여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.
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이 논문에서
요약
초록
드롭릿 디지털 연쇄 반응 (ddPCR)은 나노 크기의 물에서 기름 개별 반응의 수천에 샘플 분류에 따라 매우 민감한 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법. 최근에, ddPCR는 순환 종양 DNA (ctDNA) 검색에 대 한 가장 정확 하 고 중요 한 도구 중 하나가 되고있다. 표준 ddPCR 기술의 주요 한계 중 하나는 각 가능한 유전자 버전을 인식 하는 특정 가수분해 프로브는 필요 반응, 당 상영 될 수 있는 돌연변이의 제한 수입니다. 다른 방법론, 드롭 오프 ddPCR만 한 쌍의 프로브를 감지 하 여 잠재적으로 모든 유전 변경 대상된 지역에서 계량 하므로 처리량을 증가 합니다. 드롭 오프 ddPCR 단일 반응에서 돌연변이의 더 많은 수를 감지의 장점과 함께 기존의 ddPCR 분석 실험에 유사한 감도 표시 합니다. 그것은 비용 효율적인, 귀중 한 시료를 보존 이며 또한 경우 사용할 수 있습니다 검색 도구로 돌연변이 선험적으로알려져 있지 않습니다.
서론
암 개발에 관련 된 체세포 돌연변이의 수천 보고 된1되었습니다. 이 중, 몇 가지 예측 마커 타겟된 치료 2,3 의 효능 이며 상영이 돌연변이의 유전은 이제 일상적인 임상 연습. 드롭릿 디지털 PCR (ddPCR) 기술은 높은 검색 정확도로 유무의 변이 대 한 모니터링에 사용할 수 고 매우 비 침략 적 액체 biopsies4,5와 호환 합니다. 그러나, 현재 ddPCR 분석 실험은 주로 선험적으로알려진 돌연변이 감지 하도록 설계 되었습니다. 이 심각 하 게 돌연변이 알 수 없는 경우 검색 도구로 ddPCR 사용 하 여를 제한 합니다. 실제로, 기존의 ddPCR 디자인, 야생 형 대립 유전자 (WT 프로브)를 인식 하는 가수분해 프로브 인식 하는 돌연변이 체 대립 유전자 (MUT 프로브) (그림 1A) 특정 조사와 경쟁 한다. 높은 선호도 조사 서식 파일을 hybridizes 하 고 해당 대립 유전자의 성격을 나타내는 그것의 fluorophore를 해제 합니다. 각 작은 물방....
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프로토콜
여기에 제시 된 프로토콜 인 퀴리의 윤리 지침을 따릅니다. 모든 인간의 샘플 동의 연구 인 퀴리에 기관 검토 위원회에 의해 승인 후 등록 환자에서 얻은 했다.
1. 혈액 수집, 플라즈마 저장 및 셀 무료 DNA 추출
참고: 모든 유형의 "조직"에서 추출한 DNA를 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 신선한 또는 포름알데히드 고정 파라핀 (FFPE) 조직, 문화 또는 혈액 샘플 셀 포함). 여기, 우리는 혈, 플라즈마 격리 및 저장 및 세포 없이 DNA (cfDNA) 추출에 대 한 자세한 지침을 제공합니다.
-
혈액 수집 및 플라즈마 스토리지 (그림 2B)
- 7 mL EDTA 튜브에 혈액 샘플을 수집 합니다. 두 개의 튜브 플라즈마의 주위 4 mL를 수집 하는 것이 좋습니다.
- 혈액 무승부 적혈구 (RBC), 백혈구 (WBC)와 플라즈마의 820 x g 3 h 이내에서 10 분 동안 튜브 원심 샘플링은 원심 분리 사이의 시간이 고품질 cfDNA (WBC에서 발표 하는 DNA로 오염 되지즉,
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결과
개념 증명 연구에서 KRA exon 2 돌연변이 (codons 12, 13)와 EGFR exon 19 삭제 FFPE 직물 및 드롭 오프 ddPCR 전략6을 사용 하 여 암 환자에서 혈장 샘플에 조사 되었다.
KRA 이탈 프로브 심문 알려진된 KRA 돌연변이 인간 암11의 95% 이상 항구는 KRA 유전자의 엑손 2에서에서 여러 돌연변이 포괄 16 bp 지역. 참조 조사 이었다 20 길이 위치 3에서 혈압 혈압 하류. 우리의 분석 결과 최적화 하려면 사용 하는 가장 자주 돌연변이 KRA 아미노산의 2를 포함 하는 셀 라인에서 추출한 DNA: G12V (c.35GT, SW480)와 G13.......
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토론
효율적인 감소 ddPCR 분석 결과, 디자인에 최적화는 중요 한, 그리고 프로토콜을 신중 하 게 따라야 합니다. 뇌관 및 프로브 각 조합의 고유 PCR 반응 효율이 있다. 따라서, 개별 분석 결과 신중 하 게 유효성을 검사할 컨트롤 샘플에 귀중 한 테스트 샘플에 사용 되 고 있다. 최적화 및 유효성 검사 증명 피크 신호 검출 및 특이성 및 감도 평가에 중요 하다. 프로토콜에 설명 된 대로 모든 돌연변이 "프로브 2"에 의해 보호 대상 지역에 있는 잠재적으로 심문 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 유효성 검사 것이 좋습니다 "프로브 2", 5' 또는 3' 끝에 있는 돌연변이 때문에 이러한 이탈 분석 결과의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다.
여기에 제시 된 방법 FFPE 직물, 문화 또는 혈액 샘플에 있는 셀을 포함 하 여 "조직"의 모든 종류에서 추출 된 DNA와 함께 수행할 수 있습니다. 그러나, 핵 산 추출의 품질 ddPCR 결과 영향을 크게 수 있습니다. 헤 파 린, 단.......
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공개 사항
몇몇 저자는 ctDNA 검출 관련 2 개의 특허 출원 (EP17305920.5, EP18305277.8)의 발명가 이름이 지정 됩니다.
감사의 글
이 작품은 인 퀴리 SiRIC (그랜트 잉카-DGOS-4654)에 의해 지원 되었다. 저자 또한 비디오에 그녀의 기여에 대 한 캐롤라인 Hego을 감사 하고자 합니다.
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재료
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| Qubit 형광측정기 | Invitrogen | Q33226 | 의 정량을 위한 벤치탑 형광측정기입니다 |
| 186-3003 또는 186-4003, 각각 | 판독기는 각 액적의 형광 강도를 측정하고 액적이 검출기를 통과할 때 크기와 모양을 감지합니다 | ||
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참고문헌
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic C....
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