단백질 집계 및 autophagic 플럭스의 초파리 모델의 중앙 신 경계에서의 형광 이미징-기반 세포 생물학 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. neurodegeneration입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학
이 논문에서
요약
초록
신경 퇴행 성 질환의 증가 보급, 신경 장애 및 손실 기본 이상 이해 하는 것 점점 더 중요 하다. 형광-기반 이미징 도구 및 기술 사용 subcellular neurobiological 프로세스의 전례 없는 분석 아직 여전히 이미징 연구에서 정량 데이터를 추출, 재현성, 공평 하 고 액세스할 수 있는 방법에 대 한 필요 . 우리 neurodegeneration의 초파리 모델을 사용 하 여 형광 기반 이미징 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. 특히, 피지/ImageJ를 사용 하 여 두 개의 세포 프로세스를 분석 하는 따라 하기 쉬운, 반자동 접근 설명: 첫째, 우리가 계량 단백질 집계 내용과 초파리 광 엽 돌연변이 형광 태그를 사용 하 여 프로 파일 huntingtin 단백질; 및 두 번째, 우리 autophagy의 탠덤 형광 기자의 부 량 비율 기반으로 초파리 비주얼 시스템에서 autophagy 리소좀 플럭스 평가. 중요 한 것은, 여기에 설명 된 프로토콜 선택 편견을 최소화 하 고 미묘한 비교의 해상도 높이기 위해 모든 형광 구조 분석 되도록 반자동된 세분화 단계를 포함 합니다. 이 방법은 다른 세포 생물학 구조의 분석을 위해 확장 될 수 있습니다 및 프로세스 연루 neurodegeneration, 배치할 puncta (스트레스과 립 및 시 냅 시스 복합물) 같은 막 도약 뿐만으로 구획 (미토 콘 드리 아와 막 밀매 vesicles)입니다. 아직 적응 참조 이미지 분석 및 정량화를 위한 분야에 걸쳐 안정성과 재현성을 촉진 및 궁극적으로 neurodegeneration의 기계적 이해를 향상 시킬 수이 방법을 표준화 하 고, 제공 한다.
서론
신경 퇴행 성 질환에 영향을 미칠 수백만의 사람들이 매년 고 발생률은 노후화 인구1증가 하 고 있다. 각 신경 질환은 독특한 병 인, misfolded 단백질의 집계 및 proteostasis 네트워크의이 질병의 많은 것의 일반적인 병리학 특징입니다. 어떻게 이러한 근본적이 고 상호 프로세스의 중단 awry elucidating 신경 역 기능 및 세포 죽음에 기여 하이 중요 이해 신경 퇴행 성 질환으로 치료 개입을 유도 합니다. 형광 기반 이미징 뉴런에서 이러한 복잡 하 고 동적 프로세스의 조사 가능 하며 신경 세포 생물학의 우리의 이해에 크게 기여 했다. 붙일 태그가 단백질의 분석 실험 실행 된다 vivo에서, 매우 소형 조직, 다양 한 세포 유형 및 형태학이 때에 특히 도전, 이다. 수동으로 보조 정량화 저렴 하 고 간단, 하지만 종종 소모 및 인간의 편견. 따라서, 이미징 연구에서 정량 데이터를 추출, 재현성, 공평 하 고 액세스할 수 있는 방법에 대 한 필요가 있다.
우리의 실험 모델에서 형광 이미징 연구에서 양적 데이터를 추출 피지/ImageJ, 강력 하 고 자유롭게 액세스할 수 있는 이미지 처리 소프트웨어2,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 고려 사항 및 이미지 분석 실험 설계에 대 한 준비
- 미리 적당 한 해부학, 세포, 또는 subcellular 마커 다른 샘플에서 관심 (ROI) 영역에 표준화에 대 한 랜드마크로 서 역할을 예를 들어 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 막 마커, 지역화 된 형광 단백질, 등
- 관심의 구조에 대 한 배경 수준 넘어 개별 puncta 구분 수 형광 마커를 선택 합니다.
참고:이 프로토콜은 최적화 배치할 구조 (예를 들어, misfolded 단백질 집계)와 막 바인딩된 세포 (예를들면, autophagy 기자). 단백질 집계를 시각화 하려면 138 반복 (RFP-hHttQ138)의 병원 성 polyQ로 인간의 Htt 단백질의 N-터미널 RFP 태그 조각이 사용된5이었다. 돌연변이 체 Htt 단백질 세포질 집계 elav GAL45,6등 신경 특정 드라이버에서 표현 하는 때 형성 한다. Autophagosome-리소좀 플럭스를 시각화 하려면 말라 GAL4 편 탠덤 mCherry GFP Atg8a ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
번호, 지역, 및 초파리 광 엽에 붙일 태그가 돌연변이 체 Htt 집계의 강렬의 정량화
Huntington의 질병, RFP 태그 돌연변이 초파리 모델의 중앙 신 경계에 misfolded 단백질 집단을 조사 하는 병 적인 비 (UAS-RFP-hHttQ15) 또는 병 적인 확장 ( 인간의 Htt UAS-RFP-hHttQ138) 막 GFP (UAS-mCD8::GFP)11 팬 신경 드라이버 elav GAL4아래 공동 표현 했다. 여성 파리 일수로 (대) 후 2 일의 머리 해 부, 고정, 고 DAPI 프로토콜의 섹션 2에 따라 물. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 기름 침수 렌즈, 1.30 수 가늠 구멍 (NA), 픽셀 당 8.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
튼튼하게 그리고 reproducibly quantitate 형광 기반 이미징에 의해 시각 세포 생물학 과정을 여기에 설명 된 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 생물 학적 컨텍스트 및 기술적 한계 실험 설계 가이드를 신중 하 게 고려 될 필요가 있다. 관심의 subcellular 구조의 형광 마커 immunohistochemical, 염료 기반, 또는 유전자 표현 배경 형태와 강도 의해 위에 구별 될 필요가 있는지. UAS/GAL4 시스템 널리 초파리에 타겟된 유전자 발현을 운전 하는 데 사용 됩니다. 여기에 제시 된 예제 단백질 집계 및 신 경계에서 autophagy 조사 UAS 증강의 통제 붙일 태그가 단백질의 전사를 활성화 하기 위해 유전자 변형 라인 GAL4 드라이버를 들고 사용. 실험적인 UAS transgene의 동시 식 형광 리포터 transgene 함께 필요한 경우, 다음 컨트롤 그룹 또한 포함 해야 한다 예 GAL4 복용량에 대 한 제어를 하 찮은 transgene의 공동 ov.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 쉴라와 데이비드 Fuente Neuropathic 고통을 연구 프로그램 대학원 친교 (J.M.B.)에 의해 지원, 로이스 교황 생활 휄 로우 프로그램 (카스 티 야, Y.Z., 및 J.M.B.)는 스나이더-로빈슨 재단 Predoctoral 친목 (카스 티 야), 닥터 존 T . 맥도날드 재단 (에 카스 티 야), 계약서, 부여에서 건강 (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018, 및 R56NS095893의 국가 학회 (R.G.Z.), 고 대 산 학자 프로젝트 (산둥 성, 중화 인민 공화국) (R.G.Z.)에 의해.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| SYLGARD(R) 184 실리콘 엘라스토머 키트 | Dow Corning Corporation | PF184250 | 해부 접시 |
| Falcon 35mm TC 처리되지 않음 쉽게 그립 스타일 세균 페트리 접시 | Corning | 351008 | 해부 접시 |
| Dumont #5 집게 | Fine Science Tools | 11251-20 | 해부 도구 |
| 염화나트륨 | Sigma | S3014 | PBS 솔루션 |
| 인산나트륨 이염기성 | Sigma | S5136 | PBS 솔루션 |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS 솔루션 |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | 세척 및 항체 인큐바톤 솔루션. |
| 37% 포름알데히드 | VWR | 10790-710 | 고정 |
| 일회용 마이크로 원심분리기 튜브 (0.5mL, 파란색) | VWR | 89000-022 | 고정, 세척 및 항체 인큐베이션. |
| 플레인 및 프로스트 마이크로 슬라이드 (25× 75mm) | VWR | 48312-004 | 컨포칼 이미징용 |
| 슬라이드 마이크로 커버 안경, 직사각형 (22회; 40mm) | VWR | 48393-172 | 컨포칼 이미징용 슬라이드 |
| 고무 시멘트 | 슬라임 | 1051-A | 마운팅 |
| VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | 마운팅 |
| 스카치 매직 810 인비저블 테이프 (19mm× 25.4m) | 3M Company | 810 | 마운팅 |
| 일반 염소 혈청 | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | 항체 인큐바톤 |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | 핵산 염색. 탈이온수에 용해시켜 5mg/mL 원액을 만들고 -80°C에서 보관합니다. 10-20°C의 작업 농도로 희석합니다. g/mL(PBTx)입니다. |
| 3.5X-90X 스테레오 줌 검사 산업용 현미경 | AmScope | SM-1BNZ | 해부 범위. 6W LED 듀얼 구즈넥 조명기 |
| 장착 ImageJ / Fiji | NIH | v1.51u | SCF_MPI_CBG 플러그인 (버전 1.1.2) |
| FV1000-IX81 컨 포칼 레이저 스캐닝 현미경 | 올림푸스 | ||
| 재조합 구조 | 블루밍턴 초파리 주식 센터 | BL37749 |
참고문헌
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-imag....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
