다 발성 골 수 Xenografts 노 그 쥐에서의 복합 발광 및 양자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 영상

요약

여기 우리가 사용 발광, x 선, 그리고 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 이미징 공부 어떻게 억제 mTOR 활동 영향이 종이 식 모델에서 골 engrafted 발성 종양. 이로써 순수 관련, 비-침략 적, 및 복합 요법 골 engrafted 발성 종양에서 vivo에서대상의 안티 발성 효과의 분석.

초록

다중 골 수 종 (MM) 종양이 골 수 (BM)에 engraft 그리고 그들의 생존 및 진행이이 microenvironment 내 존재 하는 복잡 한 분자 및 세포 상호 작용에 따라 결정 됩니다. 그러나 BM microenvironment 쉽게 복제 생체 외에서잠재적으로 많은 생체 외에서 그리고 vivo 전 실험 모델의 생리 적인 관련성을 제한 될 수 없습니다. 이러한 문제는 luciferase (루크)의 종이 식 모델을 이용 하 여 극복 될 수 있다-transfected 8226 m M 세포 특히 마우스 뼈대에 engraft 것입니다. 이러한 마우스 적절 한 기판 주어진, D-소, 종양 성장 및 생존에 치료의 효과 종양 비보를 제작한 (BLI) 발광 이미지에 변화를 측정 하 여 분석할 수 있습니다. 이 씨 데이터 결합 2 대사 마커를 사용 하 여 양자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 (PET/CT) 분석-의하여-2-(¹⁸F) 불 화-D-포도 당 (¹⁸F FDG)은 시간이 지남에 종양 물질 대사에 변화를 모니터링 하는 데 사용 됩니다. 이러한 이미징 플랫폼 종양/BM microenvironment 내의 여러 비 침 투 적인 측정을 허용 한다.

서론

MM 악성 플라스마 B 세포는 BM을 침투 하 고 뼈 파괴, 빈 혈, 신장 손상, 그리고 감염을 일으킬의 구성 하는 불 치의 질환입니다. MM 모든 혈액 악성 종양¹ 의 10%-15%를 만들고 뼈대²를 포함 하는 가장 빈번한 암 이다. MM의 개발은 결국 BM³귀환 하기 전에 림프 조직의 어린 싹 센터에 설정 되는 긴 플라즈마 세포의 종양 전이에서 유래한 다. 매우 이질적인 틈새;는 BM 특징 이다 다양 하 고 중요 한 세포 구성 요소, 낮은 포₂ (hypoxia), 광범위 한 vascularization, 복잡 한 세포 외 매트릭스, 그리고 모두의 m M tumorgenesis⁴기여할 cytokine과 성장 인자 네트워크의 영역을 포함 하 여. 따라서, 엄격 하 게는 BM에 engrafted 종양 특징 전파 MM이 종이 식 모델의 개발 m M 병리학 vivo에서^5,6공부를 매우 강력 하 고 임상 관련 도구 것입니다. 그러나, 수많은 기술적 장애물 적용 하기 어렵고 비용이 많이 드는 그들을 만드는 대부분의 종이 식 모델의 효과 제한할 수 있습니다. 이 능력을 직접 관찰 하 고 필요 없이 종양 성장/생존의 변화를 측정에 일관 되 고 재현 가능한 종양 engraftment BM 틈새 시장 내에서 종양 개발, 연장된 시간 제한과 관련 된 문제를 포함 실험^7,8과정 쥐를 희생.

이 프로토콜 사용 하 여 Miyakawa 그 외 여러분 에 의해 처음 개발 된 수정된이 종이 식 모델 ⁹, myeloma 세포는 정 맥 (IV) 도전 결과 "전파" 지속적으로 그리고 reproducibly BM의 NOD/SCID/IL-2γ(null) (노 그) 쥐¹⁰에 engraft 종양. 이 종양의 위치에 시각화 뤽 대립 유전자와 8226 인간의 MM 셀 라인의 안정 되어 있는 transfection에 의해 달성 하 고 이러한 engrafted 종양 세포⁶제작한 직렬로 씨에서 변화를 측정. 중요 한 것은,이 모델은 특히 노 그 쥐의 골격에 engraft 비슷한 성향을 가진 다양 한 다른 뤽 표현 인간의 MM 셀 라인 (예를 들어, U266 및 OPM2)를 활용 하 확장할 수 있습니다. 쥐의 발광 영상으로 종양의 식별 애완/코네티컷 함께 하 여 (예: ¹⁸F FDG) radiopharmaceutical 프로브의 이해를 측정 하 여 다음 수 있습니다 중요 한 추가 특성에 대 한 생화학 경로 (즉, 물질 대사, hypoxia, 변화 및 apoptosis 유도 변경) 종양/BM microenvironment 내. 이 모델의 주요 장점 다양 한 방사선, 발광 및 형광 프로브 및 m M 진행 및 병리학 비보를 공부 하는 데 사용할 수 있는 표시의 가용성에 의해 강조 될 수 있다.

프로토콜

아래 설명 하는 모든 동물 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 큰 로스 앤젤레스 VA 의료 시스템에 의해 승인 하 고 살 균과 병원 체 없는 조건 하에서 수행 되었다.

1. 8226 셀 Luciferase 표현 (8226-루크)의 준비

1. 8226, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 95% 공기와 5% 이산화탄소 (CO₂)를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 1% 페니실린 스 보충 RPMI 1640 매체에 인간의 MM 셀 라인을 유지 합니다.
2. 안정적인 뤽 표현 기자 8226 세포 생성 transfecting 1 x 10⁶ 8226 셀 hygromycin (100-350 mg/mL)와 선택 이전 다음 luciferase 기자 벡터와 설명⁶.
3. 표준 조건 하에서 무 균 자란 2-3 주 동안 매일, 안정적 transfected 8226 셀 라인의 설립을 생성 될 때까지 매체를 변경 셀을 유지 합니다.
4. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 1 x 10⁶ 페 셀/100 µ L에서 생체 외에서 luciferase 활동 luciferase 기판, D-소를 추가 하 여 확인 (150 µ g/mL 작업 솔루션 prewarmed 문화 매체에서), 측정 하는 테스트 튜브 또는 96 잘 접시 루미 노⁶을 사용 하 여 셀의 생물 발광.

2. Orthotopic이 종이 식 모델

1. 적절 한 동물 보호 시설에서 살 균/병원 체-무료 조건 노 그 마우스 (4-6 주 오래 된, 남성 또는 여성)을 유지 합니다.
2. 실험 당일 노 그 쥐 (5 ~ 10⁶ 셀/마우스 x)로 IV 주입 8226 루크 페 셀을 준비 합니다. 3 세포를 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS에 x, 고 PBS의 5 x 10⁶ 셀/200 µ L의 최종 농도에 그들을 (마이너스 항생제와 FBS) 얼음 처럼 차가운 PBS에 resuspend) 멸 균 시험관에. 얼음에 세포를 유지 하 고 최대한 빨리 (30-120 분) 내에서 마우스를 도전.
3. Anesthetize (isoflurane, 0.5-1 L/min에 공기에 1%-3%)와 마우스와 향함을 멀리 머리와 생리대에 부정사 위치에 동물을 배치. 발가락을 곤란 하 게 하 여 anesthetization의 수준을 확인 합니다. 눈에 눈 연 고를 적용 합니다.
4. 1 mL 인슐린 주사기 26 G 바늘을 사용 하 여 꼬리 정 맥 (200 µ L/분사) 통해 쥐로 8226 뤽 셀을 주입.
   참고: 열 램프는 꼬리, 그로 인하여 혈관을 dilating 하 고 주사의 효능을 증가 하 고 따뜻하게 사용할 수 있습니다.
5. 그들의 가정 케이지를 동물을 그들은 완전히 복구 될 때까지 동물을 모니터링.
6. 8226-뤽 셀 마우스 뼈대에 engraftment 라스 마 취 쥐 (아래 설명 및 그림 1A에 표시)를 측정 하 여 확인 합니다.
   참고: 수확된 뼈 (그림 1C) immunohistochemistry 또는 cytometry (그림 1B)를 사용 하 여 인간의 CD45 식 BM exudates 또한 스테인드 수 있습니다.

3. 씨에서 Vivo에서 의 측정

참고: 일반적으로, 마우스에 engrafted 종양에서 측정 씨 10-20 일 postchallenge, 사이 처음 관찰 될 수 있다 하지만이 실험적으로 결정 될 필요가 있습니다.

1. Anesthetize (isoflurane, 0.5-1 L/min에 공기에 1%-3%)와 마우스 하 고 발가락을 곤란 하 게 하 여 anesthetization의 수준을 확인 합니다. 그 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
2. 동물의 IP 주사 (200 µ L/주입)에 게 "vivo에서-학년" D 소 기판 (30mg/mL 멸 균 식 염 수에 희석).
3. 측정 소 기판의 주입 (비록 씨 활동 최대 45-60 분 동안 쥐에서 관찰 될 수 있습니다) 다음 5-10 분, 내 씨, 마 취 동물 작은 동물 이미징 시스템 (그림 2에서에서 부정사 위치에 배치 하 여 ). 발광 및 x 선 분석을 선택 하 고 이미지 (그림 3).
   1. 이미징 소프트웨어 (그림 4)를 사용 하 여 관심사 (ROIs)의 선택한 영역에서 평균 빛 (광자/s/cm²/steradian)를 측정 합니다.
   2. 동물의 홈 케이지를 반환 하 고 (약 15-20 분)를 완은 때까지 그것을 모니터링.

4. 타겟된 치료와 쥐의 치료

1. 기준 씨를 측정 하 고 동물 치료 그룹 (4-8 마우스/그룹)으로 무작위.
2. IP 주사 (200 µ L/사출) temsirolimus (0.2-40 mg/kg 마우스)의 나머지는 추가 5 매일 주사¹¹의 2 일 다음 5 일일 IP 주사 처방을 사용 하 여의 쥐를 취급 합니다.
3. Luciferase 활동 (광자/s/cm²/steradian) 측정 / 주 섹션 3에 음모는 씨의 시간에 따른 변경 설명 하는 대로 2 배. 종양에 변화 씨 쥐 (그림 5B)의 직렬 이미지로 제시하실 수 있습니다.
   참고: 것이 좋습니다 그들은 (일반적으로 초기의 45-60 일) 내에서 다음과 같은 현상이 현재까지 그를 수행 매일 동물의 모니터링: 무게 손실 (이식 전에 무게를 기준으로 10%의 손실) 및 뒷 다리 사지 마비, 어떤 시간에 그들은 한다 안락사 된다 자 궁 경관 탈 구 다음 공동₂ 챔버를 사용 하 여

5. PET/CT 분석 ¹⁸를 사용 하 여 측정 F FDG 종양 물질 대사에 변화

1. ¹⁸F FDG의 초과 일반적인 이해를 피하기 위해 실험 전에 24 h에 대 한 그들의 음식을 제거 하 여 그들의 집에 감 금 소에 있는 동물을 빨리.
2. 실험 당일 ¹⁸FDG 애완 동물 F 방사선 조사 (50-100 µCi/멸 균 식 염 수에 주입)을 준비 합니다. 복용량 교정기와 시간과 ¹⁸F FDG 탐사선의 활동을 기록 합니다.
   참고: ¹⁸F는 상대적으로 짧은 반감기 (~ 2 h) 있기 때문에, 주의 깊은 준비 및이 프로브를 사용 하 여 계획 해야 합니다 설립.
3. Anesthetize (isoflurane, 0.5-1 L/min에 공기에 1%-3%)와 동물 그리고 향함을 멀리 머리와 생리대에 부정사 위치에 놓습니다. 발가락을 곤란 하 게 하 여 anesthetization의 수준을 확인 합니다. 그 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
4. 차폐 1 mL 인슐린 주사기 26 G 바늘을 사용 하 여 꼬리 정 (100 µ L/분사) 통해 프로브 주사.
   참고: 열 램프는 꼬리, 그로 인하여 혈관을 dilating 하 고 주사의 효능을 증가 하 고 따뜻하게 사용할 수 있습니다.
5. 바늘/주사기 복용량 캘 리브레이 터에 있는 잔여 방사능을 측정 하 고 활동와 시간.
   참고: 마우스 인큐베이션, 복용량, 및 타이밍의 표준화 데이터 재현성 및 comparability를 위해 필수적입니다.
6. 마 취 및 프로브 통풍 관 (~ 45-90 분)의 전체 기간 동안가 열 패드를 사용 하 여 37 ° C에서 생쥐를 유지 합니다.
   참고: 쥐 무부하 및 프로브의 일반적인 이해를 피하기 위해 37 ° C에서 유지 중요 하다.
7. 쥐에서 비슷한 라벨 시간 되도록 약 20-30 분 간격으로 발생 하도록 ¹⁸F FDG 프로브 주사를 엇갈리게 설정 합니다.
   참고: 적절 한 워크플로 고 프로브 주사의 타이밍 최적의 재현성 이미징 조건에서 발생 합니다.
8. PET/CT 작은 동물 이미징 시스템에서 선택된 영역에 engrafted 종양 (그림 6)에 해당 하는 관심의 ¹⁸F FDG 활동을 측정 합니다.
   참고: 처음 10 분 정적 애완 동물 노출 및 2 분 CT 노출은 좋지만 정확한 노출 시간 실험적으로 결정 될 필요가 있습니다.
9. 자신의 집 새에 동물을 반환 하 고 완전히 복구 될 때까지 그들을 모니터링 합니다. 배경 레벨을 프로브 자연 붕괴 하면서 24 h에 대 한 전용 반환 방에 쥐를 집.
   참고: ¹⁸F의 짧은 반감기 때문에 여러 측정 신선한 프로브를 사용 하 여 만들 수 있습니다 주당 2 배 만큼 자주.

결과

초기 파일럿 연구에서 끄 덕/SCID 쥐로 IV 주사 8226 뤽 셀의 개발 하지 않았다 BM engrafted MM 종양, 편평 MM 종양은 쉽게 형성 (100% 성공률) 비록. 반면, 노 그 쥐로 8226 셀 4 과제 생성 (15-25 일) 이내 종양에 해골 (간 또는 비장 등 비 골격 조직에만 거의 형성된 종양). 골격에 종양 실제로 동물을 검사 하 여 시각적으로 확인 수 없습니다, 이후 다른 방법 성공적인 종양 engraftment BM (그림 1) 내에서 종양의 위치를 확인 하 고 간주 했다. Miyakawa 그 외 여러분 에 의해 보고서와 마찬가지로 ⁹, 인간의 IgG, 8226 세포에 의해 생산 ELISA (데이터 표시 되지 않음)를 사용 하 여 도전된 노 그 쥐의 혈 청에서 검출 될 수 있지만 이러한 데이터만 engraftment 하지 위치 또는...

토론

M M^6,9,11,,1213의 전 임상이 종이 식 모델의 다양 한에 불구 하 고 BM microenvironment 내 종양/BM 상호 작용을 공부 하는 능력 유지 곤란 ¹⁴. 여기서 설명 8226 루크 노 그 쥐의 골격에 종양 세포의 신속 하 고 재현성 engraftment 허용.

이 프로토콜의 중요 한 단계 참여 luciferase 표현 MM 셀 라인의 설립 및 체 외에서luciferase¹⁵의 안정적인 식의 확인. 일단 셀 라인 설립 되어, 노 그 쥐 IV 주입에 의해 도전 되 고 뼈대...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
8226 인간 골수종 세포주	ATCC	CCL-155
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG)	Jackson Labs	5557
VivoGlo Luciferin substrate	Promega	P1041
Hypoxyprobe-1Kit	HPL	HP1-100
PE-CD45 (clone H130)	BD Biosciences	555483	에서 human CD45+ tumor cells 를 확인하기 위한 유세포 분석에 사용됩니다
	기술	70527	절제 뼈의 면역 조직 화학에 사용되는 1 차 항체
염소 안티 토끼 IgG (HRP 접합)	ABCAM	ab205718	절제 뼈의 면역 조직 화학에 사용되는 Seconday 항체
이중 루시 페라 아제 리포터 분석 시스템	Promega	E1910
pGL4.5 루시 페라 아제 리포터 벡터	Promega	E1310
IVIS 루미나 XRMS In Vivo 이미징 시스템	Perkin Elmer
Sofie G8 PET/CT 이미징 시스템	Perkin Elmer