-actinThermoFisherMm00607939_s1
TaqMan 유전자 발현 어세이 Per2ThermoFisherMm00478113_m1
TaqMan 유전자 발현 어세이 Rev-erbaThermoFisherMm00520708_m1
TaqMan 유전자 발현 어세이 Bmal1ThermoFisherMm00500226_m1
TaqMan 유전자 발현 어세이 DbpThermoFisherMm00497539_m1
qPCR 기계 StepOnePlusThermoFisher
TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스ThermoFisher4369016
MicroAmp Fast 96웰 반응 플레이트(0.1mL)ThermoFisher4346907
통계 분석 소프트웨어Prism 7.0a

참고문헌

  1. Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
  2. Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
  3. Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
  4. Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
  5. Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  6. Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
  7. Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
  8. Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
  9. Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
  10. Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
  11. Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
  12. Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
  13. Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
  14. Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
  15. Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
  16. Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
  17. Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
  18. Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
  19. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
  20. Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
  21. Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
  22. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
  23. Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
  24. Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579(2018).
  25. Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).

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