시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

요약

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

초록

활성 연 접 신경 맨끝에서 시 냅 스 소포 주기를 및 endocytosis를 받 다. 재활용, 하는 동안 SV 막 횡단 단백질의 luminal 도메인 세포 표면에 노출 된다. 이러한 단백질 중 Synaptotagmin-1 (Syt1) 이다. 항 체를 한 번 문화 매체에 추가 하는 Syt1 luminal 도메인에 대 한 감독 엑 소 endocytotic 주기 동안 가져온 것입니다. 이 글귀 SV 재활용의 금액에 비례 하 고 면역 형광을 통해 정해질 수 있다. 여기, 우리가 교양된 hippocampal 신경의 이중 transfection Syt1 항 체 통풍 관 결합. (1) 연 접 사이트 재조합 연 접 마커 Synaptophysin의 식에 따라 지역화, (2) 결정 Syt1 통풍 관을 사용 하 여 그들의 기능 및 (3) 특성화 고 대상으로 우리와 관심, GFP Rogdi 단백질의 효과 수 있습니다.

서론

연 접 속성 변경, 시 냅 스가 소성 또는 시 냅 스 기능의 섭 동에 대응에서 하는 방법 시 냅 스 소포 재활용 공부 하는 것은 결정에 중요 하다. Synaptotagmin-1 (Syt1) 공부 항 체 이해는 SV 재활용의 양을 측정 한 방법을 제공 합니다. Syt1 Ca^{2 +} 센서 역할을 신경 전달 물질^1,2의 exocytotic 출시에 필요한 SV 관련 된 단백질 이다. 그것은 SV 외부 단자 세포질 도메인와 SV³내부 N 맨끝 luminal 도메인 막 횡단 단백질. Exocytosis, 동안 Syt1 luminal 도메인 외부 매체에 노출 된다. 이 외부 매체에 우리 endocytosis 동안 내 면 된다 세포질 도메인에 대하여 지시 하는 항 체를 추가 합니다. 이러한 항 체 중 미리 fluorophores 또는 이차 항 체^4,,56,7immunostained와 함께 활용 될 수 있습니다. 결과....

프로토콜

아니 살아있는 동물 연구를 실시 했다. 안락사 동물 세포 문화 승인 아래 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin 괴팅겐) 현지 동물 보호 당국에 의해 승인 되었다를 포함 하는 실험 번호 T10/30. 실험 승인 프로토콜 실시 했다.

1. 기본 Hippocampal 세포 배양

1. 배아 하루 19^16,17에 쥐 해 마의 천연된 세포 배양을 준비 합니다. 12 m m coverslips polyethyleneimine (페이) 50000-60000 셀/잘의 조밀도에 24-잘 요리 코팅에 셀 접시 챔버 및 단계 대조 광학 계산 셀을 사용 하 여 밀도 확인 합니다.
2. 3 일 동안 (하루 생체 외에서 (DIV) 3) 5% CO₂와 37 ° c 배양 기에서 24-잘 접시에서 뉴런을 문화.
3. 전송 된 가벼운 현미경 검사 법 (예를 들어, 단계 대조 광학 10-20의 확대)를 사용 하 여 셀 건강의 지표에 대 한 coverslips를 평가 합니다. 건강의 다음 지표에 대 한 확인: 명확한 단계 대비 후광, 파란색된 ....

결과

이 접근의 예상된 결과 잘 당 50000 뉴런의 밀도에 coverslip 당 약 50 더블 페 뉴런 찾는 것입니다. 각 신경의 축 삭 붙일 태그 Synaptophysin 축적, 나타내는 클러스터 ofSVs의 여러 핫스팟 표시 예정 이다. 기능적 연 접 사이트에서 재조합 Synaptophysin 신호 punctate Syt1 형광으로 colocalizes. 더블 transfection를 사용 하 여, 관심 (그림 1)의 단백질으로 GFP-Rogdi 또는 mGFP 제어 재조합 Synaptophysin와 공동 표현 이다.

이 실험에서 우리는 SV GFP-Rogdi 또는 mGFP을 표현 하는 신경 세포 연 접 사이트에서 재활용 분석. 경우 컨트롤 단백질, mGFP, 균질 전체 셀에 걸쳐 배포 됩니다 하지만 시 냅 스 .......

토론

정기적으로 재활용 시 냅 스 소포 (SV)를 공부 하는 데 사용 하는 3 개의 분석을 확인 하 고 있습니다. 처음 두의 사용을 포함 한) 형광 styryl FM1-43 (이 막에 통합 하 고 세포로 endocytosis, 동안 채택 exocytosis 후 해제 됩니다); 같은 염료 그리고 b) 붙일 재조합 SV 단백질 (, overexpression, 따라 배치할 재활용 기계에 통합) 태그. 연결 된 fluorophores 그들의 형광은 pH에 따라 변경는 SV의 산 성 내부와 extracellular 매체의 pH 변화를 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 재조합 형 단백질 GFP의 pH에 민감한 변종 태그 Phluorins 라고 합니다. 두 분석 논의 되었습니다 모두 이전^19,20, 그리고 각각의 찬 부 양론 또한 검토²¹되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
B27	Gibco	17504-044
BSA	Sigma	A7030-50g
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306-100g
CoolSNAP HQ2	광도계
dH2O	Invitrogen	15230
DABCO	Merck	8.03456.0100
당나귀 안티 마우스, Alexa 647	Jackson-Immunoresearch	715605151	항체
DMEM	Invitrogen	41966
DPBS,	Gibco	14190
Eppendorf tubes	Eppendorf	30120094
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
tube (50 mL)	Greiner Bio-One
FBS superior	BiochromAG	S0615
Glucose	Merck	1,083,421,000
HBSS	Invitrogen	14170
HEPES	Sigma	H4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)	ThermoElectron Corporation
KCL	Sigma-Aldrich	P9541-500g
L-글루타민	Gibco	25030
MgCl2	Honeywell	M0250-500g
현미경 슬라이드	Fisher Scientific	10144633CF
Microsoft Excel	Microsoft
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
NaCl	BioFroxx	1394KG001
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
Neurobasal	Invitrogen	21103049
OpenView 실험 분석 신청	자유로운 소프트웨어는,		; 이스라엘 공과 대학, 하이파, 이스라엘
PBS (10x)	Roche	11666789001
Optimem	Invitrogen	31985
Penstrep	Gibco	15140-122
PFA	Sigma	P6148-1kg
안전 후드	ThermoElectron		일련 번호 40649111
Sucrose	neoFroxx	1104kg001
Synaptotagmin1	Synaptic Systems	105311	마우스 단클론;클론 604.2
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
Vortex Genius 3	IKA	3340001
수조	GFL	1004
Zeiss Observer. Z1	자이스

, , , , , 227261 Noam E. Ziv, Technion &ndash에 의해 쓰여진 코멘트를 본다